2021年《化妆品微生物标准检验方法》

一、（2021.03.07Principle1范围本规范规定了化妆品微生学检验总则。本规范适用于化妆品样品采集、保存、供检样品制备。2仪和设备天。高灭菌器。振器。三瓶。玻珠。玻棒。刻吸管。研。均器。2.10恒水浴箱。2.11采用具：不锈钢勺，剪刀，开罐器等。3培基和试生盐水成分：氯化钠蒸馏水加至mL溶解后，分装到加玻璃珠三角瓶内，每瓶，103.43kPa(15lb)20min高灭菌。SCDLP液培养基成分：酪白胨大豆蛋白胨氯化钠5g磷酸氢二钾葡萄糖卵磷脂1g吐温7g蒸馏水制法：先将卵磷脂在少量馏水中加温溶解后，再与其它成分混合，加热溶解，调pH为7.3分，高压灭菌。注意振荡，使沉于底层的吐温80充分混合，冷却至25左使用。注：如无酪蛋白胨和大豆白胨，也可用多胨代替。灭液体石。

*阳光明*编3.4灭吐温。4样的采集注意事项

所采集的样，应具有代表性，一般视每批化妆品数量大，随机抽取相应数量的包装位。检验时，应分别从两个包装单位以上的样品中共取10mL包装量小的品，采样量应适量增加，其总量应大于16g。供检验样品应严格保持原有的包装状态，进口产品应为售包装。容器不应有破裂，检验前不得打开，防止样品被污染。接到样品后应立即登记，编写检验序号，并按检验要求快检验。如不能及时检验，品应放在室温阴凉干燥处，不要冷藏或冷冻。若只有一份品而同时需做多种分析，如微生物、毒理、学等，应先做微生物检验，将剩余样品做其它分析。在检验过程，从打开包装到全部检验操作结束，均须防微生物的再污染和扩散，所采样用具、器皿及材料均应事先灭菌，全部操作应在无菌室内进，或在相应条件下，按无菌操作规定进行。5供样品的备液样品5.1.1溶性的液体样品，量取10mL到灭生理盐水中混匀后，制成1:10检。5.1.2油液体样品，取样品10mL，加菌液体石蜡混匀，再加10mL灭菌的吐温，在℃～44℃水浴振荡混合10min加入灭菌的生理盐水在40℃44水浴中预温)，在40～44水浴中乳化，制成的悬。膏霜、乳半固体状样品5.2.1水性的样品，称取10g加到装有玻璃珠及灭菌生理盐水的三角瓶中，充分振混匀，静置。取其上清液作为的检液。5.2.2水性样品，称取10g放到灭菌的研钵中，加10mL灭液体石蜡，研磨成粘稠状，加入10mL灭吐温，磨待溶解后，加灭生理盐水，在40～44水中充分混合，制成检液。固样，称取10g加灭生盐水中，充分振荡混匀，使其分散混悬，静后，取上清液作为1:10的液。如有均质器，上述水溶性、霜、粉剂等，可称10g样加灭菌生理盐水，均质～2min疏水性膏、霜及眉笔、口红等，称10g样，加灭液体石蜡灭吐80灭生理盐水，均质～5min二、菌落总数Count1范*阳光明*编

*阳光明*编本规范规定了化妆品中菌总数的检验方法。本规范适用于化妆品菌落数的测定。2定本规范采用下列定义菌落总数(aerobicbacterialcount)指化妆品检样经过处理，在一定条件下培养后(如养基成分、培养度、培养时间、pH值需氧性质等，1g(1mL)中所含菌落的总数。得结果只包括一群本方法规定的条件下生的嗜中温的需氧性菌落总数。测定菌落总数便于判明样被细菌污染的程度，是对样品进行卫生学总评价的综合依据。3仪和设备三瓶。量。或精密pH试。高灭茵器试。平：径9cm刻吸管：、2mL1mL酒灯。恒培养箱。3.10放镜。4培基和试剂生盐水见总则中。卵脂、温80营养琼脂培养基4.2.1成：蛋白胨牛肉膏氯化钠琼脂卵磷脂

