第四章-基本分子生物学技术

常用分子生物学技术的原理及应用ThePopularTechnologyinMolecularBiology:PrincipleandApplication目录第一节分子杂交与印迹技术第二节PCR技术的原理与应用第三节核酸序列分析第四节基因文库第五节生物芯片技术第六节生物大分子相互作用研究技术第七节遗传修饰动物模型的建立及应用（了解）第八节疾病相关基因的克隆与鉴定（了解）第一节

分子杂交与印迹技术

MolecularHybridization&BlottingTechnology变性复性具有一定同源性的两条核酸单链在一定条件下，按碱基互补原则形成双链，称为核酸分子杂交。一、核酸分子杂交概念

DNA-DNA杂交双链分子（一）核酸分子杂交(nucleicacidhybridization)在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂化双链(heteroduplex)

。一、分子杂交与印迹技术的原理杂交的双方分别称探针和待测核酸。杂交可分为：

DNA/DNA、RNA/RNA、DNA/RNA之间的杂交。杂交具有高度特异性和灵敏性。核酸分子杂交

（一）、DNA的变性在某些理化因素作用下，DNA双链解开成两条单链的过程。本质是双链间氢键的断裂。变性的方法（1）热变性：温度升高到90―100℃时，双链核酸分子链间的氢键完全断裂。（2）酸碱变性：pH值低于3或高于10时，双链核酸分子链间的氢键断裂。（3）化学试剂变性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使双链核酸分子链间的氢键断裂。（二)、DNA的复性DNA-DNA杂交双链分子变性复性不同来源的DNA分子（二）、DNA的复性

DNA复性的定义在适当条件下，变性DNA的两条互补链可恢复天然的双螺旋构象，这一现象称为复性。退火(annealing)

热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，这一过程称为退火。（二）、DNA的复性影响DNA复性的因素1.核酸分子的浓度：适宜的探针浓度。2.核酸分子的长度：核酸探针长度控制在

50～300bp3.温度：适宜的复性温度是较Tm值低25℃。4.离子强度：离子强度过低，不利于复性。5.核酸分子的复杂性。（三）探针技术

探针(probe)

一小段用同位素、生物素或荧光染料等标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸。与固定在NC膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。1、核酸探针的种类根据探针标记方法不同：分为放射性探针和非放射性探针两大类；根据探针的核酸性质不同：又可分为DNA探针，RNA探针，cDNA探针及寡核苷酸探针等；DNA探针还有单链和双链之分。

（1）DNA探针指长度在几百碱基对以上的双链DNA或单链DNA探针。多为某一基因的全部或部分序列，或某一非编码序列。通过建立基因组DNA文库；用PCR扩增产物制备探针。优点（包括cDNA探针）：①不易降解（相对RNA而言），一般能有效抑制DNA酶活性。②标记方法较成熟，有多种方法可供选择。（2）cDNA探针cDNA是指互补于mRNA的DNA分子。通过逆转录产生cDNA，克隆于适当的载体而使cDNA大量扩增。不含有内含子序列。尤其适用于基因表达的检测。（3）RNA探针RNA探针一般都是单链；与靶序列的杂交反应效率极高，比DNA-DNA杂交高几个数量级。（3）RNA探针可用于检测DNA和mRNA；用RNA探针进行RNA结构分析比用DNA探针效果好；要准确测定正向和反向转录水平就不能用双链DNA探针，只能用RNA探针或单链DNA探针。存在易于降解和标记方法复杂等缺点。

（4）寡核酸探针

采用化学方法合成的寡核苷酸片段。常用的寡核苷酸探针18～50bp。优点：

①可根据需要合成相应序列；②探针短,序列复杂性低，分子量小，因此杂交时间短;③识别靶序列内1个碱基的变化。④可大量合成，探针价格低廉。

（四）、标记物

（1）理想标记物应具备的特性：高度灵敏性；不影响碱基配对的特异性；不影响探针分子的主要理化性质；对酶促反应活性无影响或影响不大；检测方法具有高度灵敏性和高度特异性。（四）、标记物常用的探针标记物核素标记物：

