4-保健食品功效成分检测技术与方法

保健食品功效成分检测技术与方法提纲一．保健食品的检验有关要求二．保健食品理化检验及常用的分析方法介绍三．保健食品功效成分的检测四．保健食品功效成分检测其它有关问题一、保健食品的检验有关要求1、检验依据2、检验要求1、主要检验依据保健食品管理办法（1996年卫生部46令）保健食品注册管理办法卫生部健康相关产品检验机构认定与管理办法（卫法监发［1999］第76号）卫生部发布的与保健食品相关的文件保健食品通用卫生要求（1996年）保健（功能）食品通用标准（GB16740）保健食品检验与评价技术规范（2003年版）食品国标GB/T5009——2003企业标准2、检验要求保健食品检验机构CDC系统药检系统检验要求1.保健食品应具有与产品配方和申报的保健功能相适应的功效成分或特征成分，申报时须检测配方中主要原料所含的功效成分或特征成分。检验要求保健食品评审专家委员会可根据产品的具体配的项目。检验机构受理保健食品检测时，申报单位应提供该产品的配方、工艺及企业标准等相关资料。保健食品的功效成分检测工作应在SFDA部原来认定的检测机构进行。检验要求功效成分或指标性成分、含量及其检验方法根据产品及原料确定，应与申报的功能有一定的关系功效成分或指标性成分、含量及其检验方法应分别列出依据以下二方面确定产品的功效成分（或标志性成分）并说明理由与申报保健功能有关的功效成分代表产品特性的标志性成分按标准（规范）规定的检测方法检测无标准检测方法的，应用比较权威的检测方法，并标明方法的出处无相关检测方法的，申请人应提供详细的检测方法和方法学研究及验证少5批加样回收率等内容及验证报告检验要求的检测方法应根据其产品适用的方法学范围选择以下进行测定：国家标准行业标准国际上权威分析方法检验要求1.在没有相应的标准方法时，企业应建立自己的企业标准。自主开发研究的分析方法，申报单位需向检测机构提供方法学研究的相关资料。检验要求质量标准质量标准中文文本编写格式须符合GB／T1.1－2000则的规定内容须包括资料性概述要素（封面、目次、前言）、规范性一般要素（产品名称、范围、规范性引用文件）、规范性技术要素（技术要求、试验方法、检验规则、标志、包装、运输、储存、规范性附录）以及质量标准编写说明附录中列出检验方法和原料的质量标准质量标准（续）功效成分标示范围，具体标示方法一般性功效成分（或标志性成分）多糖、膳食纤维等功效成分（或标志性成分）需要限定范围的，可按指标值±x%定范围，如总蒽醌、芦荟苷等。X值依据研制产品的检测资料确定折算成每日摄入量不得大于允许摄入量营养素补充剂中维生素类按指标值的0.8-1.8按指标值的0.75-1.25倍确定其指标范围质量标准编制说明中应详细提供功效成分（或标志性成分）依据及理由二、保健食品理化检验及常用的分析方法介绍1、保健食品常见的检验项目2、保健食品检验常用的分析方法1、保健食品常见的检验项目感官指标（性状）水分灰分净含量与负偏差崩解时限微生物限度重金属（Pb、As、Hg）农药残留量（六六六、滴滴涕）功效成分其它感官检查法物理检查法化学分析法物理化学分析法感官检查法主要依靠人的感觉器官，即视觉、嗅觉、进行卫生学评价时具有重要的意义。物理检查法折光率等，用以判定物质的纯度。不溶性固形物物。化学分析法定性分析化学反应的颜色、沉淀定量分析重量分析挥发法、萃取法、沉淀法容量分析法物理化学分析法比色和分光光度法原子吸收分光光度法荧光分析法原子荧光光谱法电位分析法层析法气相色谱法高效液相色谱法物理化学分析法IRHPCEHPLC-MS/MSGC-MS/MSICP-MS三、保健食品功效成分的检测（一）、保健食品原料（二）、保健食品功效成分类别和相应检测指标（三）、保健食品功效成分检测方法（四）、保健食品分析方法的建立和析方法学验证（五）、实例分析（一）、 保健食品原料普通食品植物类（中草药）动物类真菌类益生菌类核酸类新资源食品营养素其他（三）保健食品类别和功效成分检测指标1、增强免疫力功能多糖（灵芝、虫草、香菇等）、腺苷、氨基酸、人参皂苷类、花粉、党参、黄芪、伏苓、枸杞、人参、阿胶、大枣、灵芝、灵芝孢子粉、桑葚、西洋参、螺旋藻、冬虫夏草、蜂王浆、铁皮石斛、蜂胶、牛初乳、杜仲、银耳、牛膝等2、辅助降血脂功能黄酮类、鱼油（EPA、DHA、DPA）、亚麻酸、亚油酸、茶多酚、苦荞粉、钝顶螺旋藻、决明子、维生素E、银杏叶、荷叶、月见草油、沙棘油、红曲制剂、甲壳素、植物甾醇、γ-谷维素等保健食品类别和功效成分检测指标3、辅助降血糖功能苦瓜总苷、三价铬、多糖类、黄酮类、红曲、三七、葛根、泽泻、田七、何首乌、黄芪、黄精、人参、乌梅、知母、生地、决明子、山药、山楂、红花、甘山梨酸糖醇、异麦芽糖醇、乳糖醇、蜂胶、桑叶、D-甘露、糖醇、百合4、抗氧化功能茶多酚、黄酮类、维生素C、硒保健食品类别和功效成分检测指标5、辅助改善记忆功能EPA、DHA、DPA、Ve、磷脂、牛磺酸6、缓解视疲劳功能B-胡萝卜素、叶黄素、维生素类7、促进排铅功能N-葡萄糖基L-半胱氨酸、谷胱甘肽、牛初乳粉、珍珠粉、维生素C、葡萄糖酸锌、酪蛋白磷酸肽、牛磺酸、木糖醇8、清咽功能金银花、胖大海青果、冰片、薄荷脑9、辅助降血压功能黄酮类保健食品类别和功效成分检测指标10、改善睡眠功能褪黑素、松果体素、低聚糖11、促进泌乳功能12、缓解体力疲劳功能人参、西洋参皂苷类、多糖类、维生素类、淫羊藿苷13、提高缺氧耐受力功能角鲨烯、维生素E、角鲨烯、沙棘籽油、枸杞子、黄精、冬虫夏草、螺旋澡、胶股蓝、茶多酚、珍珠粉、牛初乳、党参、红景天、马鹿葺、川芎、当归、刺五加、灵芝、黄芪、三七、银杏叶、红花保健食品类别和功效成分检测指标14、对辐射危害有辅助保护功能红景天、茶多酚、维生素C、当归、蜂胶、原花青素、灵芝、银耳、维生素E、螺旋藻、壳聚糖、枸杞、银杏叶、女贞子、黄芪、香菇、番茄红素、刺五加、β-胡萝卜素等15、减肥功能决明子、芦荟、黄芪、山楂、番泻叶、黄酮、肉碱、大黄酸、茶多酚、荷叶等保健食品类别和功效成分检测指标16、改善生长发育功能钙、锌、Vd、Vb6等17、增加骨密度功能钙、牛磺酸、Vd、Vc18、改善营养性贫血功能Fe，芦荟19、对化学性肝损伤有辅助保护功能黄酮、多糖保健食品类别和功效成分检测指标20、祛痤疮功能栀子、丹皮、银花、薄荷、芦荟、野菊花21、祛黄褐斑功能芦荟、山药、茯苓、薏米22、改善皮肤水份功能23、改善皮肤油份功能保健食品类别和功效成分检测指标24、调节肠道菌群功能益生菌、低聚糖类25、促进消化功能(成人和儿童)山楂、麦芽、鸡内金、山药、党参、莱服子、扁微晶纤维素、膳食纤维、低聚半乳糖、大豆低聚糖保健食品类别和功效成分检测指标26、通便功能制何首乌、火麻仁、决明子、枳实、莱菔子、桃仁、百合、玉竹、阿胶、芦荟、黄芪、膳食纤维、大豆膳食纤维、低聚果糖、低聚半乳糖、大豆低聚糖、螺旋藻、橘皮、蜂蜜、山楂、几丁聚糖、番泻叶、罗汉果、大黄、甘桑椹、乳酸菌、决明子胶、瓜尔豆胶、阿拉伯胶27、对胃黏膜损伤有辅助保护功能部分常见保健食品原料为主的产品指标检测项目产品类型营养素补充剂五加科参类