3g5g15g1g吐温7g蒸馏水4.2.2制：先将卵磷脂加到少量蒸水中，加热溶解，加入吐温80，其他成分(琼脂外加到其余的蒸馏水中，溶解加入已溶解的卵磷脂、吐温80，匀调为7.1～加入琼脂，103.43kPa(15lb)20min高灭菌，存于冷暗处备用。0.5%化苯氮terazoliumchloride,TTC)成分：TTC蒸馏水100mL溶解后过滤，高压灭菌，装于棕色试瓶，置4℃箱用。5操步骤用菌吸管取1:10稀的检液2mL别注入到两个灭菌平*阳光明*编

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皿内，每皿1mL另注到灭生理盐水试管中(注意勿使吸管接触液面更换一支吸管，并充分混匀，制成1:100检液。吸取2mL分别注入到两个灭菌平皿内，每皿1mL。样含菌量高，还可再稀释成1:1000，…等，每种稀释度应换1支吸管。将化冷至45℃℃卵脂温营养脂培养基倾注到平皿内，每皿约15mL即转动平皿，使样品与培养基充分混合均匀，待琼脂凝固后翻转平皿，置℃养内养。另取一个不加样品的灭菌平皿，加入约15mL卵脂吐温营琼脂培养基，待琼脂凝固，翻转平皿，置37培养箱内培养48h为白对照。为便于区别妆品中的颗粒与菌落，可在每100mL卵脂吐温80营琼脂中加入1mL0.5%溶液，如有细存在，培养后菌落呈红色，而化妆品的粒颜色无变化。6菌计数方先用肉眼观察，点数菌落，然后再用放大510倍放大镜检查，以防遗漏。记下各皿的菌落数后，求出同一稀释度各平皿生长的平均菌落数。若平中有连成片状的菌落或花点样菌落蔓延生长时，该平皿不宜计数若片状菌落不到平皿中的一半，而其余一半中菌落数分布又很均，则可将此半个平皿菌落计数后乘以，以代表全皿落数。7菌计数及告方法首选平均菌落数在30个之间的平皿，作为菌落总数测定的范围。当只有一个释度的平均菌落数符合此范围时，即以该平皿菌落数乘其稀释倍见表例。若两稀释度，其平均菌落数均在30个间，则求出两菌落总数之比值来决，若其比值小于或等于，报其平均数，若大于2报告其中稀度较低的平皿的菌落(表例2及例。若有释度的平均菌落数均大于300个，则应按稀释最高的平均菌落数乘以稀释倍报告(表1中。若有稀释的平均菌落数均小于个则按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数告(表例。若有释度的平均菌落数均不在30个间，其中一个稀释度大于个，相邻的另一稀释度小于30时，则以接近30或300平均菌落数乘以稀释倍数报之(表1中6)。若有稀释度均无菌生长，报告数为每g或mL小10CFU菌计数的告，菌落数在10以时，按实有数值报告之，大于100时采二位有效数字，在二位有效数字后面的数值应以四舍五入法计算。为了缩数字后面零的个数，可用10的数来表示表1报方栏)。报告菌落数为“不计，应注明样*阳光明*编

*阳光明*编品的稀释度。

表落计结果及报告方式例次

不同稀释度平均菌落数

两稀释度

菌落总数

报告方式1

10-110-210-3136516420

菌数之比

CFU/mL或CFU/mL或CFU/gCFU/g1640016000或1.610423

2760295461.62890271602.2

3800038000或1042710027000或2.71044567

不可计465051327115不可计30512000

513000510000或5.1105270270或2.71023050031000或3.1104＜１10＜10＊CFU菌形成位。三、粪大肠菌群1范本规范规定了化妆品中粪肠菌群的检验方法。本规范适用于化妆品中粪肠菌群的检验。

定义本规范采用下列定义粪大肠菌群(coliforms)一群需氧及兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌，在44.5℃养24h发酵乳糖酸并产气。该菌来自人和温血动物粪，是重要的卫生指示菌。3仪恒水浴箱隔水式恒温箱：44℃±0.5温计。显镜。载片。接环。电。三瓶。试。小管。3.10pH或试。3.11高灭茵器。3.12刻吸管：10mL2mL。3.13平。4培基和试双乳糖胆盐培养基成分：白胨猪胆盐乳糖

40g10g10g溴酚水溶液*阳光明*编

*阳光明*编蒸馏水

制法：将蛋白胨、胆盐及糖溶解于蒸馏水中，调pH7.4加入溴酚紫水溶液5mL混，分装试(支试管中加一个小倒管)68.95kPa(10灭。伊美兰EMB)脂成分：白胨乳糖磷酸氢二钾琼脂