3H、32P、35S、125I等。非核素标记物：荧光素、半抗原（地高辛、生物素）、配体等。

（2）、标记方法

体内标记法：

将核素标记的化合物作为合成代谢的底物，在细胞合成代谢时使核素掺入到新合成的核酸分子中。例如3H-胸苷可掺入到DNA中，3H-尿苷可掺入到RNA中。（2）、标记方法体外标记法：化学标记法：标记物分子上的活性基因与探针分子上的某些基因反应，标记物直接结合到探针分子上。酶促标记法：标记物预先标记核苷酸，然后利用酶促法将标记的核苷酸掺入到探针上。①硝酸纤维素膜：优点是杂交信号本底低，缺点是DNA分子结合不牢固。②尼龙膜：优点是结合单链，双链DNA的能力比硝酸纤维素膜强；缺点是杂交信号本底高。③化学活化膜：优点是DNA与膜共价结合；对不同大小的DNA片段有同等结合能力；缺点是结合能力较上述两种膜低。用于杂交的3种固相支持体

二、几种常见杂交技术二、印迹技术的类别及应用（一）DNA印迹技术(Southernblotting)

用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。（二）RNA印迹技术(Northernblotting)

用于RNA的定性定量分析。（三）蛋白质的印迹分析(Westernblotting)

用于蛋白质定性定量及相互作用研究。

根据杂交所用的方法,还可分为斑点(dot)杂交：狭槽(slot)杂交：原位杂交：（一）DNA印迹技术(Southernblotting)

也叫做Southern杂交，即DNA-DNA杂交分析。是研究DNA图谱的基本技术。主要用于基因组DNA、如在基因组中特定基因的定位及检测等。重组质粒和噬菌体的分析。在遗传诊断DNA图谱分析及PCR产物分析中具有重要的价值。（二）RNA印迹技术(Northernblotting)也叫做Northern杂交，即RNA-DNA杂交分析。是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转移到硝酸纤维素膜上的方法用于RNA的定性定量分析。（三）蛋白质的印迹分析(Westernblotting)也叫做Western杂交，或免疫印迹技术，即利用抗原-抗体反应，检测转移到硝酸纤维素膜上的特异的蛋白质，用于蛋白质定性定量及相互作用研究。三种印迹技术的比较

其他斑点印迹(dotblotting)原位杂交(insituhybridization)DNA点阵(DNAarray)DNA芯片技术(DNAchip)印迹技术的基本过程（1）制备样品

从待检测组织样品提取DNA或RNADNA或RNA经酶切消化酶切片段的电泳分离凝胶变性处理后转膜（2）制备探针

基因探针（probe）就是一段与目的基因或DNA互补的特异核苷酸序列，它可以包括整个基因，也可以仅仅是/基因的一部分；可以是DNA本身，也可以是由之转录而来的RNA或合成的寡核苷酸。（3）杂交预杂交：用非特异的核酸溶液封闭膜上的非特异性结合位点。杂交：由于转印在膜上的核酸分子已经是变性的分子，所以杂交过程中只需变性标记好的探针，再让探针与膜在特定的温度下反应，然后洗去未结合的探针分子即可。（4）检测检测的方法依标记探针的方法而异放射性同位素标记的探针：需要用放射自显影来检测其在膜上的位置；生物素等非同位素方法标记的探针：需要用相应的免疫组织化学的方法进行检测。印迹技术的应用研究DNA分子中某一种基因的位置确定两种核酸分子间的序列相似性检测某些专一序列在待检样品中存在与否是基因芯片技术的基础

第二节

PCR技术的原理与应用

PolymeraseChainReactionPCR技术（Polymerasechainreaction）

PCR（PolymeraseChainReaction）即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以DNA为模板，特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，在体外复制DNA的过程。是基于天然DNA复制的原理而设计的一种在体外由引物介导的DNA酶促合成反应，又称基因扩增技术。

5Primer15Primer2Cycle2Cycle1555555TemplateDNA55555555一、基本工作原理目录Cycle3555555555555555525～30次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。目录PCR产物以指数形式增加，即Y=2n

(n为循环次数)34×109PCR技术的基本原理

体外模拟DNA的体内复制

严格遵循碱基互补配对原则DNA体内复制与PCR的对比

模板聚合酶引物解旋解链体内复制DNADNAPolⅢ引物酶解旋酶解链酶PCRDNATaq人工合成DNA热变性模板DNA特异性引物耐热DNA聚合酶dNTPsMg2+

PCR体系基本组成成分引物（primer）是一小段单链DNA或RNA，是DNA复制的起始点，在核酸合成反应时，作为每个多核苷酸链进行延伸的出发点而起作用的多核苷酸链，在引物的3′-OH上，核苷酸以二酯链形式进行合成，因此引物的3′-OH，必须是游离的。引物设计原则引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与感兴趣区域一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与感兴趣区域另一端的另一条DNA模板链互补。

