《兽医学》实验课

实验三常见毒物亚硝酸盐定性检验一、实验目的与要求了解毒物定性检验的基本原理、毒物的性质。熟练地掌握毒物的检测方法，懂得运用定性检测结果，结合临床、综合分析对动物中毒作出较为确切的判定。二、实验方法与步骤动物亚硝酸盐中毒，多数是采自亚硝酸盐含量很高的饲料而发生。将新鲜白菜切碎置于10℃气温下，自然风干腐烂，在2～3d内亚硝酸盐含量略有增加，第4天急剧上升至190mg/kg，第7天达到最高（2609mg/kg）。将这种切碎的新鲜白菜置于37℃保温时，第2天亚硝酸盐的含量急剧上升达最高值（504mg/kg），出现亚硝峰。青饲料在锅里微火慢煮时，经硝化菌作用，亚硝酸盐转化最快、最多。（一）联苯胺－冰醋酸法【原理】

亚硝酸盐在酸性溶液中将联苯胺重氮化成一种醌式化合物而呈现棕红色。【试剂】

准确称取0.1g联苯胺溶于10mL冰醋酸中，加水稀释至100mL过滤制成联苯胺－冰醋酸试剂。（一）联苯胺－冰醋酸法【操作方法】取碾碎的饲料样或切碎的青饲料，或取可疑的剩余饲料、呕吐物或胃内容物5～10g，置于100mL带塞三角瓶中，加70℃热水30～50mL，放置10～15min，过滤液作待检液。取检液2滴，置白瓷板上或小试管中，加1滴联苯胺－冰醋酸试剂，如有亚硝酸盐存在，出现红棕色、同时作阳性（亚硝酸空白）或阴性对照实验。（二）安替比林法【原理】

亚硝酸盐在酸性溶液中将使安替比林亚硝基代，溶液里绿色。【试剂】5g安替比林溶于100mL1mol/L硫酸（30ml浓硫酸缓慢进入适量蒸馏水中，冷却至室温，并稀释至100ml）中制成安替比林试剂。（二）安替比林法【操作方法】

取检液1滴，置于白瓷板上滴加1滴安替比林试剂，若出现绿色，示有亚硝酸盐存在。

由于微量亚硝酸盐，自然界广泛存在，加之定性检验方法显色的灵敏度高。因此在必要的情况应进行定量检验，方可判定亚硝酸盐中毒。实验四酮体检测

酮体包括乙酰乙酸、β－羟丁酸和丙酮，前二者是脂质代谢的中间代谢产物，后者是一种剩余物。当碳水化合物缺乏时，酮体的产生增多，此时糖异生作用增强。在这种情况下，在三羧酸循环中草酰乙酸缺乏，导致乙酰辅酶A增多，后者则是生酮的先质。酮体的肾阈值较低，故在测出酮血症之前，通常就已出现酮尿。一、酮体的定性试验

通常采用亚硝基铁氰化钠反应。该反应对乙酰乙酸是特异性的，对丙酮也有一些反应，但对β－羟丁酸不起反应，而β－羟丁酸在酮血症中占主要成分，因此反应程度与酮病的严重程度并无一致的关系。该方法简便易行，可用酮粉法或配置的液体试剂测定奶、尿或血清样品。一、酮体的定性试验酮粉配制：取硫酸铵100g，无水碳酸钠50g，亚硝基铁氰化钠3g，研碎混匀备用。操作方法：在短试管内或凹状试板上加酮粉试剂1g，滴加被检样品，数分钟后呈高锰酸钾样红色为阳性反应。在乳牛场内，可对乳牛于产前1周至产后5周的时间内，每周2次测定尿液pH值和尿液或乳中酮体，pH值呈酸性或酮体呈阳性应予以注意，采用碳酸氢钠、葡萄糖等治疗。二、酮体的定量试验

微量凯氏蒸馏、水杨醛比色法。该法可测得全量酮体。样品以氢氧化钡和硫酸锌去除蛋白，其中丙酮首先被蒸馏分离，乙酰乙酸和β－羟丁酸经先后加入硫酸和重铬酸钾氧化，变成丙酮而蒸馏，蒸馏液与芳香族醛在碱性条件下发生红色反应。【酮体的临床意义】

出现酮血症或酮尿症，表明机体脂肪和能量代谢紊乱。常见于奶牛酮病、绵羊妊娠毒血症、母牛肥胖综合征、真胃变位、糖尿病性酮酸中毒、长期饥饿等。实验五动物血清转氨酶的测定实验目的与要求初步掌握血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、门冬氨酸氨基转移酶（AST）测定的实验条件、方法和步骤。了解本次所测定血清酶的临床意义。血清ALT的测定血清中丙氨酸氨基转移酶（ALT）作用于丙氨酸及α-酮戊二酸组成的基质，产生丙酮酸及谷氨酸。【原理】血清ALT的测定丙酮酸与2,4-二硝基苯肼反应生成丙酮酸2,4-二硝基苯腙，在碱性溶液中显棕红色，再与同样处理的丙酮酸标准液进行比色，计算出酶的单位。血清ALT的测定【试剂】0.1mol/L磷酸氢二钠：磷酸氢二钠（含两个结晶水）17.6g溶解于水中，并加水1000ml，冰箱内保存。0.1mol/L磷酸二氢钾溶液：磷酸二氢钾13.6g溶解于水中，加水至1000ml，冰箱内保存。0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.4）：将420ml0.1mol/L磷酸氢二钠溶液和80ml0.1mol/L磷酸二氢钾溶液混匀，置冰箱内保存。血清ALT的测定基质缓冲液（DL-丙氨酸200mmol/L，α-酮戊二酸2mmol/L）：精确称取1.79gDL-丙氨酸和29.2mgα-酮戊二酸，先溶于约50ml0.1mol/L磷酸缓冲液中，用0.1mol/L氢氧化钠（约0.5ml）调节到pH7.4，再加磷酸缓冲液至100ml，置冰箱内保存，可稳定2周。基质中可加麝香草酚（每毫升基质加入0.9g）防腐。置冰箱内至少可保存1个月。分装安瓶灭菌后，室温至少可用3个月。血清ALT的测定1mmol/L2,4-二硝基苯肼溶液：称19.8mg2,4-二硝基苯肼，溶解于100ml1mol/L盐酸中，置是室温中保存。0.4mol/L氢氧化钠溶液：将16.0g氢氧化钠溶解于水中，并加至100ml，置具塞塑料试剂瓶中，室温可长期保存。2mmol/L丙酮酸标准溶液：准确称取22.0mg丙酮酸（AR），置于1000ml容量瓶中，加0.05mol/L硫酸至刻度。血清ALT的测定【操作方法】

