第14章维生素类药物的分析

第十四章维生素类药物的分析Chapter14

AnalysisofVitamins基本要求1、掌握维生素A、B1、C、E的化学结构、理化性质以及与分析方法间的关系，它们的专属鉴别反应、主要的含量测定方法与原理。2、掌握维生素A、B1、C、E的有关物质、检查方法与原理。3、了解维生素D的性质和分析特点。

维持人类机体正常代谢功能所必须的一类活性物质，主要用于机体的能量转移和代谢调节，体内不能合成，须从食物中摄取。

通俗来讲，即维持生命的物质，是维持人体生命活动必须的一类有机物质，也是保持人体健康的重要活性物质。维生素在体内的含量很少，但不可或缺。维生素醇从化学结构上来讲，维生素类均属于有机化合物，但并非同一类化合物。酯酸胺酚醛各具有不同的理化性质和生理作用维生素按溶解度分生物法微生物法化学法物理化学法维生素类药物的分析方法都是依据药物的化学结构、理化性质与生物特性来进行分析-H维生素A醇-COCH3维生素A醋酸酯-COC15H31维生素A棕榈酸酯R:第一节维生素A结构特点：（1）环己烯+共轭多烯侧链；（2）天然VA侧链为全反式；（3）天然来源主要是鱼肝油，为醋酸酯，棕榈酸酯等,目前多由人工合成。

一、性质properties1.溶解性：

不溶于水，溶于乙醚，氯仿，环己烷或石油醚、植物油等。Solubility:insolubleinwater；solubleinether,chloroform,cyclohexaneorpetroleumether，vegetableoil

etc.

2.

不稳定性△或金属离子instability:light--catalysedcrackingreactionredoxreaction(oxidizedbyoxygeninair,orotheroxidizingagents)▲ⅰ．环氧化物

epoxides▲

ⅱ．维生素A醛aldehyde▲

ⅲ．维生素A酸acid具有共轭多烯侧链—紫外吸收，最大吸收波长在325~328nm，可用于鉴别和含量测定。3.紫外吸收ultravioletabsorptionconjugatedpolyenemaximumabsorptionwavelength：325~328nm4.与三氯化锑发生呈色反应reactionwithSbCl3(Carr-Pricereaction)CHCl3二、鉴别试验Identification（一）三氯化锑反应（Carr-Price反应）无水、无醇蓝色紫色insaturatedchloroformsolution,water,alcohol-free（二）UV法326nm348nm367nm389nmVitA去水VitA（VitA3）↓（三）

TLC（BP、USP）确认醇或酯，是醋酸酯或其他酸酯。▲例：VA和其标准品用氯仿溶解（USP34）展开剂：环己烷—乙醚（80：20）板：硅胶显色：磷钼酸Rf：VA醇0.1VA醋酸酯0.45VA棕榈酸酯0.7维生素A的测定CHP收载三种HPLC法UV三氯化锑法三、含量测定Assay立体异构体氧化降解产物合成中间体（一）UV法三、含量测定Assay维生素A2维生素A3环氧化物维生素A醛维生素A酸three-pointcorrectionprocedure（三点校正法）three-wavelengthcorrectionprocedure

1.原理：（1）杂质的吸收在310~340nm波长范围内呈一条直线，且随波长的增大吸收度减小；（2）物质对光的吸收具有加和性。Supposition：I.theirrelevantabsorption:islinearbetween310~340nmwavelenghs(atthethreewavelenghsselected)II.thetotalabsorbanceofthemixtureisthesumoftheindividualabsorbanceofcomponentsAt=AVA+Ai2.波长的选择：（1）1—VitA的max（328nm）（2）2、3—分别在1的两侧第一法等波长差法—VitA醋酸酯=12nm第二法等吸收比法—VitA醇1=325nm,2=310nm,3=334nm（1）基本步骤:第一步