检测项目产品中标识的营养素(包括维生素和矿物质)皂甙蕈类（灵芝、蘑菇等） 膳食纤维冬虫夏草菌丝体红景天类

腺苷红景天甙部分常见保健食品原料为主的产品指标检测项目芦荟类大蒜类螺旋藻类茶叶类魔芋类

芦荟甙大蒜素蛋白质、胡萝卜素、维生素B1、维生素B2茶多酚膳食纤维部分常见保健食品原料为主的产品指标检测项目纤维素类磷脂类（原料）红曲类

膳食纤维丙酮不溶物、乙醚不溶物等洛伐它丁脂肪酸、维生素E脂肪酸部分常见保健食品原料为主的产品指标检测项目初乳类蛇、蝎等

免疫球蛋白锰、蛋白质蚓激酶（溶纤酶）、蛋白质蛋白质、氨基酸角鲨烯蜂皇浆

产品指标检测项目角鲨烯10-羟基癸烯酸甲壳质产品褪黑素产品

总黄酮脱乙酰度，产品如为复方应检测原料的脱乙酰度蛋白质、氨基酸褪黑素产品原料（褪黑素）需提供原料纯度证明并检测（三）保健食品功效成分检测方法保健食品中红景天甙的测定保健食品中大蒜素的测定保健食品中芦荟甙的测定保健食品中脱氢表雄甾酮（DHEA）的测定保健食品中吡啶甲酸铬的测定酰胺和咖啡因的测定保健食品功效成分检测方法保健食品中肌醇的测定保健食品中肉碱的测定保健食品中α-亚麻酸、γ-亚麻酸的测定保健食品中免疫球蛋白IgG的测定保健食品中人参皂甙的高效液相色谱测定保健食品中原花青素的测定保健食品功效成分检测方法保健食品中核苷酸的测定保健食品中洛伐他丁的测定保健食品中中药功效成分的鉴别方法保健食品中银杏叶总黄酮的高效液相色谱测定聚糖的测定保健食品中金雀异黄素的测定保健食品功效成分检测方法保健食品中茶氨酸的高效液相色谱测定素和乙素的高效液相色谱测定保健食品中腺苷的测定保健食品中褪黑素的测定保健食品功效成分检测方法保健食品中总皂甙的测定保健食品中总黄酮的测定壳聚糖的游离氨基测定及脱乙酰度的计算蚓激酶活性的测定红曲产品中桔青霉素的测定（四）保健食品分析方法的建立和析方法学验证分析方法的选择分析方法学验证的内容·分析方法建立实例分析分析方法的选择根据分析对象的性质选择准确、可靠的方法数选择可以满足分析需要的分析方法分析方法的实用性，方法应简便易行，样品前同时测定成本低、所用试剂和材料不特殊、种类少、稳定性高、环保、毒性小等。方法要经过验证和评价分析方法学验证的内容精密度准确度灵敏度检测限检测上限定量限方法的适用范围最佳测定范围选择性和专属性耐用性不确定度评估精密度(precision)度。精密度反映了随机误差的大小。常用标准差（S）或相对标准偏差（RSD）表示。平行性（replicability）相同分析方法、样品、实验室、分析人员、分析设备、分析时间重复性（repeatability）相同分析方法、样品、实验室，但分析人员、分析设备、分析时间中至少有一项不同再现性（reproducibility）相同分析方法、样品，但实验室，分析人员、分析设备、分析时间均不同精密度平行性重复性再现性备注方法√√√样品√√√地点√√×人员√√××时间√√××分散设备√√××浓度水平333样品（n）999室内室间准确度（accuracy）是用一个特定的分析程序所获得的分符合程度的度量。机误差的综合指标。决定分析结果的可靠程度准确度的评价方法

