细胞衰老与凋亡

细胞衰老与凋亡第一节细胞衰老一、Hayflick界限：细胞，至少是培养的细胞，不是不死的，而是有一定的寿命；它们的脂质能力不是无限的，而是有一定的界限衰老是细胞本身决定的还是由于培养环境的恶化？以间期有无巴氏小体作为供体细胞的标记，将取自老年男性个体的细胞和取自年轻女性个体的细胞进行单独和混合培养，并统计其倍增次数。结果：混合培养中的两类细胞的倍增次数与各自单独培养时相同。

说明决定细胞衰老的因素在细胞内部。进一步实验发现是细胞核而不是细胞质决定了细胞衰老二、细胞在体内条件下的衰老近交系小鼠皮肤移植实验结论：引起小鼠皮肤细胞在体内衰老的主要是体内环境。更新组织：如上皮细胞、血细胞。构成更新组织的细胞可分为３类：①干细胞、②过渡细胞、③成熟细胞。稳定组织：可补偿性增生，如：肝、肾细胞。恒久组织：细胞不再分裂，如神经细胞。可耗尽组织：如人类的卵巢实质细胞三、细胞衰老的特征（一）细胞核的变化核增大最明显的变化是核膜内折另一个重要变化是染色质固缩【与染色质蛋白的二硫键有关】核仁裂解为小体（二）内质网的变化（三）线粒体的变化粗面内质网的总量减少，排列无序线粒体的数量随年龄增大而减少，体积随年龄增大而增大在培养的人成纤维细胞中有两种线粒体：Ⅰ型固缩紧密；Ⅱ型大而稀疏（五）膜系统的变化（四）致密体的生成衰老细胞中常见的一种结构，绝大多数动物细胞在衰老是都会有致密体的积累其他名称：脂褐质【通常产生自发荧光，是自由基诱发的脂质过氧化作用的产物】、老年色素、血褐质、黄色素、透明蜡体及残体等等来源：溶酶体【多数。单层膜，有阳性磷酸酶反应】或线粒体【少数】转化年轻的功能齐全的细胞的膜相是典型的液晶相衰老的或有缺陷的膜通常处于凝胶相或固相【磷脂的脂肪酸尾不能自由移动】细胞衰老时，细胞间间隙连接及膜内颗粒的分布也发生变化P面膜内颗粒明显减少，E面颗粒相对增加，但总颗粒数变化不显著细胞间间隙连接减少分子水平的变化1.

DNA：复制与转录受阻，端粒DNA、mtDNA缺失。DNA氧化、断裂、缺失和交联，甲基化程度降低。2.

RNA：含量减少。3.

蛋白质：含成下降，发生修饰、交联。4.

酶分子：物理与化学特征改变，酶失活。5.

