药物代谢课件

药物代谢大纲药物代谢反应简介影响药物代谢的因素代谢稳定性代谢产物的鉴定代谢途径鉴定CYP450的抑制及诱导肝清除率的预测药物代谢反应简介

Introductionofdrugmetabolismreaction药物代谢反应的分类一相代谢二相代谢一相代谢反应氧化反应（CYP450催化）芳香族羟化（Aromatichydroxylation）脂肪族羟化（Aliphatichydroxylation）环氧化（Epoxdation）脱烷基（Dealkylation）氧化脱氨基（Oxidativedeamination）氮氧化（N-Oxidative）硫氧化（S-Oxidative）脱卤素（Dehalogenation）氧化反应（非CYP450催化）醇脱氢（Alcoholdehydrogenase）醛氧化（Aldehydeoxidatiion）黄嘌呤氧化（Xanthineoxidase）胺氧化（Amineoxidase）芳香化（Aromatase）还原反应偶氮化合物，硝基化合物环氧化合物杂环化合物，卤代烃水解反应酯水解氨基化合物水解酰胺水解其他一相代谢反应水合一相反应概述大部分情况下代谢产物含有具有化学反应性的官能团，例如：-OH，-NH2，-SH，-COOH等为进一步的二相代谢做准备二相代谢反应与糖结合同葡萄糖醛酸结合同酚，醇及羧酸结合（O-Glucuronides）同胺，酰胺及磺胺结合（N-Glucuronides）同其他糖类结合葡萄糖（主要在昆虫中）木糖核糖磺酸化主要底物为酚类辅助因子为PAPS甲基化主要底物为内源性物质辅助因子为SAM乙酰化主要底物为芳香胺，磺胺辅助因子为乙酰辅酶A同氨基酸结合同谷胱甘肽结合同脂肪酸结合二相反应概述需要富能/活化中间体（辅因子/活化的药物）产物水溶性大一般为药物的解毒步骤影响药物代谢的因素

Factorsaffectdrugmetabolism药物代谢受许多因素的影响内因（种属，基因，年龄，性别，激素及疾病）外因（饮食，环境，合并用药）影响代谢的内部因素种属不同种属中的代谢速度不同不同种属中的代谢途径不同基因不同品系动物间的差异CYP2D6的多态性快代谢及慢代谢型的代谢速率有差异不同人群中的分布比例具有差异年龄新生及幼年阶段代谢酶发育不完全老年阶段代谢酶活性下降一相代谢情况复杂二相代谢酶一般在胚胎期缺失或者活性低，出生后活性逐渐加强，在生命早期达到成年水平，并在老年阶段变化不大。激素水平/性别疾病状态肝脏疾病肝硬化，病毒性肝炎，肝癌：代谢能力下降酒精肝：代谢能力上升非肝脏疾病激素相关疾病：甲亢，糖尿病等影响代谢的外部因素营养物质蛋白质摄入不足导致一相代谢能力下降二相代谢能力变化复杂脂肪摄入不足导致代谢能力下降补充不饱和脂肪酸能提高代谢能力高脂饮食对不同组织的影响不同碳水化合物对代谢影响不大饥饿导致部分酶活性上升，部分下降总体来说上述物质对代谢能力有很大的影响，但结果预测很难非营养物质环境因素重金属（铅）大鼠慢性暴露：对代谢能力影响不大大鼠急性暴露：代谢能力下降环境污染物（多氯联苯）诱导代谢能力杀虫剂（灭蚊灵，开蓬）代谢稳定性Metabolicstability概述代谢稳定性在具有代谢活性的实验体系中原型药随时间所减少的百分比实验体系肝微粒体，S9，肝细胞检测方法HPLC,LC/MSMS实验体系肝微粒体不含胞浆酶，eg单胺氧化酶，谷胱甘肽转移酶需要辅助因子，egNADPH，UDPGA多用于高通量筛选肝细胞原代肝细胞，冻存肝细胞包含所有酶活性，无需添加辅助因子多用于定性研究S9包含了微粒体酶及胞浆酶但不具备细胞结构S9/微粒体的制备S9的制备流程缓冲液：1.15%KClin0.05MTris-HCl(pH7.4)断头处理动物，取肝脏加入缓冲液（4倍湿重），制备肝匀浆9,000g离心30min，取上清肝微粒体的制备流程S9105,000g离心1小时弃去上清液沉淀用0.1M