在测定前，将基质在37℃水浴箱内预温5min使用。具体操作按表1-1进行。管号测定管对照管血清（ml）0.10.1基质溶液（ml）0.5—表1-1ALT测定操作步骤血清ALT的测定

各管混匀后，在37℃水浴保温20min，然后每管加入0.4mol/L氢氧化钠溶液5ml，室温放置10min，在505nm以蒸馏水校正零点，读取各管的吸光度。测定管吸光度减去对照管吸光度后，从标准曲线查得ALT活力单位。2,4-二硝基苯肼溶液（ml）0.50.5基质溶液（ml）—0.5混匀后，在37℃水浴中保温30min。血清ALT的测定【标准曲线绘制】按表1-2向各管中加入相应试剂。管号012340.1mol/L磷酸缓冲液（ml）0.100.100.100.100.102mmol/L丙酮酸标准液（ml）00.050.100.150.20基质缓冲液（ml）0.500.450.400.350.30相当于酶活力（卡门氏单位）0285797150表1-2ALT各标准管的配制血清ALT的测定各管加入2,4-二硝基苯肼溶液0.5ml，混匀，37℃20min后加入0.4mol/L氢氧化钠溶液0.5ml。混匀，放置10min后在505nm比色，以蒸馏水调零点，读取各管吸光度。各管吸光度减去“0”号管吸光度，所得差值与对应得卡门氏酶活力单位作图。【临床意义】很多脏器都含有ALT，其分布大致为肝＞肾＞心＞肌肉。肝内ALT活性远远超过其它脏器的活性，主要存在于肝细胞质的可溶性部分，测定ALT对反映肝脏损害具有特殊意义。血清ALT活性增高原因：急性病毒性肝炎；骨骼肌、肾脏及胰腺等组织坏死；伴有急性肝炎的传染性单核细胞增多症；严重心肌梗塞、心力衰竭时的肝郁血；胆道疾病、肝外癌性胆道梗阻性黄疸、胆石症、胆管炎及胆囊炎；药物、酒精、铅、汞、四氯化碳等中毒；外科手术、麻醉、剧烈运动、早期妊娠等。血清ALT的测定血清ALT的测定【注意事项】溶血的血清可能会引起测定管吸光度增加，因此，检测此类标本时，应做血清标本对照管。当血清的标本酶活性超过150卡门单位时，应将血清用生理盐水稀释后再进行测定。血清ALT的测定【注意事项】加入2,4-二硝基苯肼溶液后，应充分反应混匀，使反应完全，加氢氧化钠溶液方法要一致，不同方法会导致吸光度读数的差异。基质中的α-酮戊二酸和2,4-二硝基苯肼均为呈色物质，称量必须准确，每批试剂的空白管吸光度上下波动不用超过0.015，如超出此范围应检查试剂及仪器方面等问题。血清AST的测定血清中门冬氨酸氨基转移酶（AST）作用于天门冬氨酸及α-酮戊二酸组成的基质，产生草酸乙酸及谷氨酸。草酸乙酸脱羧基后最终产物也是丙酮酸。【原理】血清AST的测定丙酮酸与2,4-二硝基苯肼反应生成丙酮酸2,4-二硝基苯腙，在碱性溶液中显棕红色，再与同样处理的丙酮酸标准液进行比色，计算出酶的单位。血清AST的测定【试剂】0.1mol/L磷酸缓冲液，PH7.01mmol/L2,4-二硝基苯肼4mol/L氢氧化钠2mmol/L丙酮酸标准液以上四种试剂与ALT比色法相同。血清AST的测定【试剂】AST基质液（DL-门冬氨酸200mmol/L，α-酮戊二酸2mmol/L）：称取α-酮戊二酸29.2mg和DL-门冬氨酸2.66g，置于一小烧杯中，加入1mol/L氢氧化钠约1.5ml，溶解，加0.1mol/L磷酸缓冲液约50ml，校正至pH7.4，然后将溶液移入100ml容量瓶中，用磷酸缓冲液稀释至刻度，放置冰箱保存。血清AST的测定【操作方法】同ALT比色测定法，但酶反应作用时间改为60min。血清AST的测定【标准曲线绘制】标准曲线绘制按表1-3向各管加入相应试剂。表1-3AST各标准管的配制管号012340.1mol/L磷酸缓冲液（ml）0.100.100.100.100.10基质液（ml）0.500.450.400.350.30丙酮酸标准液（ml）00.050.100.150.20相当于丙酮酸试剂含量(umol)00.100.200.300.40相当于酶活力（卡门氏单位）024