X1-X0P（%）=————×100MP——加入的标准物质的回收率M——加入标准物质的量1——加入标准样品的测定值0——未知样品的测定值用回收率评价准确度需注意事项不同浓度水平，加入量与样品浓度相近（80%、100%、120%），不能超过方法的线性范围，加标量不得超过待测物含量的3倍。与其它组分的关系不同。选定与被测样品相似的标准参考物更加可靠。样品中某些组分对被测成分产生的干扰（负），有时很难靠回收率实验发现。如果可能，用不同方法比较。灵敏度（sensitivity）一个方法的灵敏度是指该方法对单位线的斜率（k）用于度量灵敏度。A=kc+a检测限（limitofdetection,LOD）指对某一特定的分析方法在给定的置所能识别的极限。分光光度法检测限的确定以扣除空白值后的吸光度为0.01应的浓度值为检测限。2. 标准质量×0.013.检测限=————————————4. 标准吸光度-空白吸光度色谱法检测限的确定以最低检出量（或浓度）表示检测限。S=3NS——最小响应值（峰高或峰面积）N——噪音信号标准物质的量×S最低检出量=————————————标准物质的响应值注：标准物质的量尽量接近最低检出量，较为准确。检测上限（maximumdetectability）指与标准曲线直线部分最高界点相应的浓度值。当样品中待测物质的浓度值超过检测上限时，无法定量。定量限（limitofquantitation,LOQ）定量下限：在限定误差能满足要求的前提下，用特定分析方法取SN=10N对于消除了系统误差的特定方法来说，精密度要求越高，则定量下限高出检测限越多。定量上限：能准确地定量测定待测物质的最大浓度或量。对于消除了系统误差的特定方法来说，精密度要求越高，则定量上限低于检测上限越多。方法的适用范围某一特定方法的检测下限至检测上限之间的测定。最佳测定范围（optimumconcentrationrange）亦称有效测定范围，在限定误差能满足能准确地定量测定待测物质的浓度或量。最佳测定范围应小于方法的适用范围，的最佳测定范围越小。检测上限定量上限斜率K=灵敏度定量下限检测限

最佳测定范围

方法适用范围选择性和专属性其它组分的存在不干扰的测定方法组成的。在测定条件有小的变动是，测定结果不受影响的承受程度。样品溶液的稳定性提取次数、时间HPLC流动相比例、PH、……（五）、分析方法建立实例分析实例1高效液相色谱法测定保健食品中的淫羊藿苷1范围