蔗糖在悬浮微粒体/S9孵育体系体系组成终浓度缓冲液系统PBS,Tris(pH=7.4)微粒体0.1-1mg/mL辅助因子NADPH/UDPGA底物37ºC条件下孵育肝细胞培养体系体系组成终浓度培养液CedraCompleteMedia肝细胞1-2*106cell/mL辅助因子N/A底物37ºC，相对湿度95%，CO25%条件下孵育同时进行对照组的孵育不含药物（空白对照）不含S9/微粒体/肝细胞（考察化学稳定性）含代谢过程已知的药物（考察酶活性）样品检测样品前处理孵育/培养结束后加入含内标的终止液，离心，取上清进样分析样品分析原型药（主要关注点）代谢物示例参数的计算T1/2底物浓度固定，测定不同时间点原型药的浓度对数化后回归求得CLint不同底物浓度，测定同一时间点代谢产物的浓度CLint=Vmax/Km注意事项系统中有机溶剂的浓度避免使用有机溶剂甲醇乙腈<2%;DMSO<0.4%NADPH生成系统/待测药物的稳定性现配现用缓冲液的pH值保存后需再次测定pH确保肝微粒体均一加入前充分涡旋代谢产物鉴定Metaboliteprofiling实验流程样品孵育S9，肝微粒体样品处理SPE，PP,LLE代谢产物的测定/鉴定HPLC,LC/MSMS,NMRS9孵育体系组成组成终浓度Tris-HCl50mMMgCl25mMGlucose-6-phosphate5mMNADP0.5mMS94mg/mL孵育体系的总体积一般为5mL加入少量（5-50uL）药物溶液启动反应药物的终浓度在1-10ug/mL或1-10uM在各时间点取出部分样品，加入等量冰乙腈终止反应。该体系主要产生一相代谢产物微粒体孵育体系组成组成终浓度Tris-HCl50mMMgCl25mMGlucose-6-phosphate5mMNADPH/UDPGA0.5mM肝微粒体4mg/mL辅助因子为NADPH主要生成一相代谢产物辅助因子为UDPGA长时间孵育可生产葡萄糖醛酸结合产物代谢产物鉴定的样品处理直接沉淀蛋白有机溶剂萃取乙酸乙酯，二氯甲烷固相萃取代谢产物的鉴定HPLC法推定结构梯度洗脱检测原型药及代谢产物收集流份MS/HMR结构鉴定放射性标记后可进行对原型药及代谢产物进行初步的定量分析LC/MSMS法推定结构检测总离子流图MSn鉴定结构TOF鉴定结构注意事项混合人肝微粒酶活性有较大差异除缓冲液外的其他组成应现配现用雄性大鼠S9/微粒体中CYP450的活性大于雌性大鼠对于每批S9/肝微粒体应有对照药物组来证明其活性根据药物溶解性选择溶剂缓冲液>甲醇>DMSO通过加入有机溶剂，并保存在-20ºC条件下来迅速中止反应许多情况下S9优于微粒体便于制备，总活性较强无需添加NADPH能够生成乙酰化代谢产物代谢途径鉴定Metabolicpathwayidentification概述了解药物代谢途径的重要意义尤其对于通过单一酶进行代谢消除的药物影响药物的安全性和有效性指导个体化的给药剂量避免合并用药时可能发生的不良反应超过60%的药物的代谢是由CYP450催化的一相氧化反应葡萄糖醛酸化反应是最主要的二相反应CYP450代谢途径鉴定CYP450简介主要存在于肝脏的微粒体中,故也称为肝微粒体酶（也有肝外分布）因其还原型与一氧化碳的复合物（P450-CO）在450nm处有一强吸收峰,故而得名细胞色素P450在人体中至少有53个分属于18个家族的CYP450基因其中CYP1，CYP2及CYP3家族为主要参与外源性物质代谢肝中各主要亚型的比例CYP450酶的特点几乎能够代谢所有结构的药物同一药物能够被多个亚型所代谢与一般酶相比，反应速率较慢鉴定代谢途径的方法抑制剂法（化学抑制剂/抗体）纯酶法（重组酶）相关回归法抑制剂法实验流程酶动力学试验加入特异性抑制剂进行共孵育考察有无抑制剂存在时反应活性的差异CYP450各主要亚型的抑制剂其中2C19及2E1的抑制剂特异性不强，推荐使用抗体注意事项酶动力学试验中确保底物消耗小于10%底物浓度的选择（Km附近）抑制剂的选择（高特异性）抑制剂的浓度（有效前提下尽量低）研究示例19份HLM中2C9抗体对X药代谢活性的影响纯酶法实验流程获得商业化供应的各亚型的纯酶各亚型的纯酶重进行孵育观察不同亚型的纯酶中底物的剩余率所得的Km需要同HLM中的Km进行比较rCYP>HLM：体内可能无贡献rCYP<HLM：低浓度时的主要代谢亚型回归分析法实验流程进行待测药物的孵育进行探针药物的孵育将同一份孵育体系中探针药物与待测药物的反应速率进行回归也可以将药物代谢产物生成速率同特定CYP450亚型在肝脏中的含量/mRNA水平等进行回归基本原理是基于不同CYP450亚型在个体间表达的差异研究示例注意事项必须了解酶动力学过程单一酶催化：底物浓度应该能够达到Vmax多个酶催化：底物浓度接近生理浓度肝微粒体的筛选去除对于各亚型探药有相关性的肝微粒体所有用于相关性回归的肝微粒体中各亚型探药的R2<0.3用于回归分析的肝微粒体数量至少10个，最好20个相关系数良好，但在Y轴有较大的正截距说明有其他酶参与代谢CYP1A2及2D6均能催化该反应，对该反应的活性同CYP1A2探药反应活性进行回归分析。