A的选择选择依据：所选A值中杂质的干扰已基本消除测定法第二步求注意：

C为混合样品的浓度

换算因子由纯品计算而得：第三步求效价第四步求标示量％

方法：（2）测定法第一法直接测定法适用于纯度高的维生素A醋酸酯ⅰ．最大吸收波长确认

max在326~329nm，第一法测定。max不在326~329nm，第二法测定。ⅱ．计算吸收度比及比值差均不超过±0.02，用A328直接计算。有一个以上超过±0.02，计算A328（校正），先判断再计算。ⅲ．计算校正吸收度03%－15%－3%第二法第二法

VitAD胶丸中VitA的含量测定

精密称取本品(规格10000VitAIU/丸)装量差异项下（平均装量0.07985g/丸）的内容物0.1287g至10ml烧杯中，加环己烷溶解并定量转移至50ml量瓶中，用环己烷稀释至刻度，摇匀；精密量取2.0ml，置另一50ml量瓶中，用环己烷稀释至刻度，摇匀。以环己烷为空白，测定最大吸收波长为328nm，并在下列波长处测得吸收度为A300：0.374A316：0.592A328：0.663A340：0.553A360：0.228A300/A328：0.564A316/A328：0.893A328/A328：1.000A340/A328：0.834A360/A328：0.344求本品中维生素A占标示量的百分含量？A300/A328：0.564A316/A328：0.893A328/A328：1.000A340/A328：0.834A360/A328：0.3440.5550.9071.0000.8110.299+0.01－0.010+0.02+0.04－－－－－=====A328(校正)=3.52(2A328-A316-A340)=3.52(2×0.663–0.592–0.553)=0.637A328(校正)–A328(实测)A328(实测)×100％E1%1cm(328nm)=A328(校正)100ms/D=0.637100×0.1287/1250=61.870.637–0.6630.663×100％=-3.92％=供试品中维生素A效价=E1%1cm(328nm)×1900=61.87×1900=117553（IU/g）标示量%=VA效价(IU/g)×每丸内容物平均装量(g/丸)标示量(IU/丸)×100%=117553×0.0798510000×100%=93.9%第二法（等吸收比法）[皂化法、6/7A法]第一法无法消除杂质干扰时用此法水溶性脂溶性

方法：ⅰ．最大吸收波长确认

max在323~327nm，计算A300/A325。max不在323~327nm，取未皂化样品采用色谱法纯化后再测定。ⅱ．计算吸收度比值A300/A325＞0.73，取未皂化样品采用色谱法纯化后再测定≯0.73，计算A325（校正）后，再判断计算ⅲ．计算校正吸收度03%－3%仪器与色谱条件

HPLC,紫外检测器色谱柱：硅胶

流动相：正己烷-异丙醇（997:3）检测波长：325nm（二）HPLC法测定法

外标法适用范围

维生素A醋酸酯原料及其制剂中维生素A的含量（三）三氯化锑比色法λmax618nm～620nm缺点呈色不稳定（5~10s内）水分干扰与标准曲线温差≤1℃专属性差三氯化锑有腐蚀性蓝色+3SbClVitASbCl3colorimetricmethod:第二节维生素E一、结构与性质***名称R1R2相对活性α-生育酚CH3CH31.0β-生育酚CH3H0.5γ-生育酚HCH30.2δ-生育酚

HH0.1苯并二氢吡喃环+饱和烃链dl－α－生育酚醋酸酯1.溶解性黄色液体，无水乙醇、丙酮、乙醚植物油中易溶2.水解性3.氧化性：遇光、空气氧化4.UV：无水乙醇液284nm，E为41.0~45.0[O]△游离生育酚-+orOHHVitE醌型化合物（一）硝酸反应nitricacidreaction(redoxreaction)二、鉴别75℃15′HNO3VitE乙醇橙红色Identification生育酚HNO3（橙红色）生育红对-生育醌（二）三氯化铁－联吡啶反应血红色=41.0～45.5λmax=284nmλmin=254nm0.01%无水乙醇中（三）UV法（四）其他方法TLC、GC、HPLC、IR三、杂质检查Test（一）酸度acidity

