植物组织培养实用技术

植物组织培养实用技术花卉组织培养实用技术(以非洲菊为例)非洲菊组织培养技术非洲菊属多年生草本花卉。重瓣花，花色有红、橙红、淡红、白色，花色艳丽，可用作切花生产或盆栽观赏。传统的繁殖方法为播种或分株繁殖，但非洲菊种子寿命短、发芽率低，而且播种繁殖变异率很高，难以得到性状一致的种苗，因而不能用于规模生产；而分株繁殖则存在繁殖慢，易退化和传播病害，也不适于现代的大规模生产，因而目前国外一般都采用组织培养的方法来生产种苗。一．外植体的选择

1、文献资料综述茎尖是一种较好的外植体，出愈率最高、繁殖速度快，但取材有限、灭菌很易产生药害。幼叶、幼叶柄、花梗作为外植体，可诱导产生愈伤组织，但是诱导成苗难。花托是非洲菊组织培养中比较理想的外植体，其好处在于花托较大，易于剥取，并有花被包裏，污染程度轻，易于消毒，污染率低首先要选择花大、花色艳丽、市场流行的品种，然后再选择无病虫害、植株生长健壮、花色纯正的优良品种单株进行取材。作为外植体的花蕾要选取直径在1.0cm左右，而且未露心的小花蕾，太大或是太小的花蕾均不能获得满意的效果。2外植体的选择方法

