第13章-流失细胞术

第十三章

流式细胞术

流式细胞术（flowcytometry，FCM）是对细胞或细胞颗粒进行定量分析和细胞分类研究的技术。流式细胞仪又称为荧光激活细胞分类器，是流体喷射术、激光光学技术、电子计算机技术和显微荧光光度术相结合的高科技产品。应用流式细胞术可对单细胞逐个地进行高速准确的定量分析和分类，每秒测定达数千到数万个细胞，且有高度的重复性。这种高速信息的测量分析和高纯度分类的新技术，为细胞生物学提供了一种强有力的研究手段。

第一节

基本原理

一、流式细胞仪的主要组件1．液流系统

包括各种管道、压力调节开关、液体流动室和超声振荡器喷嘴。单个细胞悬液在狭窄的管道中流动，由于细胞受流体力学的作用，极易形成贴边、堆积,从而造成阻塞。为克服此种现象，利用流体聚焦的原理，在不同的压力作用下使鞘液（通常用PBS）和细胞悬液在喷嘴内形成层流液束，通过细胞测量区。

2．光学系统

光学系统包括激发光源、各种光学滤片和各种光信号探测器。激光光源通常是采用激光器或汞灯等。激发光束激发细胞所携带的荧光物质产生荧光，通过光电转换器和光电倍增管把微弱的信号变成电的信号，光信号通过不同的滤片把不同波长的光信号分开，把干扰光滤掉。3．电子系统

电子系统包括各种放大器、模数转换电路、高压电源和各种分析处理辅助系统，还包括把不同细胞分离开来的逻辑控制系统。4．计算机系统

把从细胞获取的数据记录储存起来，利用各种不同的软件对数据进行分析加工处理，把结果以图、表的形式输出。

二、流式细胞仪的工作原理

流式细胞仪要求被检细胞用荧光染料染色，呈悬浮状态。经染色的细胞通过样品进入管被压进超声波振荡器喷嘴的中央部，同时将无细胞的液体经过另一进入管压入喷嘴，使之形成包围细胞悬液的鞘液（图13-1）。在鞘液和细胞悬液存在一定压力差的情况下，中央的细胞悬液和周围鞘液的分层液流快速通过50µm的喷嘴圆孔，被喷射出来。当同轴流动的细胞悬液和鞘液通过激光器发出的氩离子激光束照射小区时，单行流动的细胞发射出荧光，荧光检测器接受聚焦后的荧光信号。

多数流式细胞仪可以同时收集两种以上不同波长的荧光信号，检测细胞膜表面或细胞内荧光分子的数量。散射光检测器则接受细胞散射偏转后的激光束信号，此信号可反映细胞的物理化学特性、大小、数量和类型。前向角散射强度信号与细胞的大小有关。散射光强度信号则反映细胞内部结构，即流式细胞仪可以同时收集两个方向散射光的信号。两种光检测器所产生的信号，经过电子系统的处理，产生脉冲，并使测量过的细胞在形成微滴时，带上不同的电荷（充电）。

当充电微滴通过带有恒定静电压的偏转板时，带正电荷的细胞微滴在静电场作用下落入左方的细胞收集器，而带负电荷的细胞微滴落入右方的细胞收集器，不带电荷的细胞微滴落入中央的容器中，从而实现细胞分选的目的。这种分类技术能以每秒高达5000~10000个细胞的速度分类细胞，纯度在90%~99%之间，细胞活性在通过仪器过程中不受影响。流式细胞仪仅对悬浮细胞进行分析和测量，并进行统计学分析，但无法得到细胞的形态学以及多种动力学功能参数，尤其不能满足细胞的解剖定位研究。第二节

单细胞悬液的制备

流式细胞术所得结果好坏首先取决于细胞样品处理制备方法的优劣。所以，要保证细胞在制备过程中和储存期间细胞表面和细胞内部的成分不被破坏和去失，特别是要分析的那些成分。

一、单层细胞培养

使用标准培养技术，单层生长的细胞容易分离。单层细胞用PBS或Hanks平衡液加0.25%Trypsin洗，当细胞变圆时（在倒置显微镜下观察），倒出Trypsin液体后用手拍打振动培养瓶使细胞脱落，然后加入缓冲液摇动培养瓶并用细管取出含有细胞的上清液。

二、组织从新鲜组织制备单个细胞悬液，有的比较容易，例如淋巴结组织用注射器反复抽吸几次即可得到足够量的细胞；有的就比较困难，常要用机械分散和酶消化相结合的方法处理，如肝、睾丸用酶消化处理很容易得到单个细胞。但睾丸生殖细胞胞质之间桥接引起相邻细胞溶解，形成人为的称为合胞体的多核假象。很难与DNA含量和体积上相似的单个细胞区分开。神经细胞的处理参见细胞培养。

