分子生物学研究法上

第四章分子生物学研究法（上）

--DNA、RNA及蛋白质操作技术引

言

从20世纪中叶开始，分子生物学研究得到高速发展，主要原因之一是研究方法，特别是基因操作和基因工程技术的进步。

基因操作也称重组DNA技术，主要包括DNA分子的切割与连接、细胞转化、凝胶电泳、核酸分子杂交、核酸序列分析以及基因人工合成、定点突变和PCR扩增等，是分子生物学研究的核心技术。

基因工程是指在体外将核酸分子插入各种载体分子中，构成遗传物质的新组合，并使之进入新的寄主细胞内，进行持续稳定的繁殖和表达。本章的主要内容第一节重组DNA技术回顾第二节DNA的基本操作技术第三节RNA的基本操作技术第四节基因克隆技术第五节基因芯片技术第六节蛋白质组学及其研究技术第一节重组DNA技术回顾(ReviewofRecombinantDNATechnique)重组DNA技术（RecombinantDNATechnique）又称为基因克隆（GeneCloning）或分子克隆（MolecularCloning）技术。是按照人们意愿，在体外对DNA分子进行重组，再将重组分子导入受体细胞，使其在细胞中扩增和繁殖，以获得该DNA的大量拷贝。重组DNA技术包括了一系列的基因操作步骤。二、重组DNA技术的基本步骤

①目的DNA的获得与载体的制备；②目的DNA与载体的连接；③重组DNA导入受体细胞；④重组DNA的筛选和鉴定；⑤目的DNA的表达及表达产物的检测与分离纯化。三、重组DNA技术的四大要素

目的DNA

载体（Vector）

工具酶

宿主细胞（一）目的基因（外源基因）的获取获得需要的目的基因常用的方法：1、分离的基因DNA片段或基因；2、mRNA逆转录合成的cDNA；3、化学合成人工目的基因；4、PCR体外扩增的DNA片段。（二）载体载体(Vector)：是指能运载外源性DNA进入宿主细胞，并能进行自我复制的DNA。克隆载体(cloningvector)：为使插入的外源DNA序列被大量扩增而设计的载体。表达载体(expressionvector)：为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而设计的载体。允许外源DNA的插入、储存和表达。整合载体(integrated

vector):

为把一个基因插入到染色体中而特意设计的载体。1、载体分类按功能分类：（2）按进入受体细胞类型分类：穿梭载体（Shuttlevector）：是能够在两类不同宿主中复制、增殖和选择的载体。如有些载体既能在原核细胞中复制又能在真核细胞中复制，或能在E.coli

中复制又能在革兰氏阳性细菌中复制。

原核载体真核载体（3）按载体来源分类：

噬菌体载体（入噬菌体）

质粒载体柯斯质粒（Cosmid）

细菌人工染色体（BacterialArtificialChromosome，BAC）

P1源的细菌人工染色体（P1-derivedArtificialChromosome，PAC）酵母人工染色体（YeastArtificialChromosome

YAC）病毒载体哺乳动物人工染色体（MammalArtificialChromosome，MAC）人类人工染色体（HumanArtificialChromosome，HAC）植物人工染色体（PlantArtificialChromosome，PAC）常见载体的种类和特征载体类型受体细胞结构插入片断举例质粒E.coli环状＜9kbpUC18/19,T-载体等λ噬菌体E.coli线状9–24kbΛgt系列丝状噬菌体E.coli环状＜10kbM13mp系列柯斯质粒E.coli环状35-45kbpJB8,pWE15/16BACE.coli环状~300kbPeloBAC系列PACE.coli环状100-2000kbPCYPAC1YAC酵母细胞线性染色体100-2000kbMAC哺乳类细胞线性染色体＞1000kb病毒载体动物细胞环状SV40载体，昆虫杆状病毒载体穿梭载体动物细胞和细菌环状pSVK3质粒，PBV,Ti质粒2、载体应当具备的条件（1）能自主复制。容易获得大量的重组的DNA分子；（2）具有合适的外源DNA插入的位点（克隆位点或限制性内切酶的切点）。便于接纳不同的DNA片段。（3）具备可供选择的遗传标记。便于进行重组体筛选和鉴定。（4）载体本身应尽量小。不含或尽量少含多余的DNA部分，这样可以容纳较大的外源DNA。（5）在宿主细胞内的稳定性高。多克隆位点Ori复制起始点遗传标记AmpMCS载体（三）工具酶重组DNA实验中常见的主要工具酶我们的基本目的是：把外源基因与载体连接在一起形成重组DNA分子，最少需要以下两类工具酶：1、准确切割DNA分子的工具（“分子手术刀”）

限制性内切酶2、DNA片段的连接工具（“分子缝合针”）

DNA连接酶1、限制性核酸内切酶“分子手术刀”限制性核酸内切酶（RestrictionEndonuclease,RE）：是一类能识别和切割双链DNA分子中特定碱基顺序的核酸水解酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ命名原则:HindⅢ

