生物化学：6糖代谢紊乱的相关检测

第四章糖代谢紊乱的生物化学检验检验医学院临床生化教研室

李伶2基本内容1.基本概念2.血糖测定的常规要求3.糖化蛋白的检测4.胰腺分泌激素5.尿蛋白检测临床实验室检测血糖以及血糖调节物、糖化蛋白以及并发症相关的其他代谢产物等，有利于糖尿病及其并发症的早期诊断、鉴别诊断、指导治疗和评估预后。1、标本推荐以血浆为标本分离血浆后尽快测定推荐测定静脉血浆葡萄糖，采用葡萄糖氧化酶法或己糖激酶法测定葡萄糖表(Glucowatch)：此表比手表略大。每10分钟自动显示一次糖量,当糖过高或过低时会发出警告声。此种结果虽不如静脉血糖准确,反应也较血糖迟,但为自动连续测定,故发现低血糖或高血糖的机会比偶尔测定血糖要多。动态血糖监测仪每5分钟提供一次血糖测量，并能最长能持续3天。也就是说，该系统能够每天给出228个量血糖测量值，并最长能够连续72小时提供总数为864个的血糖测量值。测量那些被指尖测量所忽略的血糖信息并能够揭示出隐藏的血糖状态，比如在某些时候出现的高或低血糖。

2.测定方法1896年Reid50ml血浆测定方法分类一、无机化学法——氧化还原法二、有机化学法——缩合法三、生物化学法——酶法四、仪器分析法——新技术和仪器分析法1）无机化学法（氧化还原法）

上世纪初建立的一类经典方法，基于葡萄糖在碱性环境下的烯二醇型结构具有很强的还原性班氏法（Benidict）第一个得到广泛承认与临床应用的方法[原理][评价]1.对标本中所有还原性物质均敏感2.结合酶法测定，用于鉴别Glu与其他3.新生儿尿糖测定：班氏法(+)酶法(-)提示新生儿遗传性碳水化合物代谢病（乳糖、半乳糖、果糖、戊糖等）福林-吴法（Folin-Wu）又称磷钼酸显色法[原理][评价]1.试剂便宜，来源广泛，不需特殊仪器操作简单，精密度基本能满足临床需要2.存在较大的非特异性干扰，使测定结果偏高干扰物如还原性谷胱甘肽、尿酸、肌酐、VitC、果糖、甘露糖、酮体、阿司匹林等还原性物质砷钼酸法（Somogyi-Nelson）

原理类似Folin-Wu法仅将磷钼酸换成砷钼酸上述三种方法统称氧化亚铜法碱性高铁氰化物法[原理]

黄色无色

[评价]曾用于自动化分析，但特异性差。

肌酐、尿酸可使测定结果偏高2）有机化学法（缩合法）上世纪50年代起，利用葡萄糖在酸性环境下的醛型结构具有与多种芳香胺可进行缩合反应的特点进行测定的一类方法。多种芳香胺在酸性溶液中与葡萄糖的醛基缩合成葡萄糖胺，葡萄糖胺经脱水与分子重排生成蓝色希夫氏碱(Schiffbase)芳香胺：苯胺、联苯胺、对甲基苯甲酸、氨基羟苯等（致癌物）现选用：邻甲苯胺（O-toluidine,O-T）邻甲苯胺法（O-T法）[原理][评价]1.特异性较高：一般不与非糖物质发生反应，特异性优于福林-吴法，但可与己醛糖和戊糖反应2.线性范围较宽：可达0~22.2mmol/L3.反应仍不够特异；高浓度醋酸的使用和高温煮沸的反应条件，对人与仪器均有害；另外，O-T有毒，尚被怀疑为致癌物质。O-T法是作为取代Folin-Wu法向酶法的过渡方法。3.生物化学法（酶法）全酶法与部分酶法（1）葡萄糖氧化酶法1.氧速率法（oxygen-rate）：GOD-OR法2.比色法（colorimetry）：偶联酶催化显色偶联酶：过氧化物酶（peroxidase,POD）

过氧化氢酶，醛脱氢酶等显色反应：GOD-POP法第二步称Trinder反应

【方法学评价】适用血清/浆、脑脊液样本，不适用于尿液及全血；第二步特异性较低；可检测氧的消耗量。Trinder反应H2O2+4－氨基安替比林+酚POD醌亚胺+H2OPAP推荐方法[评价]该法准确度和精密度都能达到临床要求，并且操作简便，适用于常规检验，为我国血糖测定的推荐方法。（2）已糖激酶法

又称HK法，该法分两步完成，其测定原理如下：

【方法学评价】

该法准确度和精密度高，特异性高，常规抗凝剂和血清中的常见物质，如轻度溶血、脂血、黄疸、氟化钠、肝素、EDTA和草酸盐等都不会对本法产生干扰，适用于自动化分析。特异性高。

试剂昂贵，操作条件严格，为葡萄糖测定的参考方法。（3）葡萄糖氧化酶-极谱分析法该法是GOD-POP的改良方法，它以氧电极进极谱分析，直接测定葡萄糖氧化酶法第一步反应消耗的氧来进行定量，摒弃了特异性不高的第二步反应。（4）葡萄糖脱氢酶法