UGT代谢途径鉴定UGT简介是体内最主要的二相代谢酶主要功能包括：结合一些内源性物质（胆红素，固醇类物质）结合一些药物及其一相代谢产物人肝中UGTs各亚型代谢药物的比在人肝中UGT1A1、1A4、1A6、1A9和2B7为最主要的UGT亚型上述五种亚型催化了90%以上药物的葡萄糖醛酸化代谢鉴定代谢途径的方法孵育体系组成终浓度Tris/PBS50-100mMUDPGA5mMMgCl25mM微粒体/重组酶0.5-1mg/mL水解酶抑制剂可选孵育条件的优化孵育过程中底物消耗不得超过10%在确保反应呈线性的条件下（时间，蛋白浓度），取最低的底物浓度体外孵育条件下UGTs的稳定性强于CYP450避免使用较高的蛋白浓度采用Saccharolactone(2–10mM)抑制水解反应采用Alamethicin增加底物接触酶活性位点的几率维持pH在生理范围（7.0-7.5）确保UDPGA，MgCl2处于饱和状态代谢产物的确认水解酶孵育后测定碱水解（acyl-glucuronides）酸水解（N-glucuronides）重组酶法鉴定代谢途径rUGTs活性筛选对所有亚型进行孵育使用2个底物浓度（Km及10*Km）当有超过1个亚型表现出活性时需要结合其在肝脏中的相对丰度来判断哪个是主要亚型mRNA：2B4>1A3>1A4>2B15>1A6>2B7>2B17>1A9>1A1酶动力学比较分析参加比较的亚型：具有最强活性-10%最强活性rUGT>HLM(亲和力低)：体内无贡献rUGT<HLM(亲和力高)：低浓度时的主要代谢亚型（临床相关）回归法鉴定代谢途径不同HLM中各UGT亚型表达有差异将待测药物与探针药物的反应活性进行回归分析具有最高相关性的亚型即为代谢该药物的主要亚型底物浓度设在混合肝微粒体中的Km值附近孵育条件下下表抑制剂法鉴定代谢途径化学抑制剂法到目前为止关于其制剂作用的特异性均未经过系统的评价需要在HLM及rUGT中同时进行试验特异性的抑制作用在HLM及单个rUGT中的抑制作用相等非特异性的抑制作用有多个rUGT中的抑制作用相同，或者其它rUGT亚型表现出比应该出现抑制作用的亚型的抑制作用还要强免疫抑制法理论上可行目前没有商业化的抗体供应CYP450的抑制及诱导Inhibition&inductionofCYP450CYP450抑制作用研究合并用药导致药物相互作用发生率增加对CYP450的抑制是造成DDI的主要原因抑制可能导致药物中毒基本流程选择探针药体现各亚型的活性酶动力学实验抑制作用实验（共孵育）测定代谢产物的浓度数据分析主要CYP450亚型的探针药酶动力学试验不同肝微粒体及试验体系中同一探针药的Km会有较大的差异故需要针对特定的试验体系进行酶动力学研究测定相同时间点不同底物浓度下特异性代谢产物的浓度计算反应速率用米曼氏方程对底物浓度及反应速率进行拟合（GraphPad），求算Km抑制作用试验试验分组空白对照物（不含探针药/NADPH）阴性对照组（不含受试物，100%活性）阳性对照组（含已知抑制剂）受试物组（含不同浓度的受试物/探针药）受试物的抑制作用可以通过测定其IC50或者是Ki来进行评价IC50实验中探针药的浓度一般设在Km值附近代谢产物的测定采用LC/MSMS测定代谢产物的浓度数据分析计算各组中相对于阴性对照组的剩余反应活性将剩余反应活性同受试物浓度进行非线性拟合计算IC50（GraphPad）将剩余反应活性同受试物浓度及探针药浓度进行非线性拟合计算Ki（GraphPad）很可能（likely）/高风险（highrisk）Ki<1μM或I/Ki>1可能（possible）/中风险（mediumrisk）1μM<Ki<50μM或0.1<I/Ki<1不太可能（unlikely）/低风险（lowrisk）Ki>50μM或I/Ki<0.1不同类型的抑制作用可逆性抑制直接竞争酶的活性位点酶活性能够在抑制剂耗尽后完全恢复不可逆性抑制不可逆的同酶的活性位点结合需要合成新酶后活性才能恢复可逆性抑制Competitiveinhibition抑制剂同游离态酶结合Noncompetitiveinhibition抑制剂同游离态酶/底物酶复合物结合Uncompetitiveinhibition抑制剂同底物酶复合物结合CompetitiveinhibitionNoncompetitiveinhibitionUncompetitiveinhibition不可逆抑制Nonspecificaffinitylabels（非特异性亲和）一般来说具有亲电性，能够同具有亲核性的蛋白组成共价键Quiescentaffinitylabels（静态亲和）具有弱亲电性，同时具有能够同酶进行可逆性结合的Mechanism-BasedInactivation（自杀性抑制剂）本身不具备活性，其产物可以作为affinitylabels，过渡状态的类似物，亲和力极高的可逆性抑制剂反应机制的区别单步反应：Nonspecificaffinitylabels双步反应：QuiescentaffinitylabelsMechanism-BasedInactivation选择性/成药性Affinitylabels类普遍缺乏选择性不仅与酶发生作用，也同各类蛋白发生作用选择性：Quiescentaffinitylabels>NonspecificaffinitylabelsMechanism-BasedInactivation有很强的选择性CYP450诱导作用研究诱导可能导致药物失效需要有完整的细胞结构来实现诱导一般采用肝细胞作为实验体系反映在基因表达，蛋白表达及酶活性水平基本流程肝脏灌流分离肝细胞细胞培养及处理细胞收获肝脏灌流通过门静脉进行灌流使用医用粘合剂封闭肝表面的其余血管由低到高增加灌流速度（100-500mL/min）用加氧的PB-1灌流10-20min在PB-2中加入胶原酶用加氧的PB-2灌流10-20min缓慢降低灌流速度将消化后的肝脏放置在灭菌容器中分离肝细胞（无菌操作）在消化后的肝脏中加入DMEM+，浸没75-100%的组织用无菌手术器械撕碎外膜以释放肝细胞过滤并分装，室温下40-60g离心3min弃去上清，加入DMEM+再悬浮沉淀以8:1:1的比例稀释（PBS:0.04%Trypanblue:稀释细胞液肝细胞计数加入等渗的细胞分离液至其终浓度为15-25%，倒置数次以混匀室温下40-60g离心5min弃去上清，加入DMEM+再悬浮沉淀肝细胞计数肝细胞的培养及处理（无菌操作）用DMEM+将肝细胞稀释至1-2*106/mL每孔加入3mL，放置2-3h使其贴壁（37度）移除未贴壁的细胞（出去培养液）加入3mLMCM+(含0.2-0.3mg/mLMatrigel)继续进行孵育（37度，95%/5%空气/CO2）在12-24h内更换MCM+(不含

Matrigel)每日换液（MCM+）培养2-3天后，若细胞表现出近似正常的形态学即可用于诱导试验加入含有受试物的MCM+每日换液连续2-3天细胞收获（无需无菌操作）在处理结束后收获细胞弃去培养液，用PBS冲洗（每孔0.25-1mL）去除剩余的PBS所得细胞可以制备微粒体/S9测定mRNA，测定酶活性注意事项封闭所有肝脏的切口以提高灌流效果为提高细胞培养的存活率及贴壁，孔中需要包被有胶原层DMSO为常用溶剂，但其会诱导3A4；体系中其浓度应控制在0.1%之内NME的CYP各亚型的体外代谢信息NME不被代谢或没有主要的代谢途径NME被代谢，有主要代谢途径NME是诱导剂或抑制剂，或者没有体外资料NME不是诱导剂或抑制剂用可能的抑制剂或诱导剂进行体内研究用可能的底物进行体内研究有没有有没有用可能合用的抑制剂或诱导剂进行研究用可能合用的底物（尤其是治疗系数窄的）进行研究有有没有没有调整剂量调整剂量预测肝清除率Predictionofhepaticclearance目的意义寻找口服生物利用度好/半衰期长的药物在新药开发的早期通过体外实验及动物实验预测人体中的CL，降低研发成本同半衰期的关系对于血管外给药二室模型的药物同生物利用度的关系总清除率同药物的清除及生物利用度直接相关总清除率为各器官清除率的总和CLtotal=CLhepatic+CLrenal+…对于完全由肝脏代谢的药物CLtotal=CLhepatic肝清除率直接决定了肝脏利用度（FH）QH为肝脏血流速度F:生物利用度Fabs:吸收部分FG:肠道利用度研发阶段一般致力于寻找低CLH的药物此类药物的生物利用度较好，半衰期较长根据药物在肝脏的分布情况，有不同的数学模型来描述CLHWellstirredmodel药物在肝脏中分布的无限均匀Paralleltubemodel药物在肝脏中仅分布在非常有限的区域Dispers