脂类：不饱和脂肪酸被氧化。三、细胞衰老的分子机理（一）氧化损伤学说观点：代谢中产生的活性氧基团或分子（ROS）引发的氧化性损伤的积累，最终导致衰老。ROS主要有三种类型：1.超氧自由基；2.羟自由基；3.过氧化氢内源性自由基产生于①由线粒体呼吸链电子泄漏产生；②由氧化酶（如MFO）催化底物羟化产生来源：外源性（如辐射）、内源性。自由基可引起DNA、蛋白质、脂类氧化、变性和交联，实验表明DNA中OH8dG随着年龄而增加。正常细胞内存在清除自由基的防御系统。酶系统：SOD、CAT、GSH-PX。非酶系统：维生素E、醌类电子受体Orr和Sohal（1994），将SOD基因导入果蝇，其寿命比野生型延长1/3。（二）端粒学说端粒酶：是一种核糖核蛋白酶，由RNA和蛋白质组成。端粒酶RNA是合成端粒DNA的模板，而端粒酶的反转录酶亚基则催化端粒DNA的合成有丝分裂钟学说【Harley】：随着细胞的每次分裂，端粒不断缩短；当端粒长度缩短达到一个阈值时，细胞就进入衰老Wright等的证据细胞衰老指标：β半乳糖苷酶活性（三）rDNA与衰老（四）沉默信息调节蛋白复合物与衰老（五）SGS1基因、WRN基因与衰老适用于哺乳类中由分裂细胞组成的组织酵母中发现通过同源重组产生的第一份环状rDNA片段会澎冲而出，成为染色体外rDNA环【ERC】，随细胞分裂不断进行，ERC不断复制增加，到一定程度，细胞衰老类型：简称Sir复合物，包括Sir1、Sir2、Sir3、Sir4。分布：通常存在于异染色质中。一方面与RAP1和组蛋白H3/H4结合；一方面附在核基质上。酵母中，Sir复合物通常存在于端粒及性别决定有关的HML和HMR位点上功能：阻止它们所在位点的DNA转录。酵母中发现一种sgs1突变体【SGS1基因缺陷或丧失】，寿命短于野生型。该基因编码的蛋白质属于RecQ亚族的DNA解旋酶。集中在核仁。核仁若缺少该蛋白就会裂解。Werner综合症【引发早老的疾病】：WRN基因与SGS1基因同源，编码的蛋白质具有7个DNA解旋酶所特有的标志序列，位于核仁。Werner'ssyndromeA37yearsoldpatient，AdoueDFP1997Hutchinson-Gilfordsyndrome（六）发育程序与衰老（七）线粒体DNA与衰老线虫在发育过程中遇到不良环境，引起性外激素浓度的变化，结果幼虫就进入一种特殊的称为dauer幼虫阶段，可延续6个月之久。全身被以厚的角质层，口紧闭，处于休眠状态。两类相关基因，称为daf基因。【第一类：daf2和ade1基因；第二类：daf16基因】daf2基因编码类胰岛素受体；age1编码磷脂酰肌醇-3-激酶的p110催化亚基；daf16编码一种转录活化剂【不良环境时表达】第二节细胞凋亡二、细胞凋亡的意义：对于多细胞生物个体发育的正常进行，自稳平衡的保持以及抵御外界各种因素的干扰方面都起着非常关键的作用一、细胞凋亡的概念：是一个主动的由基因决定的自动结束生命的过程。也称细胞编程性死亡（PCD）细胞凋亡的失调包括不恰当的激活和抑制会导致疾病，如Alzheimer氏病、各种肿瘤、艾滋病以及自身免疫病三、细胞凋亡的形态学和生物化学特征（一）细胞凋亡与细胞坏死二者的主要区别：细胞凋亡过程中，细胞膜反折，包裹断裂的染色质片段或细胞器，然后逐步分离，形成众多的凋亡小体，凋亡小体被邻近的细胞所吞噬，整个过程细胞膜的整合性良好，细胞内容物不会逸散到胞外环境，因而不引发炎症反应。细胞坏死时，细胞膜发生渗漏，细胞内容物释放，引起炎症反应。细胞坏死：细胞受到环境因素伤害，引起细胞死亡的现象。细胞坏死初期，胞质内线粒体和内质网肿胀、崩解，结构脂滴游离、空泡化，蛋白质颗粒增多，核发生固缩或断裂。随坏死进程，细胞质呈强嗜酸性，苏木精/伊红染色呈均一红色。细胞膜不完整，台盼蓝染色阳性(活细胞不着色)。DNA随机降解，细胞内容物流出，引起炎症。形态变化的原因：酶性消化、蛋白变性。如消化酶来源于死亡细胞本身的溶酶体，则称为自溶；若来源于浸润坏死组织内白细胞溶酶体，则为异溶。细胞凋亡①细胞通过出芽的方式形成许多凋亡小体；②凋亡小体内有结构完整的细胞器；③不引起炎症；④线粒体无明显形态变化，溶酶体活性不增加；⑤内切酶活化，DNA有控降解，凝胶电泳图呈梯状；⑥凋亡通常是生理性变化，坏死是病理性变化。（二）细胞凋亡的形态学特征三个阶段：1.凋亡的起始：细胞表面特化结构消失，细胞间接触消失；细胞膜依然完整，有选择透过性；细胞质中，线粒体大体完整，但核糖体逐渐从内质网上脱离，内质网膨胀，并逐渐与质膜融合；染色质固缩，形成新月形帽状结构，沿核膜分布2.凋亡小体的形成：染色质断裂为大小不等的片段，与某些细胞器一起聚集，为反折的细胞膜所包围。细胞表面产生许多泡状或芽状突起，后逐渐分隔，形成当凋亡小体3.凋亡小体逐渐被邻近的细胞所吞噬并消化（三）细胞凋亡的生化特征1.DNA发生核小体间的断裂，结果产生含有不同数量核小体单位的片段，在琼脂糖凝胶电泳时，形成特征性的梯状条带【鉴定细胞凋亡的最可靠方法】。催化DNA降解的是依赖Ca2+/Mg2+的核酸内切酶【Zn2+抑制其活性】2.tTG（组织转谷氨酰胺酶，依赖钙离子）的积累并达到较高水平【tTG催化某些蛋白的翻译后修饰，主要通过建立谷氨酰胺和赖氨酸之间的交联以及多胺掺入蛋白质而实现，导致蛋白质聚合】/胸腺细胞正常凋亡胸腺细胞正常凋亡（四）诱导细胞凋亡的因子物理因子化学及生物因子（五）细胞凋亡的检测基于凋亡细胞的形态学和生物化学特征，特别是DNA的断裂1.形态学观测：DAPI【与DNA结合的荧光染料】染色，可观察到细胞核的形态变化Giemsa染色可以观察到染色质固缩、趋边、凋亡小体的形成透视和扫描电镜观察凋亡细胞细胞核的形态、结构变化吖啶橙（AO）和溴乙锭（EB）复染【AO只进入活细胞，正常细胞核及处于凋亡早期的细胞核呈绿色；EB只能进入死细胞，染成橙红色】2.DNA电泳梯状条带3.TUNEL测定法【DNA断裂的原位末端标记法】4.彗星电泳法【快速简便】原理：将单个细胞悬浮于琼脂糖凝胶中，经裂解处理后，再在电场中短时间电泳，并用荧光染料染色，凋亡细胞中形成的DNA降解片段，泳动速度快，使细胞核呈现出一种彗星式图案5.流式细胞分析原理：根据凋亡细胞DNA断裂和丢失，采用碘化丙锭使DNA产生激发荧光后检测细胞程序性死亡细胞程序性死亡（PCD）是一种基因指导的细胞自我消亡方式。PCD和细胞凋亡的区别在以下方面：PCD是功能性概念，凋亡是形态学概念。PCD的最终结果是凋亡，但凋亡并非都是程序化的。PCD存在于胚胎发育过程中。四、细胞凋亡的分子机理1.capase家族分布：胞质溶胶中是半胱氨酸蛋白酶重要共同点：特异性断开天冬氨酸残基后的肽键Capase的研究源于线虫细胞程序化死亡的研究控制线虫PCD的基因有：Ced-3、Ced-4和Ced-9。