高效液相色谱法测定保健食品中的淫羊藿苷HPLCdeterminationofIcariineinhealthfood本方法规定了保健食品中淫羊藿苷的测定方法。本方法适用于以淫羊藿或淫羊藿提取物为主要原料生产的保健食品中淫羊藿苷的测定。原理将粉碎的胶囊内容物、丸剂或液体试样经提取、浓缩等前处理后，根据高效液相色谱紫外检测器定性定量检测。试剂除非另有说明，在分析中仅使用重蒸水。3.1乙醇分析纯乙腈色谱纯提取液稀乙醇（乙醇546mL→1000mL）淫羊藿苷标准溶液准确称量淫羊藿苷标准品0.012g，加入甲醇溶解并定容至25mL。此溶液每mL含0.48mg淫羊藿苷。仪器高效液相色谱仪：附紫外检测器（UV）。超声波清洗器。高效液相色谱法测定保健食品中的淫羊藿苷HPLCdeterminationofIcariineinhealthfood分析步骤试样处理：固体试样：取20粒以上胶囊、10g以上丸剂试样进行粉碎，混匀，根据样品含量，称取0.5g～2.5g试样（精确至0.001g），精密加入50mL稀乙醇，称重，超声提取60分钟，取出，放冷至室温，用稀乙醇补重，过滤，取续滤液，经0.45μm膜过滤后供液相色谱分析用。液体试样：取100mL以上液体试样，混匀，精密吸取50mL至10mL量瓶中并稀释至刻度，摇匀。经0.45μm膜过滤后供液相色谱分析用。液相色谱参考条件5.2.1色谱柱：C18柱，5μm，4.6×250mm5.2.2柱温：20～35℃。紫外检测器：检测波长270nm。高效液相色谱流动相：乙腈-水（26:74）。流速：1.0mL/min。进样量：10～20µL。色谱分析：取10～20µL峰面积通过标准曲线计算含量。高效液相色谱法测定保健食品中的淫羊藿苷HPLCdeterminationofIcariineinhealthfood淫羊藿苷标准溶液色谱图高效液相色谱法测定保健食品中的淫羊藿苷HPLCdeterminationofIcariineinhealthfood5.3标准曲线制备分别配制浓度为0.004836～1.0104mg/mL的淫羊藿苷标准溶液，在给定的仪器条件下进行液相色谱分析，进样量10µL，以峰面积对进样量（µg）作标准曲线。分析结果的表述由y=a+bx得[（yx-a）/b]×V1×10-3×100X=M×V2式中：X——试样中淫羊藿苷的含量，g/100g；yx——试样峰面积；V1——试样稀释倍数，mL；M——试样质量，g；V2——样品进样量，μg。5.4.2结果表示计算结果保留三位有效数字。技术参数准确度方法的回收率在95.0%～105.0%之间。允许差平行样相对误差≤2%。标准起草说明和方法学验证1仪器及试药仪器高效液相色谱仪：附紫外检测器（UV）岛津2010液相色谱仪；AgiLent1100液相色谱仪；岛津2010/SPD-M1.1.2超声波清洗器。试剂除非另有说明，在分析中仅使用重蒸水。纯净水为Milli-Q纯水系统二次制备。1.2.1乙醇分析纯。乙腈色谱纯。稀乙醇（乙醇546mL→1000mL）。样品前烈立舒胶囊：澳美制药生产。中国劲酒：劲牌有限公司生产。海狗丸：深圳市宝和堂保健品有限公司出品。标准品：淫羊藿苷（批号：110737-200414，中国药品生物制品检定所提供）。标准起草说明和方法学验证2样品及处理固体试样：取10粒胶囊内容物，混匀，取约0.5g，精密称定；或取10g丸剂，研细，混匀，取约2.5g，精密称定。精密加入稀乙醇50mL，称重，超声处理60分钟，放冷至室温，再称重，加稀乙醇补足减失的重量。滤过，取续滤液，经0.45μm膜过滤后作为供试品溶液。液体试样：取100mL以上液体试样，混匀，精密吸取50mL，减压浓缩至近干，用稀乙醇转移至10mL量瓶中并稀释至刻度，摇匀。经0.45μm标准起草说明和方法学验证3对照品精密称取淫羊藿苷标准品12.33mg，置25mL量瓶中加甲醇溶解并稀释至刻度，作为标准品溶液。标准起草说明和方法学验证4线性及范围精密量取标准品溶液0.5mL，1mL、2mL，分别置25mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀。精密量取标准品溶液1mL，2mL，3mL，5mL，10mL，分别置10mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀。按给定的色谱条件，分别精密吸取稀释后的标准品溶液10μL，注入液相色谱仪，测得峰面积积分值。以峰面积积分值为纵坐标，以淫羊藿苷标准品进样量（g）回归方程为：y=2.2260×106x-1.3159×104，r=0.9998淫羊藿苷在0.09864～4.932μg范围内，进样量与峰面积积分值呈良好的线性关系。（见附图1）标准起草说明和方法学验证12000000

进样量（μg） 峰面积积分值100000008000000面积6000000面峰4000000200000000

1 2 3 4 淫羊藿苷进样量（）

0.098640.19728

2164524280110.394568504510.394568504510.4932120729960.986421414141.479632356712.46653874794.93211020132标准起草说明和方法学验证5检测限和定量限检测限精密吸取标准品溶液（浓度为0.009864mg/mL）1.0mL，置100mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。按上述色谱条件测定，进样量10μL。此浓度标准品的峰高为相应噪音的峰高的3倍。故本方法的检测限为0.9864×10-3μg。标准起草说明和方法学验证淫羊藿苷检测限色谱图标准起草说明和方法学验证定量限精密吸取标准品溶液（浓度为0.009864mg/mL）1.0mL，置10mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。按上述色谱条件测定，进样量10μL，连续进样5次，结果见下表。故本方法的定量限为9.864×10-3μg。标准起草说明和方法学验证进样次数峰面积积分进样次数峰面积积分值平均值RSD%244121.48%124556224838324044424025524597标准起草说明和方法学验证16小时内稳定性试验结果小时峰面积积分值平均值小时峰面积积分值平均值RSD%0119543021171502411719506119025211817750.90%8116495510119228312118178314118900916117880816小时内淫羊表标准起草说明和方法学验证重复性试验结果试验重复次数试验重复次数含量取样量（g）（g/100g）平均值RSD%1.04562.04%10.26741.086910.26741.086920.24941.074530.24851.057840.49981.040950.50001.044060.50301.003970.50311.041980.50381.023690.50561.0474100.75031.0398110.76021.0399120.75101.0465号:QLS050107)12份（低浓度3份，中间浓度6份，高浓度3份），按样品溶液制备方法制备，依给定色谱条件测定含量标准起草说明和方法学验证仪器精密度取

仪器精密度试验结果峰面积积同一供试品溶液，按给定色谱条件重复进样6面积积分值

进样次数 1234369212343692223452403234834623460740.13%423425145235077362345878

平均 RSD%标准起草说明和方法学验证中间精密度试验33台不同的设备对同一批（QLS050107批）量

测定仪器测定结果测定仪器测定结果（g/100g）平均RSD%1岛津2010液相色谱仪1.062AgiLent1100液相色谱仪1.091.071.42%3岛津2010/SPD-M液相色谱仪1.06标准起草说明和方法学验证8回收率分别精密吸取标准品溶液（精密称取淫羊藿苷29.32mg置100mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。浓度：0.2932mg/mL）5.0、10.015.0mL，置100mL锥形瓶中，挥干溶剂，取本品(批号:QLS050107)0.25g，共9份，按样品溶液制备收率测得量-样品中含量回收率%=×100%对照品加入量回收率试验结果量(mg)入量量(mg)入量(mg)2.65374.106899.12%2.65374.1338100.96%2.61401.46604.065198.98%98.45%2.61404.0913100.77%2.60984.023796.45%2.60983.994194.43%2.77195.614596.95%2.77195.682199.26%2.66842.93205.570398.97%98.02%2.66845.580199.31%2.64335.479796.74%2.64335.483496.87%2.65796.876395.92%2.65796.940997.39%2.67884.39806.892995.82%96.81%2.67886.900996.00%2.63706.939897.84%2.63706.942297.89%