10g10g2g20g伊红水溶液20mL美水液蒸馏水

制法：先将琼脂加到蒸水中，加热溶，然后加入磷酸氢二、蛋，混，之解。以水补足。正为7.2，装于三角瓶内，103.43kPa(15lb)15min高压灭菌备用。临用时加入乳糖并加热融琼脂。冷至60左无菌操作加入灭菌的红美蓝溶液，摇匀。倾注平皿备用。蛋胨水(靛基质试验用)成分：白胨(胰白)20g氯化钠蒸馏水

5g制法：将上述成分加热融，调pH值7.0～7.2分装小试管，高灭菌。靛质试剂柯凡克试剂：将5g对甲氨基苯甲醛溶解于75mL戊中然缓慢加入浓盐酸试验方法：接种细菌于蛋胨水中，于℃养。沿壁加柯凡克试剂0.30.5mL轻摇试管。阳性者于试剂层显玫瑰红色。注：蛋白胨应含有丰富的氨酸，每批蛋白胨买来后，应先用已知菌种鉴定后方可使用。革氏染色：4.5.1染制备4.5.1.1结紫染色：结晶紫95%醇

1g草酸铵水溶液80mL将结晶紫溶于乙醇中，然与草酸铵溶液混合。4.5.1.2革氏碘液碘碘化钾

1g2g*阳光明*编

*阳光明*编蒸馏水加至

300mL

将碘与碘化钾先进行混合加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至。4.5.1.3脱液：95%醇4.5.1.4复液：沙黄复染液：沙黄95%醇蒸馏水

将沙黄溶解于乙醇中，然用蒸馏水稀释。稀碳酸复红液：称取碱性红10g研细，加乙醇，放置过夜，滤纸过滤。取该液10mL加5%碳酸水溶液混，为石碳酸复红液。再取此液10mL加90mL即为稀石碳酸复红液。4.5.2染法4.5.2.1将涂片在火上固定，滴加结晶紫染色液，染，洗。4.5.2.2滴革兰氏液，作用1min水。4.5.2.3滴乙脱色，约30s或将乙醇滴满整个涂片，立倾去，再用乙醇滴满整个片，脱色10s水洗。4.5.2.4滴复染液复染，水洗，待干，镜检。4.5.3染结果革兰氏阳性菌呈紫色，革氏阴性菌呈红色。注：如用1:10释石碳酸复红染色液作复，复染时间仅需10s。5操步骤取10mL1:10稀的检液，加到10mL倍浓的乳糖胆盐培养基中，置℃±0.5℃培箱中培养24h48h如产也产，则报告为粪大肠菌群阴性如产酸产气划线接种到伊红美蓝琼脂平板上，置℃养18h24h同取该培养2滴接种到蛋白胨水中，置44±0.5℃养。经培养后，在上述平板上察有无典型菌落生长。粪大肠菌群在伊红美蓝琼脂培养基上的型菌落呈深紫黑色，圆形，边缘整齐，表面光滑湿润，常具有金光泽。也有的呈紫黑色，不带或略带金属光泽，或粉紫色，中心深的菌落，亦常为粪大肠菌群，应注意挑选。挑上述可菌落，涂片作革兰氏染色镜检。蛋白胨水养液中，加入靛基质试剂约0.5mL，察靛基质反应。阳性者液面呈玫瑰色；阴性反应液面呈试剂本色。6检结果报根据发酵乳糖产酸产气，板上有典型菌落，并经证实为革兰氏阴性短杆菌，靛基质试阳性，则可报告被检样品中检出粪大肠*阳光明*编

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菌群。四、绿脓杆菌Aeruginosa1范本规范规定了化妆品中绿杆菌的检验方法。本规范适用于化妆品中绿杆菌的检验。