目的：检查制备过程中引入的游离醋酸。方法：乙醇乙醚为溶剂，酚酞为指示剂，以NaOH滴定液（0.1mol/L）滴定，体积控制，不得过0.5ml。（二）游离生育酚Testoffreetocopherol

利用生育酚的强还原性，规定所消耗的硫酸铈液（0.01mol/L）不得超过1.0ml。CH.P

取本品0.10g，加无水乙醇5ml溶解后，加二苯胺试液1滴，用硫酸铈液（0.01mol/L）滴定，消耗硫酸铈液（0.01mol/L）不得过1.0ml。p-tocopherquinonefreetocopherol（M生育酚=430.8）滴定度的计算限量的计算（三）有关物质方法：GC—主成分自身对照法限量：α-生育酚（1.0%）其他单个杂质峰（1.5%）各杂质峰总和（2.5%）（四）残留溶剂天然型维生素E检查正己烷。四、含量测定（一）GC法（ChP法定方法）

内标法(正三十二烷为内标)维生素E原料及其制剂均采用本法测定（二）其他方法

HPLC法（JP15）铈量法比色法荧光法1．中国药典（2010年版）采用以下何法测定维生素E含量A.酸碱滴定法B.氧化还原法C.紫外分光光度法D.气相色谱法E.非水滴定法2．维生素A的鉴别试验为A.三氯化铁反应B.硫酸锑反应C.2,6-二氯靛酚反应D.三氯化锑反应E.间二硝基苯的碱性乙醇液反应3．中国药典（2010年版）规定维生素A的测定采用紫外分光光度法（三点校正法），此法又分为A．等波长差法B．等吸收度法C．6/7A法D．差示分光法E．双波长法4．维生素E的鉴别试验有A．硫色素反应B．硝酸氧化呈色反应C．硫酸-乙醇呈色反应D．碱性水解后加三氯化铁乙醇液与2,2-联吡啶乙醇液呈色反应E．Marquis反应

维生素A与

反应即显蓝色，渐变成紫红色；反应需在

条件下进行。

维生素E在酸性或碱性溶液中加热可水解生成游离

，当有氧或其他氧化剂存在时，则进一步被氧化成醌型化合物，尤其在碱性下更易发生。第三节维生素B1HClCl-一、结构与性质1、溶解性2、硫色素反应3、UV(246nm，E为406~436)4、与生物碱沉淀试剂反应5、氯化物特性VitaminB1

Thiaminehydrochloride一、结构与性质

干燥品在空气中迅速吸收4%的水分。在水中易溶，在乙醇中微溶，在乙醚中不溶，水溶液呈酸性溶解性噻唑环在碱性介质中可开环，再与嘧啶环上的氨基环合，经铁氰化钾等氧化剂氧化成具有荧光的硫色素，后者溶于正丁醇中呈蓝色荧光。硫色素反应

嘧啶环、噻唑环具有紫外吸收特性，246nm，吸收系数为406~436（12.5μg/ml盐酸溶液）。紫外吸收特性分子中具有两个杂环，可与某些生物碱沉淀试剂如碘化钾、三硝基苯酚、碘溶液、硅钨酸反应生成恒定的沉淀。生物碱沉淀试剂反应维生素B1为盐酸盐，可呈氯化物的鉴别反应。氯化物特性

硫色素荧光反应

沉淀反应

氯化物反应硫元素反应红外分光光度法其他二、鉴别试验

Identification（一）硫色素反应thiochromereaction（ChP）方法：取本品约5mg，加NaOHT.S.2.5ml溶解后，加铁氰化钾T.S.0.5ml与正丁醇5ml，强力振摇2min，放置使分层，上层显强烈的蓝色荧光；加酸使呈酸性，荧光即消失；再加碱使呈碱性，荧光又重现。VitB1H+H+H+H+（二）沉淀反应Precipitationreaction