对照品加

测得量

回收率%

平均值 总平均% RSD%97.76% 0.87%标准起草说明和方法学验证9专属性取未加入淫羊藿药材的空白对照样品0.5g，按样品溶液制备方法制备。按给定色谱条件进行测定，结果未检测出淫羊藿苷的色谱峰标准起草说明和方法学验证专属性色谱图（色谱图从下到上依次为溶剂、缺淫羊藿阴性、淫羊藿苷对照品、样品）标准起草说明和方法学验证10耐用性分别采用3根不同商品规格的色谱柱，对同一批（QLS050107批）依给定测定条件测定含量色谱柱规格色谱柱规格测定结果（g/100g）平均RSD%PhenomenxGemini5μ，C110A，250×4.6mmAgilentC，250×4.6mm181.071.061.060.71%18HiQSilC18W，250×4.6mm，No.00W001691.06标准起草说明和方法学验证11不确定度P±0.050P（k=2）标准起草说明和方法学验证12其他有关说明采用已建立的方法，测定了不同配方、不同剂型的保健食品中淫羊藿苷的含量。标准起草说明和方法学验证中国劲酒中淫羊藿苷的含量测定供试品溶液的制备精密量取本品50mL，减压浓缩至近干，用稀乙醇转移至10mL量瓶中并稀释至刻度，摇匀，经0.45µm滤膜滤过，即得。标准品溶液的制备精密称取淫羊藿苷标准品12.59mg，置25mL甲醇溶解并稀释至刻度，作为对照品溶液。标准曲线的制备精密量取对照品溶液0.5mL，1mL，2mL，分别置25mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀。精密量取对照品溶液1mL，2mL，3mL，5mL，10mL，分别置10mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀。按给定的色谱条件，分别精密吸取稀释后的标准品溶液10μL，注入藿苷标准品进样量（µg）为横坐标，绘制标准曲线。测定法精密吸取供试品溶液10μL值，通过标准曲线计算供试品溶液中淫羊藿苷的含量。标准起草说明和方法学验证海狗丸中淫羊藿苷的含量测定供试品溶液的制备取本品适量，研细，混匀，精密称取2.5g，精密加入稀乙醇50mL，摇匀，称重，超声处理60补足减失的重量，滤过，取续滤液，经0.45m滤膜滤过，即得。标准品溶液的制备、标准曲线的制备同“中淫羊藿苷的含量测定”项下。测定法精密吸取供试品溶液20μL，注入液相色谱仪，记录峰面积积分值，通过标准曲线计算供试品溶液中淫羊藿苷的含量。标准起草说明和方法学验证样品测定结果试样名称试样名称含量RSD%中国劲酒2.40×104/100mL0.54%海狗丸1.28×102/100g0.75%标准起草说明和方法学验证其他保健食品色谱图（1中国劲酒；2海狗丸；3淫羊藿苷对照品）保健食品功效成分检测实例分析实例2HPLC-DAD-MS法同时测定保健食品中六种大豆异黄酮类成分的含量天然药物及保健食品概况一．天然药物的特点来源广泛成分复杂多样功效成分不唯一质量控制和评价难度大天然药物及保健食品概况二、保健食品的特点概念来源食品、药食同源、维生素、矿物质质量和安全性问题标准功效成分不明确违法添加严重外源性有害残留物控制稳定性、可控性检测一致性均一性天然药物及保健食品概况三、天然药物及保健食品分析检测的发展趋势功效性检测代谢产物安全性检测外源性有害残留物检测内源性有毒物质的检测稳定性、可控性检测一致性均一性色谱质谱技术在天然药物和保健食品分析中的应用一．功效成分检测（常量、微量）二．安全性检测（有害残留、有毒成分）三．稳定性和可控性（指纹图谱技术）HPLC-DAD-MS在天然药物和保健食品分析中的应用介绍大豆异黄酮类成分概况功效和用途：大豆异黄酮作为天然的植物雌激素，具有泛的关注和研究。市场概况：我国市场上有关大豆异黄酮类成分的中药、天然药物、植物提取物、保健食品（进口、国产）繁多，质量参差不齐。标准概况：目前只控制1-2种成分大豆异黄酮类成分概况R1 OR2中文名称R文名OH R1R2R3大豆苷元DaidzeinOHHH大豆苷DaidzinO-GluHH染料木素GenisteinOHHOH染料木苷GenistinO-GluHOH黄豆黄素GlyciteinOHOCH3H黄豆黄苷GlycitinO-GluOCH3H大豆异黄酮类成分概况目前大豆异黄酮类成分常见的分析方法：紫外分光光度法薄层扫描法高效液相色谱法这些方法在准确性、合理性、可操作性等方面均有欠缺，大多数方法只报道了测定其中1～2实质量。标准现状S1S2S3S4多成分同时测定？对照品检测成本单成分同时测定多成分常规的HPLC 法用于多成分分析1、大豆苷2、黄豆黄苷3、染料木苷4、大豆苷元5、黄豆黄素6、染料木素

12 34 5 6色谱条件液相色谱仪：WatersAlliance2690高效液相色谱仪色谱柱：AgilentzorbaxSB-C18（4.6×150mm,5μ柱温：25℃流动相：0.2%甲酸-乙腈（梯度）流速：1ml/min检测波长：DAD时间0.2%甲酸（%）乙腈（%）流动相梯度表时间0.2%甲酸（%）乙腈（%）0min901018min782225min782243min703045min5050样品测定CRS S3S1 S4S2 S5HPLC-DAD-MS法用于多成分同时测定A B用一个对照品同时测定多个成分——校正因子法校正因子（以染料木素计）染料木甙