定义本规范采用下列定义。绿脓杆菌于假单胞菌属，为革氏阴性杆菌，氧化酶阳性，能生绿脓菌素。此外还能液化明胶，还原硝酸盐为亚硝酸盐，在42条件下能生长。该菌对人有致病力，可使处化脓，引起败血症等。3仪恒培养箱37℃℃三瓶。试。平。刻吸管：、、。显镜。载片。接针、接环。电。3.10高灭茵器。4培基和试SCDLP液培养基见总则中。十烷基三基溴化铵培养基成分：肉膏蛋白胨10g氯化钠十六烷基三甲基溴化铵琼脂20g蒸馏水制法：除琼脂外，将上述分混合加热溶解，调为7.47.6加琼脂，68.95kPa(10灭后，制成平板用。乙胺培养成分：酰胺10g氯化钠无水磷酸氢二钾无水磷酸二氢钾硫酸镁酚红（溶）*阳光明*编

*阳光明*编琼脂20g蒸馏水

制法：除琼脂和酚红外，其它成分加到蒸馏水中，加热溶解，调pH为7.2加入琼脂、酚红，103.43kPa(15lb)20min高压灭菌后，制成平板备用。绿菌素测用培养基成分：白胨氯化镁1.4g硫酸钾10g琼脂甘油化学纯)10g蒸馏水制法：将蛋白胨、氯化镁硫酸钾加到蒸馏水中，加温使其溶解，调至7.4，入琼脂和甘油，加热解，分装于试管内，68.95kPa(10压灭菌后，制成斜面备用。明培养基成分：肉膏3g蛋白胨明胶蒸馏水制法：取各成分加到蒸馏中浸泡20min时搅拌加温使之溶解，调pH至分装于试管内，经68.95kPa(10lb)20min灭菌后，直立制成高层备用。硝盐蛋白水培养基成分：白胨酵母浸膏硝酸钾亚硝酸钠0.5g蒸馏水制法：将蛋白胨和酵母浸加到蒸馏水中，加热使之溶解，调为，过滤后补足液量，加入硝酸钾和亚硝酸钠，溶混匀，分装到加有小倒管的管中，lb)20min菌后备用。普琼脂斜培养基成分：白胨牛肉膏3g氯化钠琼脂蒸馏水制法：除琼脂外，将其余分溶解于蒸馏水中，调pH为～7.4加琼脂，加热溶，分装试管，103.43kPa(15lb)20min高灭菌后，制成斜面备用。*阳光明*编

5操步骤

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增培：取1:10样稀释液加液培养基中，置37培～24h如有绿脓杆菌生长，培养液表面多有一层薄菌膜，培养液呈黄绿色或蓝绿色。分离培养：培养液的薄膜处挑取培养物，划线接种在十烷基三甲基溴化铵琼脂平板，置℃养～。脓杆菌在此培养基上，其菌落扁无定型，向周边扩散或略有蔓延，表面湿润，菌落呈灰白色，菌周围培养基常扩散有水溶性色素，此培养基选择性强，大肠艾希菌不能生长，革兰氏阳性菌生长较差。在缺乏十六烷基三甲基溴铵培养基时也可用乙酰胺培养基进行分离，将菌液划线接种于板上，放℃24h，脓杆菌在此培养基上生长良好，菌落平，边缘不整，菌落周围培养基略带粉红色，其它菌不生长。染色镜检：取可疑的菌落，涂片，革兰氏染色，镜检为兰氏阴性者应进行氧化酶试。氧化酶试验取一小块洁净的白色滤纸片放在灭菌平皿内用无菌玻璃棒挑取绿脓杆菌疑菌落涂在滤纸片上，然后在其上滴加一滴新配制的1%甲对苯二试液，在～30s之，出现粉红色或紫红色时，为氧化试验阳性；若培养物不变色，为氧化酶试验阴性。绿菌素试：取可疑菌落2～3个分别接种在绿脓菌素测定培养基上，置℃养24h加入氯仿～5mL充振荡使培养物中的绿脓菌素溶解于仿液内，待氯仿提取液呈蓝色时，用吸管将氯仿移到另一试管中加入1mol/L的酸1mL左右，振荡后，静置片刻。如上层盐液内出现粉红色到紫红色时为阳性，表示被检物中有绿脓菌素存。硝酸盐还原气试验：挑取可疑的绿脓杆菌纯培养物，接在硝酸盐蛋白胨水培养基中置37℃养，观察结果。凡在硝酸盐蛋白胨水培养基内的小管中有气体者，即为阳性，表明该菌能还原硝酸盐，并将亚硝酸分解产生氮气。明胶液化试，取绿脓杆菌可疑菌落的纯培养物，穿刺接在明胶培养基内，置37培养，出放冰箱10min30min如仍呈溶解状时即为明胶液试验阳性；如凝固不溶者为阴性。42℃长验挑可的绿脓杆菌纯培养物，接种在普通琼脂斜面培养基上，放在～℃箱中，培养～，脓杆菌能生长，为阳性，而似的荧光假单胞菌则不能生长。6检结果报被检样品经增菌分离培养，在分离平板上有典型或可疑菌落生长，经证实为革兰氏阴性菌，氧化酶及绿脓菌素试验皆为阳性者，即可报告被检样品中出绿脓杆菌；如绿脓菌素试验阴性而液化明胶、硝酸盐还原产气℃试验三者皆为阳性时，仍可报告被检样品中检出绿脓杆。*阳光明*编