属Haemophilusinfluenzae

d菌株流感嗜血杆菌d菌株的第3种酶①第一个字母是细菌属名的第一个字母，要大写；②第2、3个字母是细菌种名的前两个字母，要小写；

上述字母都是用斜体。③接着是细菌菌株的第一个字母，用正体字母书写；④如果同一菌株有不同的内切酶时，按发现次序分别用罗马数字Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ……表示。种菌株序识别序列特点——

回文结构(palindrome)

即反向重复结构，以DNA分子中某一处为轴，其两侧核苷酸排列呈回文对称的序列。每种限制性内切酶都有一个它所识别、结合并切割的特异序列，称为限制性位点或切点（4~8bp）。识别序列：GGATCCCCTAGGBamHⅠBamHⅠCCCGGGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGSamICCCGGGGGGCCCGGGCCC+平末端（Bluntend）：对称轴切割粘性末端（Stickyend）：交错切割切口：平端切口、粘端切口如果用一种限制酶，切割两种不同的DNA时，产生相同的末端，混合后“退火”，这两种不同的DNA分子彼此可以连接，形成重组DNA分子。2、DNA连接酶“分子缝合针”DNA连接酶（DNALigase）：

催化两条DNA链的3´-OH和5´-P之间形成磷酸二酯键而把两个DNA分子连接在一起。例如:T4DNA连接酶。外源基因与载体的连接方式：（1）粘性末端连接方式：①同一限制性内切酶切点的连接②不同限制性内切酶切点的连接（2）平端连接适用于：①限制性内切酶作用产生的平端②粘端经特殊酶处理变为平端（3）同聚物加尾连接由末端转移酶（Terminaltransferase）作用，在DNA片段末端加上同聚物序列，制造出粘性末端再连接。（4）人工接头平端加上带有新的酶切位点的寡核苷酸，再用限制酶切产生粘性末端，进行连接。（四）宿主细胞大肠杆菌酵母1、常用种类2、导入方式转化（transformation）转染（transfection）转导（transduction）二、细菌转化与目标DNA分子的增殖细菌转化（Transformation）:

一种细菌菌株由于捕获了外源DNA而导致性状特征发生遗传改变的生命过程。接受转化DNA的细菌菌株则被称为受体菌株。

绝大多数细菌，正常条件下仅能获得极少量的DNA。为了高效转化这些细菌，必须对受体细菌进行一些物理或化学的处理，以增加它们获得DNA的能力。经历这种处理的细胞被称为感受态细胞（CompetentCell）。

常用细菌转化的方法1CaCl2法将快速生长中的大肠杆菌置于经(0℃）预处理的低渗氯化钙(0.1mol/L)溶液中，使细胞膨胀形成原生质球，外源DNA粘附在细胞表面。42℃下做短暂热刺激，细胞吸收外源DNA。在全培养基中生长一段时间使转化基因实现表达，涂布于选择性培养基中分离转化子。常用细菌转化的方法2电转化法克隆的筛选和鉴定：1、抗生素常用的抗生素有：氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、四环素、链霉素等。2、α-互补蓝白斑筛选法实验室常用带有不同抗生素的选择性培养基结合α-互补蓝白斑筛选法鉴定转化细胞。载体上：β-半乳糖苷酶基因（LacZ）的调控序列和氨基端（N端）146个氨基酸编码序列，在编码区中插入了一个多克隆位点（MCS）；

片段宿主细胞：编码β-半乳糖苷酶C端序列

片段宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。这样，LacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为α-互补。X-gal蓝色化合物X-galβ-半乳糖苷酶IPTG（LacZ基因N端序列）LacZ基因N端序列LacZ酶LacZ基因N端序列插入片段（LacZ基因失活）细菌转化与目标DNA分子的增殖的操作过程第二节DNA的基本操作技术（TechniquesforDNAManipulation）一、核酸的凝胶电泳二、聚合酶链式反应三、实时定量PCR四、基因组DNA文库的构建一、核酸的凝胶电泳

核酸凝胶电泳是重组DNA技术的核心技术之一，它可以按分子量大小对DNA或RNA进行分离。因此，可用于分离、鉴定和纯化DNA或RNA片段，也是许多分子生物学研究方法，如DNA分型、DNA核苷酸序列分析、限制性内切酶片段分析、凝胶回收等等一系技术的技术基础。凝胶电泳的基本原理

将一带电荷的分子放置到电场中，会以一定的速度移向适当的电极（电泳）。这种分子在电场作用下的迁移速度，叫做电泳迁移率。电场强度越大，带点分子净电荷越多，迁移速率越快，分子越慢。