浓度(mg/ml)校正因子平均校正因子 RSD(%0.2041.350.4080.2041.350.4081.380.8161.421.6321.392.041.353.061.420.152.180.32.050.62.201.22.081.52.142.252.070.02561.670.05121.620.10241.690.20481.640.2561.660.3841.661.39 2.27黄豆黄甙 2.12 2.94黄豆黄素

1.66 1.46计算因子（以染料木素计）化合物大豆甙

浓度(mg/ml)校正因子平均校正因子 RSD(%0.211.980.211.980.421.920.841.881.681.942.11.993.151.920.0761.210.1521.260.3041.170.6081.230.761.181.141.21.21 2.93常规法替代法含量常规法替代法含量(%)RSD(%)含量(%)RSD(%)0.301.080.321.650.071.830.051.790.621.260.611.050.861.630.891.220.061.960.081.920.471.280.461.51中文名称大豆苷以单成分为对照同时测定多成分时，最大的困难——被测成分的识别？？？A C DFBEHPLC-DAD-MS用于多成分同时测定Mix-standard-72126:DiodeArray8.0e-26.0e-2UA4.0e-22.0e-2

9.6210.5823.20

14.47

25.45

36.57

280Range:9.468e-21.650.00.00 Mix-standard-72124:SIRof6ChannelsES+90

5.00 7.50 10.00 12.50 15.00 17.50 20.00 22.50 25.00 27.50 30.00 32.50 35.00 37.50 40.0023.35 TIC3.36e525.50%9.6310.71

36.5314.47-10Time0.002.505.007.5010.0012.5015.0017.5020.0022.5025.0027.5030.0032.5035.00 37.5040.00HPLC-DAD-MS 提供的信息MIX-CRS-7201Mix-standard-7201165(37.065)MIX-CRS-7201Mix-standard-7201165(37.065)3:SIRof6ChannelsES+100271.08.85e42.658e-1Mix-standard-72012214(37.010) 6:DiodeArray2.658e-1260.42.0e-16:DiodeArray0.0 06:DiodeArrayMix-standard-7201116Mix-standard-7201116(26.026)3:SIRof6ChannelsES+100285.06.61e47.325e-2256.47.325e-25.0e-2 320.46:DiodeArray0Mix-standard-72011046:DiodeArray0Mix-standard-7201104(23.322)3:SIRof6ChannelsES+100255.01.61e3Mix-standard-72011408(23.577)1.0e-10.0

249.4

1.221e-11.221e-1302.46:DiodeArray06:DiodeArray

285.0 417.0433.0447.0Mix-standard-7201878(14.743)

Mix-standard-720166(14.761)1.0e-1

260.4

3:SIRof6Channels1.643e-11001.643e-1

271.0

433.0

2.64e40.0Mix-standard-7201644(10.843)

06:DiodeArrayMix-standard-720149(10.931)6:DiodeArray258.4 8.63e-25.0e-2 321.46:Diode6:DiodeArrayMix-standard-7201587(9.893)

3:SIRof6ChannelsES+1000

285.0

447.0

4.84e41.345e-1Mix-standard-7201441.345e-1Mix-standard-720144(9.805)3:SIRof6ChannelsES+100255.01.53e4

250.4

417.0nm0m/znm0m/z250300350400100125150175200225250275300325350375400425450475500525550575600625650675700725750775800%UA%%UA%%UA%%UA%%UA%%UA%HPLC-DAD-MS 提供的信息中文名称分子量保留时间UV光谱大豆苷元25426.1218，249，302大豆苷41610.6218，251染料木素27041.3223，260染料木苷43215.9218，260黄豆黄素28428.2218，254，320黄豆黄苷44611.7218，258，320HPLC-DAD-MS条件液相色谱条件：液相色谱仪：WatersAlliance2690高效液相色谱仪色谱柱：AgilentzorbaxSB-C18（4.6×150mm,5μm）柱温：25℃流动相：0.2%甲酸-乙腈（梯度）流速：1ml/min（DAD）；0.2ml/min（质谱检测器）质谱条件：WatersmicromassZQ液质联用仪，ESI正离子检测：毛细管电压3.0KV，锥孔电压40v，源温度120℃，去溶剂温度150℃。去溶剂气（N2）流速：300L/hr.离子扫描范围：100-700m/z；选定m/z255,271,285,417，433和447进行选择性离子扫描（SIM）HPLC-DAD-MS用于多成分同时测定sample1-72015:DiodeArray9.66 Range:1.35e+28.0e+16.0e+1UA4.0e+1

10.61

14.442.0e+10.0

1.612.02 4.31

19.1620.06

23.04

25.260.0040.00sample1-72012:SIRof6Channels

2.50 5.00 7.50 10.00 12.50 15.00 17.50 20.00 22.50 25.00 27.50 30.00 32.50 35.00 37.509.67 TIC7.66e4%10.70

23.2114.47

19.27

25.27

26.6436.258.98

29.041 Time0.00 2.50 5.00 7.50 10.00 12.50 15.00 17.50 20.00 22.50 25.00 27.50 30.00 32.50 35.00 37.5040.00常规方法HPLC-DAD计算因子HPLC-DAD-MS对照品替代法应用范围定的线性范围内。分的分析（如黄酮类、皂苷类等）。产品的常规例行检测有较大的优势。进一步验证工作（耐用性考察，如仪器、色谱柱类型、流动相比例、柱温、PH等优势简便、快速、高效经济实用改善目前部分对照品严重缺乏的局面新的质量控制和评价思路复杂体系扩展应用——胆酸类成分测定（HPLC-ELSD）400.001 2 3300.00200.00Vm