（三）其他反应PbSNaSVitB1Pb(NO3)2NaOHS:Cl:

非水溶液滴定法(ChP2010，原料药)

紫外分光光度法(ChP2010

，片剂注射剂)

硫色素荧光法(USP34-NF29)三、含量测定（一）非水溶液滴定法Non-aqueoustitration

醋酸汞试液

指示剂：喹那啶红－亚甲蓝（紫红→天蓝）2005版醋酐为溶剂

指示终点：电位法2010版（二）UV法246nm266nm233nm1.直接测定法2.差示分光光度法WEA%cmD10011××%100标示量平均片重××片剂、注射剂=421（每片）相当于标示量的%=A=ECL规格g/片g/100mlgChP维生素B1片的含量测定：

取维生素B1片20片，精密称定，其总重量为2.3695g，研细，精密称取细粉0.3608mg，置100ml量瓶中，加盐酸溶液（9→1000）约70ml，振摇15min使维生素B1溶解，加盐酸溶液（9→1000）稀释至刻度，摇匀。用干燥滤纸滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液精密量取5ml，置另一100ml量瓶中，加盐酸溶液(9→1000)稀释至刻度，摇匀。照分光光度法（附录ⅣA），在246nm的波长处测定吸收度A为0.615，已知维生素B1的吸收系数（E）为421，维生素B1标示量=10mg/片，计算维生素B1的标示百分含量。(P360)（每ml）相当于标示量的%=规格g/mlml%VEA%cm100110011××标示量稀释倍数×维生素B1注射剂的含量测定：精密量取维生素B1注射液1ml（约相当于维生素B150mg），置200ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。精密量取5ml，置100ml量瓶中，加盐酸溶液(9→1000)稀释至刻度，摇匀。照分光光度法（附录ⅣA），在246nm的波长处测定吸收度A为0.518，按C12H17ClN4OS·HCl的吸收系数（E）为421计算标示百分含量。（标示量为2ml:100mg）VitB1铁氰化钾NaOH硫色素异丁醇荧光λex-365nmλem-435nm+NaOH+铁氰化钾+异丁醇+NaOH+异丁醇对照液+NaOH+铁氰化钾+异丁醇+NaOH+异丁醇供试液SdAb（三）硫色素荧光法第五节维生素CL－抗坏血酸L-Ascorbicacid一、结构与性质1、溶解性2、酸性acidicbehavior3、还原性reducingaction4、旋光性5、水解性hydrolysis6、糖类的性质7、UV1、易溶于水在乙醇中略溶、在氯仿或乙醚中不溶2、水溶液呈酸性溶解性▲C3-OH，pKa=4.17(共轭效应)▲C2-OH，pKa=11.57(邻位羰基)一元酸，能与NaHCO3作用生成钠盐。烯二醇结构dienolgroup还原性烯二醇结构二酮基结构烯二醇结构有活性有活性无活性L-二酮古洛糖酸D(-)-异抗坏血酸L(+)-异抗坏血酸L(+)-抗坏血酸D(-)-抗坏血酸旋光性水解性△糖类的显色反应50℃结构与糖类相似具糖的性质UV特征

氧化还原反应

糖类反应

紫外光谱薄层色谱其他二、鉴别试验

Identification612345（一）与氧化剂的反应oxidationreaction去氢抗坏血酸[O]VitCAgNO3反应2，6-二氯靛酚其他氧化剂1.与AgNO3反应silvernitratereaction(ChP2010)2.与2,6-二氯靛酚反应2,6-dichloroindophenolreaction

氧化型玫瑰红色蓝色OHˉ还原型无色3.其他氧化剂的反应：亚甲蓝、高锰酸钾、溴水试剂褪色

碱性酒石酸铜（斐林试剂）砖红色沉淀

磷钼酸钼蓝（二）糖类的反应蓝色Furfural(dehyde)reaction50℃三氯化醋酸orHCl蓝色戊糖糠醛（三）TLC(ChP2010)

