第一章植物组织培养

PlantTissueCulture

植物组织培养2014年9月3日同学们好！

Welcometomyclass！Service01Service02Service03组培专业选修课学时：36学分：2课程简介植物组织培养是一门生物科学领域的核心技术，主要内容：理论篇：基本概念、基本原理、基本方法和技术；应用篇：在农业、林业、工业和医药行业等方面的的应用方法和技术。课程内容定义（Definition）：

狭义：主要指对植物组织及培养产生的愈伤组织进行培养。广义：植物组织培养相关技术的总称，包括器官培养，细胞培养和原生质体培养等。一、植物组织培养的定义植物组织培养的概念1.外植体（explants）：从活体植物体上切取下来,进行培养的那部分组织或器官叫做外植体

。2.无菌:（asepsis）：指没有活菌的意思。防止菌类进入人体或其他物品的操作技术，称为无菌操作。组培技术常指快速繁殖技术，又称植物克隆。

植物组织培养的优越性材料来源单一，遗传特性一致成本低，效率高环境条件可控生长快，周期短，可重复性强可连续生产，利于自动化控制世界范围组培苗产量GrowthStartJump现在19911985年

全世界组培苗产量1.3亿株

已超过10亿株

世界范围内组培苗5.1亿株目前全球有关生物技术产业的年交易额约为1500亿美元,其中50%~60%与农业有关。植物组培苗的贸易额约占总额的10%,即150亿美元,并以每年15%速度递增。手指玫瑰超大型烟草的抢救性克隆繁育一、植物组织培养的理论基础细胞全能性学说

脱分化和再分化理论组培植物的生长发育器官发生途径

41231.细胞全能性学说植物体的每一个具有完整细胞核的细胞都具有该物种全部遗传的物质，在一定条件下具有发育成完整植物体的潜在能力。脱分化（dedifferentiation)：将已分化的不分裂的静止细胞，放在培养基上培养后，细胞重新进入分裂状态。一个成熟的细胞转变为分生状态的过程叫脱分化。

再分化（redifferentiation):经脱分化的组织或细胞在一定的培养条件下可转变为各种不同的细胞类型，形成完整植株的过程。2.植物细胞全能性的表达一个细胞一旦沿着某一条特定的途径分化发育后，一般不会再回复到未分化状态，但在组织培养条件下，可能发生脱分化和再分化。离体的植物器官、组织、细胞脱分化愈伤组织再分化根芽再生植株3.组培植物的生长发育4.组织培养植株再生的途径魔芋胚状体1）体细胞胚胎发生途径（胚状体发生途径）

：是指在组织培养中起源于一个非合子细胞，经过胚胎发生和胚胎发育过程（经过原胚、球形胚、心形胚、鱼雷胚和子叶胚5个时期）。胚状体发生途径外植体脱分化愈伤组织胚状体再生植株再分化脱分化2）器官发生途径：

由愈伤组织或外植体诱导形成不定根或不定芽，再获得再生植株的方法。百合鳞叶培养外植体器官发生途径愈伤组织芽分化再生苗小麦愈伤组织器官发生途径外植体愈伤组织芽根再生植株脱分化再分化高生长素(1,2-D)高(生长素/细胞分裂素)低(生长素/细胞分裂素)器官发生途径胡萝卜离体根愈伤组织（callus）在人工培养基上由外植体上形成的一团无序生长状态的薄壁细胞。叶诱导愈伤组织二、植物组织培养的类型根据培养对象分类植株培养胚胎培养器官培养组织培养细胞培养原生质体培养烟草的器官培养按培养基物理状态分为:

1.固体培养

2.液体培养按培养过程分为:1.初代培养2.继代培养固体培养液体培养三、植物组织培养的发展简史探索阶段（1838-1929年）：细胞学说的提出奠基阶段（1930-1950）：培养基和激素迅速发展阶段（1960-至今）：植物改良1.探索阶段（1838-1929年）Haberlandt：观点：贡献：提出细胞全能性小野芝麻、凤眼兰的栅栏细胞和虎眼万年青属表皮细胞无分裂细胞高度分化+培养基中无生长激素首次进行离体细胞培养高等植物的组织和器官可以分割成单个细胞Knop+蔗糖《关于单离植物细胞培养实验》我愿意指出：在我的培养实验中，虽然经常观察到细胞的明显生长，但从未观察到细胞分裂。发现单细胞培养的条件，将是未来培养试验的难题。在未来，人们可以成功地从营养细胞培养出人工胚。1904年：Hanning胚培养：培养萝卜和辣根菜的胚，得到植株1922年：Knudson采用胚培养法获得兰花幼苗，克服其种子发芽困难的问题。1925年：Laibach亚麻种间杂交幼胚培养得到杂种其它研究玉米成熟胚的培养2.奠基阶段（1930-1950年）1934年：White番茄根建立第一个植物无性系。 当根2厘米长－切成0.5-1厘米切断，无菌液体培养－完全相同的离体根－根离体培养真正成功;1934年：高特里特（Gautheret）在研究山毛柳和黑杨等形成层的组织培养实验中，提出了B族维生素和生长素对组织培养的重要意义;1939年：White由烟草种间杂种的瘤组织,诺比考特（Nobecourt）由胡萝卜均建立了与上述类似的连续生长的组织培养物。1937年：White发现3种B族维生素和IAA对植物生长有用组织培养的奠基人1943年：White植物组织培养手册《AHandbookofPlantTissueCulture》，标志组织培养成为一门新兴学科。1946年：罗士韦在菟丝子茎尖培养地观察到花的形成，为试管受精奠定了基础。1948年：斯库克(Skoog)和崔徵在烟草茎切段和髓培养以及器官形成的研究中发现，发现腺嘌呤或腺苷可解除生长素对芽生长的抑制作用，腺嘌呤/生长素高，生芽；低，生根；相等，不分化。从而明确了腺嘌呤与生长素的比例是控制芽和根形成的主要条件之一。1952-1953年：美国植物学家斯图尔德（Steward）等人，用胡萝卜根韧皮部的细胞进行培养，得到了完整植株，并且这一植株能够开花结实，首次证实了Haberlandt在五十多年前关于细胞全能性的预言；1952年：莫雷尔（Morel）和马丁（Martin）通过茎尖分生组织的离体培养，从已受病毒侵染的大丽花中首次获得无病毒植株；1954年：Muir将烟草愈伤组织置于固体培养基上，在其上放一片滤纸，再在滤纸片上放上一个烟草体细胞，单细胞培养成功。1956年：Miller分离出Kinetin(KT)激动素,不久即知道激动素可以代替腺嘌呤促进发芽，并且效果可增加3万倍。3.迅速发展阶段1960年以来组织培养理论、实践、技术和方法不断完善和发展，形成独具特色的专业技术。在实验技术上建立了较完整的实验程序，已成为一种重要和精细的实验技术。组织培养已广泛应用于生物学的许多分支学科，并取得丰硕的成果。3.1原生质体培养1960年：科金Cocking——开创植物原生质体培养和体细胞杂交研究工作（用真菌纤维素酶从番茄幼根分离得到活性原生质体）1971年，日本