6 74 5 8100.000.005.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00Minutes1、牛黄熊去氧胆酸 2、牛黄胆酸钠 3、牛黄鹅去氧胆酸4、熊去氧胆酸 5、猪去氧胆酸 6、胆酸7、鹅去氧胆酸 8、去氧胆酸扩展应用——低聚糖类成分测定（HPLC-RID）20.0018.0016.0014.0012.0010.00VM8.00

1 3520205 833564 4 5622608750871986.00 9 9983434.00 12.003020.00 2-2.00

0.0010.0020.00

2.00 4.00 6.00 8.0012.00 14.00 16.00 18.00分钟1、蔗糖（Sucrose）2、蔗果三糖（kestose）3、棉籽糖（Raffinose）4、蔗果四糖（Nystose）5、蔗果五糖（Fructofranosylnystose）6、水苏糖（Stachyose）扩展应用——PUFAs（ω3）类成分测定（HPLC-ELSD）1200.001000.00 1800.002V 600.002m3400.00200.000.000.0024.00

2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00分钟1、二十碳五烯酸(EPA) 2、二十二碳六烯酸(DHA)3、二十二碳五烯酸(DPA)扩展应用——马兜铃酸类成分测定（HPLC-DAD-MS）Total100 26100 26.23 53.36

1 5

9.65e52232.03

6457.504447.58%3333.162.11-30.0045.00

5.0050.00

10.0055.00

15.0060.00

20.00 25.00 30.00 35.00

Time

40.001、马兜铃酸C 2、7-羟基马兜铃酸A 3、马兜铃酸D4、马兜铃酸B 5、马兜铃酸A 6、去硝基马兜铃酸A实例3RP-HPLC-RID法同时测定保健食品中6种常见低聚糖的含量提纲一．二．三．总结与讨论一、低聚糖概况低聚糖(Oligosaccharide)或称寡糖，是由2～10个单糖通过糖苷普通低聚糖两大类。普通低聚糖：蔗糖、乳糖、麦芽糖、麦芽三糖和麦芽四糖益细菌双歧杆菌的增殖因子。功能性低聚糖：包括水苏糖、棉子糖、异麦芽酮糖、乳酮此它们不被消化吸收而直接进入大肠内优先为双歧杆菌所利用，是双歧杆菌的增殖因子低聚糖概况1999年我国公布的“则行业标准”对功能性低聚糖的定义为：功能性低聚糖（functionaloligosaccharide）是由10个相同或不同的单糖，以糖苷键聚合而成；具有糖类某些共同的特性，可直接代替糖料作为肠吸收，可到达大肠部；具有促进人体双岐杆菌的增殖等生理功能。低聚果糖、低聚异麦芽糖、低聚半乳糖、低聚木糖、低聚乳果糖、乳酮糖、黑曲霉低聚糖等低聚糖的功能和保健作用促进双岐杆菌增殖，调整肠道功能。酸,所以肠内的酸碱度(PH值)偏向强酸性,这样可以抑制病原菌的繁殖,防止人体受到感染。故双岐杆菌是典型的有益菌群(俗称长寿菌),增殖。有研究表明:每天摄入10克低聚糖,连续服用10～15天,肠道内的双岐杆菌活菌数可增加40倍。目前广谱和强力的抗菌素广泛用于各种疾病的治疗,但它们在杀死病菌的同时,也使人体肠道内正常的菌群可行。低聚糖的功能和保健作用低能量低聚糖很难或不被人体消化吸收,所提供的能量值很低或根本可供糖尿病人、肥胖病人和低血糖病人食用。膳食纤维功能如有降低血清胆固醇的作用,还能促进肠道废物的排泄,有预防结肠癌的作用。低聚糖的功能和保健作用预防龋齿低聚糖不会引起牙齿龋变,因龋齿是由于口腔微生物特别是突的合适作用的营养底物,因此不会引起牙齿龋变,有利于保持口腔卫生。促进生成营养物质:由于双岐杆菌在肠道内能自然合成微生素B1、B2、B6、B12、能力增强。（6）其他功能：降血脂、降血压、预防骨质疏松等。低聚糖的功能和保健作用自然界含量少：例如洋葱、大蒜、天门冬、菊苣根等含有低聚果糖,大豆中含有大豆低聚糖。需要补充：从一般膳食习惯上看,每天摄取的低聚糖往往很难达到推荐量标准。因此,对于婴幼儿、老人和工作压力康尤其是消化系统的健康是非常有益的2003年日本低聚糖保健食品市场分布概况（共54亿美元）14.20%4.90%11.20%