PCR引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成功，但遵循某些原则，则有助于引物的设计。1.引物长度一般在15-30碱基之间。引物长度常用的是18-27bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于TaqDNA聚合酶进行反应。2.引物GC含量在45%-55%间，Tm值最好近72℃.GC含量过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。3.上下游引物的Tm值（meltingtemperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于Tm值5-10℃。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55-80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。4.引物3′端要避开密码子的第3位。如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。5.引物3′端不能选择A，最好选择T。引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。6.引物自身及引物之间不应存在互补序列。引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构（Hairpin）使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物自身不能有连续4个碱基的互补。两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3′端的互补重叠以防止引物二聚体的形成。引物之间不能有连续4个碱基的互补。7.引物应具有特异性。引物设计完成以后，应对其进行BLAST检测。如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了。值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件比较困难，例如GC含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；用作克隆目的的PCR，因为产物序列相对固定，引物设计的选择自由度较低。在这种情况只能退而求其次，尽量去满足条件。三、PCR的基本反应步骤变性95˚C延伸72˚C退火Tm-5˚CPCR过程优点特异性强灵敏度高

模板量要求ng级水平操作简便快捷；对待检原始材料质量要求较低目的基因的分离和克隆基因的体外突变DNA的微量分析

病原微生物的检测

遗传病的检测

法医学（犯罪个体的认定；亲子鉴定序列测定基因突变分析PCR的主要用途几种重要的PCR衍生技术（一）反转录PCR技术（二）原位PCR技术（三）实时PCR技术实时PCR技术原理第三节

核酸序列分析

NucleicAcidSequenceAnalysisDNA测序的基本战略

设法产生带标记的不同长度的成套DNA片段，各带有标记的片段起点相同、终点不同，使待测的DNA链中的相应每个核苷酸处都有断裂或终止。通过PAGE电泳，能够将相差一个核苷酸的DNA片段分开，放射自显影后，根据长短排列，根据特定末端碱基的DNA片段就可读出待测DNA的碱基序列。

核酸序列分析的基本原理化学裂解法(Maxam-Gillbert法)DNA链的末端合成终止法(sanger法)一、化学裂解法(Maxam-Gillbert法)基本原理基于某些化学试剂可以使DNA链在1个或2个碱基处发生专一性断裂的特性，精确地控制反应强度，使一个断裂点仅存在于少数分子中，不同分子在不同位点断裂，从而获得一系列大小不同的DNA片段，将这些片段经电泳分离。分析前，用同位素标记DNA的5´末端，经放射自显影即可在X胶片上读出DNA链的序列。二、DNA链末端合成终止法目录DNA的

Sanger测序法

读出模板互补序列dNTP

凝胶电泳

较大片段

较小片段ddGTPddATPddCTPddTTP

反应混合物Klenow酶

未知序列的单链DNA

读出待测序列CTGACTTCGACAAAGAA5´3´

放射性标记的引物TGTTACTGddGddGddGddGGACTGAAGCTGTT3´5´CTGACTTCGACAA5´3´DNA自动测序采用荧光替代放射性核素标记是实现DNA序列分析自动化的基础。用不同荧光分子标记四种双脱氧核苷酸，然后进行Sanger测序反应，反应产物经电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离后，通过四种激光激发不同大小DNA片段上的荧光分子使之发射出四种不同波长荧光，检测器采集荧光信号，并依此确定DNA碱基的排列顺序。DNA自动测序结果举例引物标记法测序(DyePrimer)一个样本，4个反应。4个反应中引物序列相同，但分别标记有不同颜色的荧光。+AmpliTaqFSenzymedCTP,dATP,dGTP,dTTPddATP(terminator)+AmpliTaqFSenzymedCTP,dATP,dGTP,dTTPddCTP+AmpliTaqFSenzymedCTP,dATP,dGTP,dTTPddGTP+AmpliTaqFSenzymedCTP,dATP,dGTP,dTTPddTTP

反应结束后，将4管反应液混合，经乙醇沉淀后上样终止法测序(DyeTerminator)一个样本，1个反应。反应中包含分别带4色荧光标记的ddNTP(终止子)unlabeledprimertemplateDNA+AmpliTaqFSdATP,dCTP,dGTP,dTTPddCTPddATPddGTPddTTP