二．外植体的消毒方法1

1、剥去外层萼片，在自来水下冲洗干净

2、置0.15%的升汞溶液中浸泡12~15分钟

3、取出后剥去外部所有萼片,在1%的次氯酸钠溶液中消毒10分钟

4、放入无菌水中充分洗涤3次方法21、剥去外层萼片，在自来水下冲洗干净

2、置70%酒精浸泡30秒

2、用0.1%升汞加数滴吐温浸泡5～8分钟

3、无菌水冲洗6～7次三．外植体的原代培养1、将灭菌后的花蕾外植体，剪成1.0cm长的小段2、在超净工作台上用0.1%氯化汞（HgCl2）对外植体进行表面消毒6~8min，小心倾去氯化汞溶液3、用无菌水冲洗6~7次4、接种在MS+BA1㎎/L+IAA0.5mg/L诱导芽培养基上四．试管苗的增殖与继代培养培养6~7周以后，愈伤组织上陆续有小芽分化，此时将带有小芽的愈伤组织切成2~4个小块，分别移到MS+BA0.2～1㎎/L+NAA0.2mg/L﹢KT0.3mg/L诱导芽培养基上。培养一段时间后，又有小芽陆续分化。培养4周后，把这些继代培养的芽丛分割，并移到新鲜的培养基上。每次继代培养时间约为4周，芽丛的发生力可保持半年左右。在每次继代前，高于3cm的小苗转入培养基：1/2MS+BA1mg/L上，可促进幼苗迅速长大。注意1、在初级培养和继代培养时，降低MS中的氮素营养会导致芽的发生率降低，铵态氮和硝态氮之比为1：2时对非洲菊芽的增殖最好。2、随BA浓度的提高，增殖速度相应提高。但在较高的BA浓度条件下芽苗会变细、变弱，且随BA浓度进一步提高，芽苗变得更加丛生、细弱。3、生产中在努力提高芽苗增殖率的同时，还应保证分生芽苗的健壮。根据品种不同,一般把增殖率控制在2.5-5.0之间。五．试管苗的壮苗与生根将长高的无根苗(2～3㎝)转移到生根培养基，诱导根培养基：1/2MS+NAA0.1mg/L。7～8天后，小苗基部会长出3～5条不定根，12～15天就可以出瓶，生根率达到95%以上。附加蔗糖30mg/l、琼脂7g/L,pH6.0。培养温度25~27℃，光照12～14小时，光照强度2000lx。在无糖的MS培养基上,植株生根快,且生根率高。无糖或低糖培养所生根系发达，呈白色，试管苗过渡成活率高。糖的浓度以0～1.5%为好,低盐培养基生根效果较好。六．试管苗的移栽与田间管理欲移栽的组培苗先去掉瓶盖通风炼苗，3天后将生根苗洗净根部附着物，移入温室内的珍珠岩+腐殖土（1：1）基质中，继续训化一周内保持遮光80％和适当的湿度，湿度以60%～70%为宜，温度15～25℃。一周后，适当增加光照，且每周淋一次无机液肥。在2周内保持较高的空气相对湿度，3周时幼苗长出白根，新叶抽出。一个月左右长出4片新叶，株高6～8厘米，可大定植或上市出售，移栽成活率97%。草莓组织培养技术草莓属多年生草本植物，植株矮小。草莓的茎呈短缩状，地上短缩茎节间极短，节密集。地下短缩茎为多年生，可发育成不定根。叶属于基生三出复叶，离生雄、雌蕊离生。果实为假果，主要是花托膨大肉质化形成，瘦果以聚合果形式生于花托上。果实成熟时果肉红色，粉红色或白色。一、外植体的选择选择结果性优良的草莓母株上新抽出的匍匐茎作外植体，以每年6～7月份最为适宜。在无病虫害的田块，连续晴天3～4d时选取生长健壮、新萌发且未着地的匍匐茎段3cm长作外植体。二、外植体的消毒消毒步骤①用洗涤灵水溶液洗去材料表面的油质②用70％的乙醇浸泡数秒以除去表面的蜡质③用3％的次氯酸钠溶液浸泡消毒15～30min，然后用无菌水冲洗3次把芽放在解剖镜下，无菌条件下，用镊子、刀片、解剖针等工具把芽外面的幼叶和叶原基除去，使生长点暴露。用利刀切下含有1～2个叶原基，大小为０.5mm的生长点。三、外植体的原代培养茎尖分离后，迅速接入MS+6BA０.5mg／L+IBA0.1mg／L原代培养基中。培养条件为22～25℃，日照16～18h/d，光强3000Lx。注意在低温和短日照下，茎尖有可能进入休眠，所以较高的温度和充足的光照时间必须保证。经2～3个月的培养，可生长分化出芽丛，一般每簇芽丛含20～30个小芽为适。四、试管苗的增殖与继代培养把芽丛割成芽丛小块，转入MS+6－ＢＡ１mg／L培养基中，令其长大，以利分株，待苗长大到1～2cm时，可将丛芽分成有3～4个芽的小芽丛，再转入前述的分化培养基中，又会重复上述过程，达到扩大繁殖的目的。经过3～4周的增殖培养可获得由30～40个腋芽形成的芽丛及植株。五、试管苗的生根与练苗生根培养基为1/2MS+IBAl.0mg／L，可使发根整齐，由于草莓地下部分生长快，发根力较强，也可将具有两片以上正常叶的新茎从试管中取出进行试管外生根。健壮的生根苗，应将芽丛切割开，单个芽转接到专门的生根培养基中生根，培养4周后，可长成约4--5cm高并有5～6条根的健壮苗。温度保持在23℃左右，光照度2000Lx，12h光照。试管苗驯化时，用镊子把草莓苗从试管瓶中取出，洗掉根系附带的琼脂培养基。培养土以等量的腐殖土和河砂为好，用蒸汽消毒。在温室内驯化，栽前压实，浇透水，用竹签在钵中央打一小孔，将试管苗插入其中，压实苗基部周围基质，栽后轻浇薄水，以利幼苗基部和基质密合。以后每天叶面喷水3~4次，4~5d就成活，展开新叶。当检查有一定的根系生出，可逐渐降低湿度和土壤含水量，进入正常幼苗的生长发育管理阶段。六、试管苗的移栽与田间管理为提高母株的繁殖株数可采用5mg/L赤霉素,每株5ml处理和摘蕾的方法。在5月上旬和6月上旬分两次进行。摘蕾可减轻母株的营养负担，促使匍匐茎的大量发生，田间地每一株可繁殖150～200株。母株必须保证每株有大于3.3m2的营养面积。再是注意匍匐茎排列位置，不要交错重叠，不利采苗，采苗也要适时进行。无论秋季或春季种植，繁殖床必须要进行土壤消毒，小面积可用蒸气剂料混合消毒，可防治草莓萎缩病、根腐病、萎凋病等的发生。