2%1.60%2.10%

64%

控制体重防龋齿骨健康调节胆固醇我国常见的对低聚糖我国对低聚糖的研究始于上世纪80模和商品化则在80年代默契。麦芽糖、低聚甘露糖我国卫生部批准的具有改善肠道润肠通便功能的保健食芽糖、低聚甘露糖等。大豆低聚糖棉子糖、水苏糖等。其中棉子糖和水苏糖被称为大豆低聚糖的主要功效成分。调节肠道菌群平衡的作用。同时大豆低聚糖还具有抑制病原菌、防止便秘、腹泻、保护肝用等多种生理功能，另外，大豆低聚糖对糖尿病人可作为糖的替代品。所以，大豆低聚糖类成分在近20并迅速发展成为一种新型的保健食品。低聚果糖低聚果糖(fructooligosaccharides,FOS)是以蔗糖为原料经微生物酶作用而制得的由葡萄糖和果糖组成的杂低聚糖混合物，包括蔗果三糖(GF2)、蔗果四糖(GF3)、蔗果五糖(GF4)、蔗果六糖(GF5)等低聚糖。低聚果糖浆类似水溶道和润肠通便功能的保健食品原料。低聚果糖低聚果糖低聚果糖（Fructooligosaccharides，简称FOS）是指1-4个果糖基以β-（2→1）糖苷糖连接在蔗糖的D-果糖基上而形成的蔗果三糖（GF2）、蔗果四糖（GF3）、蔗果五糖和蔗果六糖（GF5）的混合物。产品中低聚果糖总含量是指蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖和蔗果六糖占干物质的百分含量，其中，蔗果六糖含量不得超过FOS总含量的5％，超过部分不计。FOS总含量大于等于50％的产品称为普通型低聚果糖（G型），总含量大于等于90％的产品称为高纯度低聚果糖（P型）。低聚果糖和大豆低聚糖的主要成分中文名称英文名称结构特点蔗果三糖kestoseG-F2蔗果四糖nystose,G-F3蔗果五糖fructofranosylnystoseG-F4蔗糖sucroseG-F1棉籽糖kestoseG-F-Ga1水苏糖raffinoseG-F-Ga2二、测定方法研究目前低聚果糖和大豆低聚糖类成分常见的分析方法：紫外分光光度法高效液相色谱法这些方法在准确性、合理性、可操作性等方面均有欠缺，大多数方法只报道了测定其中1～2个成分的含量，不能较为全面地反应产品的真实质量。研究目标糖类成分的分析方法HPLC-RID法果五糖、水苏糖共六种成分HPLC-RID 法用于6种成分的测定1、蔗糖2、蔗果三糖3、棉籽糖4、蔗果四糖5、蔗果五糖6、水苏糖1

色谱条件Waters515高效液相色谱仪，2414视差折光检测器。蔗糖、蔗果三糖、棉籽糖、蔗果四糖、蔗果五糖、水苏糖对照品均购自北京禾境科技发展中心。实验所用乙腈为色谱纯，其他溶剂为分析纯，水为纯净水，过Millipore0.22μm滤膜。含大豆低聚糖保健食品样品共4市售。2色谱条件 色谱柱AgilentzorbaxNH2（4.6m5μm）柱温5℃；流速min-；流动相由流动相水-乙腈（30：70）等度进行洗脱，视差折光检测器内部温度设为35℃；理论塔板数按蔗糖计算不低于2000。方法3溶液的制备对照品溶液分别精密称取蔗糖、蔗果三糖、棉籽糖、蔗分别配制成蔗糖为1.19mg·mL-1、蔗果三糖为1.13mg·mL-1棉子糖1.02mg·mL-1、蔗果四糖1.08mg·mL-1、蔗果五糖1.05mg·mL-1、水苏糖1.12mg·mL-1的溶液，作为对照品溶液。供试品溶液分别精密秤取样品（市售大豆低聚糖类保健食品，多为粘稠液体）0.5g于25ml的容量瓶中，用流动相溶液定容，充分摇匀，过0.45μm试品溶液。方法4方法与结果线性关系考察分别吸取对照品溶液2.0，4.0，8.0，10.0，15.0，20.0μL定峰面积。以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，计算其回归方程，见表1。结果表明蔗糖在2.38～23.8μg、蔗果三糖在2.26～22.6μg、棉子糖在2.04～20.4μg、蔗果四糖在2.16～21.6μg、蔗果五糖在2.10～21.0μg、水苏糖在2.24～22.4μg范围内线性关系良好。6种低聚糖的线性关系成分 回归方程 r蔗糖蔗果三糖棉子糖蔗果四糖蔗果五糖水苏糖

Y5×Y3×Y2×Y2×Y8×Y7×

－1.485×10－1.143×10－1.621×10－1.092×10－2.127×10－2.305×10

0.99950.99930.99940.99970.99910.999220.0018.0016.0014.00A12.00A10.00VM8.00

1 2 03 8

4 5 6

对照品6.004.00

9

9 3.12.000.00

.2-2.0035.00

0.008.0016.00

10.0018.00

2.00分钟

12.0020.00

4.00 6.0014.0030.0025.00B20.00BVM

5 . 5 . 3 815.0010.005.00

557

410.000.00

2.00

4.00 6.008.0016.00

10.00 12.00 14.0018.00 20.001、蔗糖（Sucrose）

、蔗果三糖（kestose）3、棉籽糖（Raffinose）4、蔗果四糖（Nystose）5、蔗果五糖（Fructofranosylnystose）6、水苏糖（Stachyose）方法稳定性试验精密吸取供试品溶液10μL，每隔2h.进样一次，共6果五糖、水苏糖的RSD分别为0.99%，0.96%，1.21%，1.22%，0.97%，0.87%，表明12h内测定结果稳定。精密度实验分别精密吸取对照品溶液10μL，注入液相色谱仪，测水苏糖的RSD分别为（n＝5）0.93%，0.98%，1.11%，1.01%，1.54%，1.03%，表明仪器精密度良好。最低检测限和定量限以信噪比3:1为标准测得蔗糖、蔗果三糖、棉子糖、蔗果四糖、蔗果五糖、水苏糖的最低检测限分别为0.52，0.88，0.61，0.73μg，0.93μg。以信噪比10:1时的进样量作水苏糖的定量限分别为2.73，1.73，2.64，2.03，2.43μg，2.79μg。方法重复性实验取同一样品5份，按样品处理方法平行提取并同法测定6种水苏糖的RSD分别为1.25%，1.21%，0.96%，0.93%，1.33%,1.14%,表明本法重复性良好。回收率试验采用加样回收率实验方法。分别精密秤取已知含量的1号样品0.25g共9份，每3份1组，按高、中、低3个水平分别精密加入一定量对照品（相当于样品中各成分含有量的80%，100%