测序反应结束后，采用乙醇沉淀法进行纯化，除去过量的ddNTP后上样。测序技术进展

同位素标记到荧光标记,平板电泳到毛细管电泳

多色荧光标记毛细管电泳

单色荧光标记平板电泳同位素标记平板电泳ACGTACGT测序图谱TA

TTGCATTGTC

TGCATTGT

C

T基因文库

GeneLibrary第四节基因组DNA文库(genomicDNAlibrary)cDNA文库(cDNAlibrary)基因文库(genelibrary)是指一个包含了某一生物体全部DNA序列的克隆群体。文库构建的基本过程第一轮筛选第二轮筛选第三轮筛选基因组文库筛选结果举例第五节

生物芯片技术BiologicalChipTechnologyDNA芯片(DNAchip)cDNA芯片(cDNAchip)指将许多特定的DNA片段或cDNA片段作为探针，有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上，然后与待测的荧光标记样本进行杂交，杂交后用荧光检测系统对芯片进行扫描，通过计算机系统对每一位点的荧光信号做出检测、比较和分析。由于在制备过程中运用了计算机芯片的制备技术如显微光蚀刻、显微打印等，且常用硅芯片作为固相支持物，所以称为DNA芯片技术一、基因芯片(genechip)目录基因芯片技术原理大规模集成的固相杂交基本原理是核酸分子杂交，即依据DNA双链碱基互补配对、变性和复性的原理

以大量已知序列的寡核苷酸、cDNA或基因片段作探针，检测样品中哪些核酸序列与其互补，然后通过定性、定量分析得出待测样品的基因序列及表达的信息。生物战剂检测

临床疾病的基因诊断法医学鉴定药物研究开发动植物检疫

基因组研究后基因组计划生物信息学基因芯片基因芯片技术的应用领域是将高度密集排列的蛋白分子作为探针点阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白样品反应时，可捕获样品中的靶蛋白，再经检测系统对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。蛋白质芯片的作用原理：蛋白质分子间的亲和反应，如抗体-抗原或者受体-配体之间的特异性结合。蛋白质芯片(proteinchip)第六节

生物大分子相互作用研究技术ThemethodofProtein-proteinandProtein-DNAintraction酵母双杂交各种亲和分析（亲和色谱、免疫共沉淀等）荧光共振能量转换效应分析噬菌体显示系统筛选等等常用蛋白质相互作用的研究技术标签融合蛋白结合实验是一个基于亲和色谱原理的、分析蛋白质体外直接相互作用的方法。（一）标签蛋白沉淀标签融合蛋白结合实验主要用于证明两种蛋白分子是否存在直接物理结合、分析两种分子结合的具体结构部位及筛选细胞内与融合蛋白相结合的未知分子。标签融合蛋白沉淀实验流程示意图（二）酵母双杂交技术的基本原理和用途酵母双杂交系统的应用证明两种已知基因序列的蛋白质可以相互作用的生物信息学推测。分析已知存在相互作用的两种蛋白质分子的的相互作用功能结构域或关键的氨基酸残基。将拟研究的蛋白质的编码基因与BD基因融合成为“诱饵”表达质粒，可以筛选AD基因融合的“猎物”基因表达文库，筛选未知的相互作用蛋白质。电泳迁移率变动测定(electrophoreticmobilityshiftassay，EMSA)或称凝胶迁移变动实验(gelshiftassay)最初用于研究DNA结合蛋白与相应DNA序列间的相互作用，可用于定性和定量分析，已经成为转录因子研究的经典方法。目前这一技术也被用于研究RNA结合蛋白和特定RNA序列间的相互作用。二、DNA-蛋白质相互作用分子分析技术（一）电泳迁移率变动测定放射自显影未结合探针结合有蛋白的探针标记探针1X1X1X1X核蛋白提取物1X10X10X未标记探针10X凝胶迁移实验结果示意图染色质免疫沉淀技术(chromatinimmunoprecipitationassay,ChIP)是目前可以研究体内DNA与蛋白质相互作用的主要方法。（二）染色质免疫沉淀法染色质免疫沉淀实验流程及结果示意图遗传修饰动物模型的建立及应用TheEstablishmentandApplicationofHeredity-ModifiedAnimalModel第七节转基因技术采用基因转移技术使目的基因整合入受精卵细胞或胚胎干细胞，然后将细胞导入动物子宫，使之发育成个体。