Ced-3和Ced-4诱发凋亡；Ced-9抑制Ced-3、Ced-4的作用哺乳类细胞中存在Ced3的同源物ICE，它催化白介素1β的活化Apopain催化PERP【聚（ADP核糖）聚合酶】裂解，导致细胞凋亡。Apopain被称为“死亡酶”，PERP为“死亡底物”Ced4的哺乳类同源物为Apaf-1【一种细胞凋亡蛋白酶活化因子】Ced9的哺乳类对应物为Bcl-2Apaf-1凋亡酶激活因子-1（apoptoticproteaseactivatingfactor-1），线虫的同源物为ced-4。作用：参与线粒体凋亡途径，该基因敲除后，小鼠神经细胞过多，脑畸形发育。Apaf-1与cytc、ATP/dATP结合后，召集caspase-9，形成凋亡体（apoptosome），激活caspase-3，启动caspase级联反应。bcl-2基因家族含有1-4个Bcl-2同源结构域（BH1-4）。分两类：抗凋亡基因，如：Bcl-2；促凋亡基因，如：Bax。促凋亡蛋白能引起线粒体外膜通透性改变，导致cytc释放，引起凋亡。bcl-2相当于线虫的ced9。主要定位于线粒体膜、也存在于ER和外核膜，拮抗促凋亡蛋白的功能。Fas

fas又称作APO-1，属TNF受体家族。1993年人白细胞分型国际会议统一命名为CD95。fas基因编码产物为分子量45KD的跨膜蛋白。Fas蛋白与Fas配体组成Fas系统，二者的结合激活caspase。P53基因组的守护者。辐射诱导的DNA损伤可通过ATM激活p53，阻断细胞周期，并提高Fas的表达，诱导凋亡。Myc转录因子，生长因子存在，Bcl-2基因表达时，促进细胞增殖，反之引起细胞凋亡。ATM是DNA损伤检验的重要蛋白激酶，能激活P53。2.Capase的活化细胞中合成的Capase以无活性的酶原状态存在凋亡起始者Capase2,8,9,10凋亡执行者Capase3,6,7起始者活化执行者Cap