供试品溶液：VC泡腾片，水溶解后过滤

对照品溶液：VC1mg/ml

硅胶GF254

流动相：乙酸乙酯-乙醇-水（5:4:1）紫外灯（254nm）下视检

供试品所显主斑点的位置和颜色应与对照品溶液的主斑点相同。（四）UV(BP2010)0.01mol/LHCl三、杂质检查1.溶液的澄清度与颜色：有色杂质分光光度法—比较法2.铁、铜离子：原子吸收分光光度法，标准添加对照法3.草酸的检查：与钙反应，对照法

碘量法

二氯靛酚滴定法

高效液相色谱法紫外分光光度法其他612345四、含量测定

Assay

1、原理：在酸性溶液中，以淀粉为指示剂，用碘液直接滴定。（一）碘量法(

Iodimetry)ChP2010H+

取本品约0.2g，精密称定，加新沸过的冷水100ml与稀醋酸10ml使溶解，加淀粉指示液1ml，立即用碘滴定液（0.1mol/L）滴定，至溶液显蓝色，在30秒内不褪。每1ml碘滴定液(0.1mol/L)相当于8.806mg的C6H8O6。2、方法3、讨论（1）新沸冷H2O：减少水中溶解的O2（2）酸性环境：减慢VitC被O2氧化速度（3）立即滴定：减少O2的干扰（4）附加剂干扰的排除片剂——滑石粉——过滤注射剂——抗氧剂——丙酮甲醛Na2SO3NaHSO3

Na2S2O3Na2S2O5

OaS3aSO+H2NHON225HCHOOHH2CSO3Na（二）2，6-二氯靛酚钠滴定法

(2,6-dichloroindophenoltitration)原理1、去氢抗坏血酸＋酚亚胺VitC＋2,6—二氯靛酚自身指示终点法终点由无色到玫瑰红色方法2、终点：溶液显玫瑰红色，并持续5秒不褪色。讨论3、（1）酸性环境：稳定VitC（2）快速滴定2min内：防止其他还原性物质干扰（3）2,6—二氯靛酚滴定液不稳定，储备液不宜超过一周。（4）专属性较碘量法高，多用于制剂的含量测定。如：USP32、JP15

维生素A1、掌握维生素A的三点校正紫外分光光度法；2、熟悉维生素A的三氯化锑反应及其比色法；维生素B13、掌握维生素B1的硫色素反应；了解维生素B1的硫色素荧光法4、熟悉维生素B1的非水滴定法及片剂与注射剂的紫外分光光度法的测定原理、含量％、标示量％的计算方法；维生素C6、掌握维生素C的碘量法；7、熟悉维生素C的鉴别试验方法和2，6—二氯靛酚滴定法原理；8、了解维生素C的杂质检查项目；维生素E9、熟悉维生素E的鉴别试验方法、杂质游离生育酚检查原理与限度％计算法；小节1.维生素B1的鉴别方法是：A.三氯化铁反应B.硫色素反应C.柯柏反应D.与碱性酒石酸铜试液反应E.双缩脲反应练习与思考[A型题]2.下列药物的碱性溶液，加入铁氰化钾后，再加正丁醇，显蓝色荧光的是：A.维生素AB.维生素B1

C.维生素CD.维生素DE.维生素E3．既具有酸性又具有还原性的药物是：A.维生素AB.咖啡因C.苯巴比妥D.氯丙嗪E.维生素C4．在三氯醋酸或盐酸存在下，经水解、脱羧、失水后，加入吡咯即产生蓝色产物的药物应是A.氯氮卓B.维生素AC.普鲁卡因D.盐酸吗啡E.维生素C5：测定维生素C注射液的含量时，在操作过程中要加入丙酮，这是为了A.保持维生素C的稳定B.增加维生素C的溶解度C.使反应完全D.加快反应速度E.消除注射液中抗氧剂的干扰[B