*阳光明*编五、金黄色葡萄球菌Aureus

1范本规范规定了化妆品中金金色葡萄球菌的检验方法。本规范适用于化妆品中金色葡萄球菌的检验。

定义本规范采用下列定义金黄色葡萄球菌aureus)为革兰氏阳性球菌，呈萄状排列，无芽胞，无荚，能分解甘露醇，血浆凝固酶阳性。该菌是葡萄球菌中对人类病力最强的一种，能引起人体局部化脓性病灶，严重时可导败血症。3仪和设备显镜。恒培养箱离机。刻吸管：1mL5mL。试。载片。酒灯。4培基和试SCDLP液培养基见总则中。4.2

Baird氏养基成分：胰白胨牛肉膏酵母浸膏1g丙酮酸钠甘氨酸12g氯化锂琼脂20g蒸馏水7.0±0.2增菌剂的配制：30%黄水除菌过滤的1%碲钾溶液混，保存于冰箱内。制法：将各成分加到蒸水中，加热煮沸完全溶解，校正pH分装每瓶95mL高灭菌。用时加热溶化琼脂培养基，每加预至℃卵亚碲酸增菌剂5mL摇匀后制成平板。培养基应致密不透明的。使用前在冰箱贮存不得超过48h血脂培养基成分：营琼脂100mL脱纤维羊血(兔血10mL*阳光明*编

4.*阳光明*编4.制法：将营养琼脂加热融，待冷至℃右菌操作加入脱纤维羊血，摇匀，制成平，置冰箱内备用。甘醇发酵培养基成分：蛋胨氯化钠甘露醇10g牛肉膏5g麝草蓝溶液12mL蒸馏水制法：将白、氯化、牛肉膏加到蒸馏水中，加热溶解，调pH7.4，入甘露醇和指示剂混匀后分装试管中，68.95kPa(10lb)20min菌备用。兔人)浆制备取3.8%柠酸钠溶，高压灭菌，1加兔人)血4份，匀静置；～3000离～5min血下，上面血浆。无菌液体石蜡。5操步骤增菌：取1:10稀的品10mL接到SCDLP体培养基中，置37培养箱，培养。分离：自述增菌培养液中，取～接种环，划线接种在BairdParker平，如无此培养基也划线接种到血琼脂平板，置37培养～。血琼脂平板上菌落呈金黄色，大而突，圆形，不透明，表面光滑，围有溶血圈。在Baird板上为圆形，光滑，凸起，湿润直径为～，色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为混浊带，在其外层有一透明带。用接种针接触菌落似有奶油树胶软度。偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落，但无混浊带及透明带挑取单个菌落分纯在血琼脂平板上，置37培养。染色镜检：取分纯菌落，涂片，进行革兰氏染色，镜检金黄色葡萄球菌为革兰氏阳菌，排列成葡萄状，无芽胞，无夹膜，致病性葡萄球菌，菌体较，直径约为0.5μm1μm露醇发试验：取上述分纯菌落接种到甘露醇发酵培养中，在培养基液面上加入2mm3mm的菌液体石蜡，置37℃养24h金黄色葡萄球菌应能发酵甘露醇产酸。血凝酶试验：吸取新血0.5mL放入灭菌试管中，加入待检菌24h汤培养物0.5mL。匀，放℃温或恒温水浴中，每半小时观察次之如呈现凝块即为阳性。同时以已知血浆凝固酶阳性和性菌株肉汤培养物及肉汤培养基各0.5mL分别加入灭菌1:4血0.5mL混匀，作为对照。6检结果报经增菌培养后，在分离平上有典型或可疑菌