takebe和Nagata首次利用烟草叶片分离原生质体并获得再生植株。我国获得了30个以上品种的原生质体再生植株，其中包括难度较大的重要粮食作物和经济作物大豆、水稻、玉米、小麦、谷子、高梁、大麦、棉花、油莱、马铃薯等1972年，美国Carlson诱导粉蓝烟草和郎氏烟草的原生质体融合得到种间体细胞杂种－第一株体细胞杂种。1978年，有性杂交不亲和的番茄/马铃薯间的体细胞杂交获得了杂种植株(Melchers)。随后获得了地上结番茄，地下生马铃薯的杂种植物。1985年，马铃薯的栽培品种与野生种的体细胞杂交，得到了抗晚疫病和卷叶病的体细胞杂种(Austin)。3.2细胞融合与体细胞杂交萝卜--白菜萝卜-甘蓝

避免受精后胚乳发育不良或因种胚与胚乳间不亲和而致使杂种胚夭折，及时分离幼胚接种在无激素培养基上使之直接成苗，这就是胚挽救。大大提高远缘杂交的成功率:印度科学家在裁培种菜豆、黄麻和花生的远缘杂交中获得了理想的重组体。中国农科院蔬菜所培养结球甘蓝和大白菜的杂种胚得到了种间杂种。3.3胚胎培养和试管内传粉受精技术近50年来飞速的发展。从400多种植物培养细胞中分离到600多种次级代谢产物，其中60多种在含量上超过或等于其原植物，20种以上干重超过1％。在日本，人参细胞培养已达130600L发酵罐；德国用1000L发酵罐培养毛地黄细胞；利用培养细胞的生物转化能力生产高值化合物，德国科学家进行了出色的研究。他们在毛地黄细胞的培养中加入生物合成途径的中间化合物毛地黄毒素和一甲基毛地黄毒素，培养细胞以几乎100％的转化速率使之羟基化，变为医药强心剂地高辛。3.4组织及细胞培养生产有用物质1964年印度Guha和Maheshwari成功地在毛叶曼陀罗花药培养中，由花粉诱导得到单倍体植株，从而促进了花药和花粉培养的研究；以后相继在烟草、水稻、小麦、玉米、番茄、辣椒、草莓、苹果等多种植物培养中获得成功，其数目达到160多种，其中烟草、水稻和小麦等的花药育种培养在中国取得了引入注目的成就。花药培养：中花8号水稻、京花1号小麦。3.5单倍体育种3.6体细胞无性系变异：

我国已经培育出抗白叶枯病及赖氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、丝氨酸和酪氨酸含量高于亲本系的水稻变异体。3.7突变体诱导和筛选

细胞突变体的筛选最早始于1959年，Melchers在金鱼草悬浮细胞培养中获得了温度突变体。四、植物组织培养的应用快速繁殖种苗脱毒远源杂交转基因育种种质资源的保存人工种子60年代，法国的Morel用茎尖培养的方法大量繁殖兰花获得成功。植物快速繁殖技术、试管苗工厂化生产和无病毒种苗生产技术在70年代得到了快速的发展。美国、法国、意大利、荷兰等欧美国家试管苗的年产量均在数千万株以上，并且以每年7％-8％的速度增加。

我国快速繁殖和无病毒种苗生产的研究始于70年代，到“七五”期间研究成果开始向应用转化并大见成效。马铃薯无毒种薯和甘蔗种苗已在生产上大面积种植。植物快速繁殖技术兰花：“崇兰生涧底，香气满幽林”，故又有“空谷佳人”之称。

植物组织培养在技术上的发展研究材料范围逐步扩大培养方法逐步完善培养基不断改进实验手段逐步完备胚、胚轴、子叶、幼苗、茎尖、根、叶等；动物细胞+植物细胞/微生物原生质体固体培养发展到液体振荡或旋转培养悬浮培养、液滴培养、双层培养、包埋培养White培养基、MS培养基、N6培养基等中