在电泳中往往使用无反应活性的稳定的支持介质（琼脂糖or聚丙烯酰胺凝胶），电泳迁移率与分子的摩擦系数成反比。摩擦系数是分子大小、极性、介质粘度等的函数。因此，在同一凝胶中、一定电场强度下，可根据分子大小的不同、构型的差异以及所带电荷的多寡，将分子混合物中的各种成分彼此分开。生理条件下，核酸分子中的磷酸基团呈负离子化状态。同时，由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同大小的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正电极方向迁移。常用的核酸凝胶电泳有琼脂糖(Agarose)凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）。可以在水平或垂直的电泳槽中进行。

琼脂糖是一种线性多糖聚合物，从红色海藻产物琼脂中提取而来的。将琼脂糖粉末加热到熔点后冷却凝固便会形成良好的电泳介质。经化学修饰后，琼脂糖的熔点会降低（低熔点琼脂糖），在较低温度下便会熔化，常用于DNA片段的制备电泳。

聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成凝胶，是以丙烯酰胺为单位，由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成。催化聚合的常以过硫酸铵（AP）为催化剂，以四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂。

琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.2-50kb之间。聚丙烯酰胺凝胶的分辨范围为1-1,000bp之间。凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。二、聚合酶链式反应KaryB.Mullis(1944-)聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，PCR）:是利用DNA片段旁侧两个短的单链引物，在体外快速扩增特异DNA片段的技术。20世纪80年代，KaryB.Mullis发明该技术。1993获得NobelPrize。/三、实时定量PCR是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，使每一个循环变得“可见”，最后通过标准曲线对样品中的DNA(orcDNA)的起始浓度进行定量的方法。实时定量PCR（RealtimequantitativePCR

）TheoreticalRealLifeLogTargetDNACyclePCR产物积累规律PCR扩增中的“平台效应”，导致常规PCR技术对最终产物总量定量的不可靠性。实时定量PCR的基本原理

在反应体系和反应条件完全一致的情况下，PCR扩增呈指数增长时，模板量与扩增产物的量成正比。由于反应体系中的荧光基团与扩增产物结合发光，其荧光量与扩增产物量成正比，因此通过荧光量的检测就可以测定样本核酸量。四、基因组DNA文库的构建基因组DNA文库（GenomicDNAlibrary）:是指将某种生物的基因组DNA用限制性内切酶或机械切割法切成适当长度的DNA片段，再与合适的载体在体外重组并转化相应的宿主细胞，形成克隆。汇集某种生物全部遗传信息（基因组DNA中所有序列信息）的重组DNA分子的克隆总和，就称为该生物基因组DNA文库。可用于保存某种生物的全部基因、分离特定的基因片段和全基因组序列测定、分析等。构建基因组DNA文库需考虑的问题

代表性和随机性

代表性是指文库中所有克隆所携带的DNA片段重新组合起来可以覆盖整个基因组，即可以从该文库中分离任何一段DNA。代表性是衡量文库质量的一个很重要的指标。在文库的构建过程中采用了两个策略提高文库的代表性：一、采用部分酶切或机械随机切割的方法来消化DNA，以保证克隆的随机性，保证每段DNA在文库中出现的频率均等；二、提高文库所含基因组DNA的总容量，通常用覆盖基因组的倍数来衡量。为预测一个完整基因组文库应包含克隆的数目，Clark和Carbon于1975年提出如下的计算公式：N=ln（1-p）/ln（1-f）N：代表一个完全基因组文库所应该包含的重组克隆个数p：表示所期望的目的基因在文库中出现的几率f：表示重组克隆平均插入片段的大小和基因组DNA大小的比值人的基因组为3×109bp，p=0.99，插入片段平均大小为1.7×104bp，则f=1.7×104/3×109；N=8.1×105

即要有8.1×105个重组克隆才能包括99%的基因组例如：基因组DNA文库的构建流程

基因组DNA文库的构建程序包含5个部分：①大片段DNA克隆载体的准备；②

高纯度大分子量基因组DNA（HighMolecularWeightDNA，HMWDNA）的提取；③HMWDNA的部分酶切与脉冲电泳分级分离；④载体与外源片段的连接与转化或侵染宿主细胞；⑤重组克隆的挑取、验证和保存。第三节

RNA基本操作技术（TechniquesforRNAManipulation）一、总RNA的提取二、mRNA的纯化三、cDNA的合成四、cDNA文库的构建五、文库的筛选一、总RNA的提取细胞中的总RNA包括信使RNA(mRNA)、核糖体RNA(rRNA)、转运RNA(tRNA)以及一些非编码的小RNA。一个典型的动物细胞约含有10-5μgRNA，其中rRNA占80%~85%，tRNA和非编码小RNA占15%~20%，mRNA占1%~5%。按照提取试剂的种类来分，可分为：异硫氰酸胍法、盐酸胍法、异硫氰酸胍-苯酚法。

Trizol试剂是使用最广泛的抽提RNA专用试剂。主要由异硫氰酸胍和苯酚组成，可以迅速破坏细结构，使存在于细胞质及核内的RNA释放出来，并使蛋白质与RNA分子分离，还能保证RNA的完整性。常用