龙牙百合组织培养技术龙牙百合属百合科、百合属、百合种，药食兼用，是上等的滋补佳品，栽培经济效益好。百合繁殖方法主要有分球繁殖、鳞心繁殖、鳞片繁殖等，但经多代无性繁殖以后，导致病毒积累、种性退化，严重地制约着百合产量和质量的提高。利用组织培养与脱毒技术相结合，能够迅速去除无性繁殖体内病毒，复壮品种，并可加快百合的快速繁殖速度。龙牙百合特征:鳞茎，无皮，广卵形，外部鳞片长,将整个鳞茎包裹，直径5~15厘米，白色，茎高90厘米左右，直立茎上叶多而散生，披针形，叶色从浓绿，光滑。花单生茎顶。花朵呈喇叭状长筒形，白色，有清香。一、外植体的选择龙牙百合的许多器官、组织都可作为外植体，如鳞片、花梗、叶片、茎尖、腋芽、花瓣、花托、花丝、花药、胚、子房、根尖等，其中采用鳞片作外植体的较多。以鳞片为例，在选取外植体时，要选择具备龙牙百合品种特征、无病虫害危害的种球。外部鳞片易污染要将其剥离，中部鳞片肉质厚，生长势强，易诱导小鳞茎，是最佳的外植体。内部鳞片幼嫩，诱导率低，不易产生小鳞茎，故不宜采用。就季节性而言，以秋、冬季的鳞片分化成小鳞茎的能力最强，二、外植体的消毒由于龙牙百合鳞茎都生长在土中，受土壤微生物的影响，所以一般都会有污染。为此外植体消毒要严加注意，鳞片先用流线形自来水冲洗12小时以上进行预灭菌再用70%酒精消毒1min，用0.1%升汞消毒10min最后用无菌水冲洗4~6次，用无菌吸水纸吸干水分。三、外植体的原代培养在同一块鳞片上，其中部被诱导产生小鳞茎的能力最强，诱导出的小鳞茎生长速度也相对较快，而两头位置相对要差些，所以在进行原代培养时，要取已消毒外植体的中部将其切成1~2cm2大小，背部朝下置于MS+NAA0.03mg/kg+琼脂0.7%+蔗糖3%培养基上培养。培养条件为：温度控制在23±2℃，光照控制在300~500Lx进行脱分化，之后温度控制在25±2℃，每天10h小时1500Lx光照。在龙牙百合组织培养过程中，鳞片诱导产生小鳞茎的过程是比较缓慢的，一般为30天以上，在鳞片上分化出多个肉眼可见的针尖大小的小突起。40天左右发育成球状的可见鳞片的小鳞茎。四、龙牙百合的继代培养鳞茎原代培养形成再生芽继代培养生根培养驯化移栽大田培植大田培植龙牙百合组织培养技术路线回顾原代培养形成愈伤组织四、试管苗的继代培养1、龙牙百合继代培养路线思考分离小鳞茎培养继代目的：以尽可能少的时间获取尽可能多的组织苗，通过生根、驯化、移栽、培植，为生产提供大量种苗怎样短期获取大量组培苗？愈伤组织培养→芽诱导再生小鳞片剥离培养小鳞茎增重较快，但增殖率较小，仅100~200%增殖率较高，有300%~500%，但小鳞茎增重慢。用增重培养基与液体培养方法可解决增殖率最高，可达500%以上，短期内可诱导出大量愈伤组织。通过芽诱导，用增重培养基与液体培养方法可获取大量组培苗剪取茎段培养不产生伸长茎段，此法不宜采用3、继代培养1）分离小鳞茎培养选择直径达到0.5cm大小的小鳞茎，用镊子将其轻轻剥离，置于增殖培养基中。把原来的鳞片重新转到新鲜的诱导培养基上继续诱导小鳞茎，小鳞茎还会在其他的部位产生，整个生长周期可以延续5~6个月。小鳞茎继代培养30天左右可增殖1~2倍。开始是在鳞茎基部产生小鳞茎，40天左右小鳞茎长大，形成丛鳞茎。小鳞茎慢慢抽出新芽，然后形成小植株。此时可把丛芽切割继续培养增殖。2）再生小鳞片剥离培养选择直径达到0.5cm大小的小鳞茎，将其小鳞片分离下来，不用切割，直接接种到分化培养基上。20d后，在小鳞片基部会出现3~5个小突起，以后发育成小鳞茎。多数次生小鳞茎会抽生细长叶片，造成小鳞茎不饱满；不抽生叶片的小鳞茎相对要肥厚一些。如此反复进行,可以使繁殖中间体得到快速增殖,但不可超过6代以上,否则分化率下降，小鳞茎细弱。4、增重培养直径达到1cm以上即可进行生根培养，对于达不到此标准的小鳞茎，接种到增重培养基中，在此种培养基上，小鳞茎较少长叶而明显增重。如果能采用液体振荡培养，则增重效果更佳。一般转速设为110r/min。是否可以进行浅层液体静置培养，尚需试验。五、试管苗的生根与练苗将丛生的试管芽切成单株，接种在1/2MS+IBA0.5mg/L+活性炭0.5%生根培养基上，7天后芽基部开始形成根尖。慢慢伸长成辐射状白色的小根。20天后根长达7~10cm，基部稍膨大。温度设置为25~28℃，光照强度为1500Lx．每天给予10~12h光照。当试管苗长成具4~5片叶，3~4条根，7cm左右高时，在自然光照和温度条件下炼20d可移栽。六、试管苗的移栽与田间管理移栽时将试管苗根部的培养基洗干净再移栽。龙牙百合试管苗比较娇嫩，移栽幼苗最好用消毒的腐殖土或草炭+蛭石(2:1)的基质中，育苗盘必须清洗消毒。水分管理百合鳞茎由许多肥厚的鳞片组成，鳞片内贮存有许多水分和养分。一般来说，百合是比较耐旱的。但百合有众多柔嫩多汁的茎叶，需要由充足的水分来支撑。因此，在百合正常生长过程中，需要比较充足的水分，才能保证茎叶的生长和花蕾的发育。如果栽植后浇水不透或土壤湿度过大或棚内湿度过高，对生长不利，易出现徒长，茎叶软弱。在棚室栽培中如土壤干旱，应在晴天上午浇水，增加棚室内的湿度。切忌在中午日照强烈、气温很高时浇水或喷水，否则易引起百合芽枯病等生理性病害的发生。施肥管理百合的根系十分发达，吸收水分和养分的能力很强，生长期间给予一定数量的氮、磷、钾肥（比例为5：10：5）外，还需补充钙、镁、硫等肥料以及铁、硼、锰、铜、锌、铜等微量元素。百合无论在茎叶生长期、现蕾开花期和地下鳞茎膨大期，都需要足够的营养。在百合茎叶生长期，可施用2-3次稀释的饼肥液。硝态氮肥不易