三、血细胞制备方法（一）全血溶解技术通过选择性的溶解红细胞，获得外周血中单个核细胞和多形核细胞。1．试剂

氯化铵溶解缓冲液pH7.3。细胞洗涤缓冲液：不含钙镁的Hanks平衡盐液或1×PBS缓冲液。2．方法

（1）取0.5~1ml用肝素或EDTA抗疑的外周血，加入15ml离心管内，加20倍于血体积的氯化铵溶液混匀，室温下溶解8~l0min（红细胞完全溶解应为透明红色）。（2）180g离心5min，小心吸出上清，然后把沉淀的白细胞用细胞洗涤缓冲液洗两次，80g离心5min。吸出上清，再把细胞悬浮在冷的缓冲介质中备用。

（二）梯度-密度离心分离法该方法可离出单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）。1．材料

淋巴细胞分离液；PBS缓冲液。2．方法

（1）所用试剂预热到25℃以获得正确的密度。（2）取5ml外周血用肝素或EDTA抗凝，并加等体积的PBS稀释混匀。加2ml淋巴细胞分离液到圆锥形离心管的底部，用吸管取5ml用PBS稀释的抗凝血小心地放到淋巴细胞分离液液面上，注意不要使之混合。

（3）室温下400g离心20min，使离心管自行缓慢停下，不要用力强迫离心停车。丢弃血浆，用细尖长吸管吸出含有单个核细胞的淡黄色层，置另一个离心管内。

（4）加10mlPBS600g离心10min，洗两次。把细胞在悬浮在2ml的PBS中备用。

四、石蜡标本制备单细胞悬液

（1）修块：切去多余的坏死组织和基质组织。切5片50µm厚蜡片标本放在一个10ml的试管里。

（2）脱蜡：加入5ml二甲苯，10min×3次。

（3）水化：100%乙醇5~10min×2次；95%乙醇5~l0min×2次；70%乙醇5~10min×2次；50%乙醇5~10min×2次；蒸流水洗5min×3次，丢弃蒸流水。（6）消化：加入5ml0.5%胃蛋白酶消化液（生理盐水配制）37℃保温30~50min，每隔10min振荡一次。用镊子或玻璃棒取出未消化完的组织，并加等量生理盐水终止酶的作用。经50µm尼龙网过滤。

五、细胞固定

固定的目的是使细胞或组织硬化足以承受包埋和切片的处理。固定也使得细胞膜变得通透，使染料能够进入，获得最佳染色效果、并通过抑制微生物作用和自溶保护细胞样品。作为流式细胞术，细胞以悬浮状态使用，常用的固定剂有乙醇、甲醇、甲醛和戊二醛等。DNA定量分析细胞多用乙醇固定，免疫表型分析常用甲醛和多聚甲醛等固定以保护细胞膜表面的特异标志物。

1．乙醇固定

常用75%乙醇。用无钙镁的PBS配制，4℃冰箱中保存。将洗过的细胞用0.5mlPBS悬浮起来，用加样器或吸管把细胞悬液喷射入5ml75%冷乙醇中。将容器口密封，4℃冰箱贮存，时间不少30min。2．免疫染色后的固定

对细胞表面抗原进行免疫标记染色后，如果不能立即进行FCM分析，可用下列方法固定保存：

（1）在细胞免疫标记染色完成细胞洗涤后，加入3%的甲醛，细胞摇匀后4℃冰箱保存。24h之内分析，其荧光强度不变。（2）用0.5%的多聚甲醛摇匀固定，4℃冰箱保存，一周内荧光强度基本不变。第三节

细胞的荧光标记

流式细胞术对细胞的分析一是分析细胞产生的散射光信号；二是分析细胞所产生的荧光信号。细胞的荧光是由一些能够定量的荧光染料与细胞内的特有成分结合，或经抗原抗体反应使荧光染料与细胞间接结合，经激光照射产生的。本节主要介绍荧光染料直接与细胞内部特有成分结合定量分析的荧光标记方法，如DNA、RNA、蛋白等。

一、常用荧光染料在流式细胞术中使用的荧光染料可分两大类：一类是染料生物大分子基团，如免疫球蛋白，再与细胞发生免疫反应，使染料分子间接地连接到细胞上（表13-1）；另一类是直接与细胞内特异成分相结合的染料，它们之间有非常好的线性关系（表13-2）。在实验过程中，应根据仪器的实际情况，例如激发光源的种类、滤光片的配置以及本实验室所具有的条件，来选择适合于自己使用的荧光染料。表13-1对抗体和其他配体分子共价标记的荧光染料----------------------------------------------------------------------荧光染料分子量吸收峰值发射峰量子产额----------------------------------------------------------------------FTTC3904955250.5TexasRed6255966150.51PE240K490~5805700.8----------------------------------------------------------------------表13-2检测细胞内特异成分常用的荧光染料--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------荧光染料分子量结合方式结合位点激发波长nm荧光发射峰值nm用途--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------PI668嵌入无493630DNAEB394嵌入无482616DNAMI1069嵌入G-C320,445575DNACA31183非嵌入G-C320,445575DNAHo33258624非嵌入A-T343480DNAHo33342615非嵌入A-T343483DNADAPI350非嵌入G-C345