（GlucoseDehydrogenase,GD）[原理][评价]该法高度特异，不受各种抗凝剂和血浆中其他物质的干扰。制作成固相酶，可用于连续流动分析，也可用于离心沉淀物的分析。？？？本法高度特异，不受各种抗凝剂和血浆中其他物质的干扰。制成固相酶，可用于连续流动分析，也可用于离心沉淀物的分析。一、空腹血糖（fastingplasmaglucose，FPG检测方法：指至少8h内不摄入含热量食物后测定的血浆葡萄糖。

空腹血糖水平反映了胰岛素分泌能力，其增高与葡萄糖耐量减低是相平行的空腹血糖水平是诊断糖尿病最主要的依据。。空腹血糖水平反映了胰岛素分泌能力，其增高与葡萄糖耐量减低是相平行的空腹血糖水平是诊断糖尿病最主要的依据。2.应用的评价FPG是糖尿病的常用检测项目，但在2型糖尿病中，高血糖是相对较晚才产生的，因此仅应用FPG这个标准将延误诊断，并对糖尿病人群的流行估计过低。3.检测方法的评价己糖激酶法、葡萄糖氧化酶法、葡萄糖脱氢酶法二、餐后2h血糖检测方法监测餐后2小时血糖有两种方法：一种是口服75克无水葡萄糖后做葡萄糖耐量试验；另一种是吃100克面粉制成的馒头或方便面(含糖量相当于75克无水葡萄糖，也叫馒头餐试验)。从吃第一口饭的时间开始计算，然后测量2小时后的血糖值。参考区间正常人餐后2h血糖＜7.8mmol/L。临床意义餐后2h血糖是一个非常有价值的糖尿病病情监测指标：①反映胰岛β细胞的储备功能②若餐后2h血糖＞11.1mmol/L（200mg/dl），则易发生糖尿病眼、肾、神经等慢性并发症③较好地反映进食量及使用的降糖药是否合适餐后血糖升高是心血管疾病死亡的独立危险因素三、葡萄糖耐量试验检测方法包括口服葡萄糖耐量实验(oralglucosetolerancetest，OGTT)和静脉葡萄糖耐量实验（intravenousglucosetolerancetest，IGTT）。在口服或静脉注射一定量葡萄糖后2h内做系列血糖测定，以评价个体的血糖调节能力的标准方法，对确定健康和疾病个体也有价值。常用的是OGTT。在口服一定量葡萄糖后2h内作系列血浆葡萄糖浓度测定，以评价不同个体对血糖的调节能力的一种标准方法。

OGTT在糖尿病的诊断上并非必需，因此不推荐临床常规应用。OGTT标准方法试验前3天，受试者每日食物中糖含量不低于150g，且维持正常活动，影响试验的药物应在3天前停用。试验前应空腹10～16小时。坐位取血后5分钟内饮入250ml含75g无水葡萄糖的糖水（妊娠妇女用量为100g；对于小孩，按1.75g/kg体重计算，总量不超过75g），之后，每隔30分钟取血1次，共4次，历时2小时。临床意义（1）诊断妊娠糖尿病（GDM）（2）诊断糖耐量减退（IGT）（3）有无法解释的肾病、神经病变或视网膜病变，其随机血糖<7.8mmol/L，可用OGTT评价。在此时如有异常OGTT结果，不代表有肯定的因果关系，还应该排除其他疾病（4）人群筛查，以获取流行病学数据评价OGTT在糖尿病的诊断中并非必需，因此不推荐临床常规应用。虽然OGTT比FPG更灵敏，但它受多种因素影响且重复性差。（二）糖化蛋白的检测糖尿病患者重要的常规检查项目，主要用于血糖控制情况、病情及预后的评估。糖基化：通过非酶促反应将糖基加到蛋白质的氨基酸基团上。血糖测定只代表即刻的血糖水平，提示患者当时的身体状况，糖化蛋白可提供较长时间段的血糖评估，是糖尿病患者疾病控制程度一项良好的指标。健康成人血红蛋白的组成（四）糖化蛋白的检测1、糖化血红蛋白（HbA1C）糖化血红蛋白是指血液中和葡萄糖结合了的那一部分血红蛋白。血液中葡萄糖浓度糖化血红蛋白糖化因红蛋白水平反映的是在检测前6-8周内的平均血糖水平，是判定糖尿病长期控制的良好指标。糖化血红蛋白(HBA1C)正常4～6％

葡萄糖+血红Pr→糖化血红Pr,此反应不可逆,待RBC衰老死亡(180天)后分解

血糖增高→HBA1c增高,能反应过去6-8周血糖平均水平,是病情长期控制的有效判断指标。（四）糖化蛋白的检测（四）糖化蛋白的检测糖化血红蛋白的测定结果以百分率表示。HbA1c：非糖尿病患者：3-6%；糖尿病患者：＜8%，糖尿病的并发症大大降低；

>9%，说明患者持续性高血糖，会发生糖尿病性肾病,动脉硬化,白内障等并发症，并有可能出现酮症酸中毒等急性合并症。多种方法可用于GHb的测定：①根据电荷差异，可用离子交换层析，高效液相色谱，常规电泳和等电聚焦电泳等方法：②根据结构差异，可用亲和层析和免疫测定法；③基于化学分析技术，可用比色法和分光光度法。不管什么方法，结果都表示为GHb占总Hb的百分比。临床意义：反映过去6～8周的平均血糖浓度，可为评估血糖的控制情况提供可靠的实验室指标。HbA1c为新的糖尿病诊断指标，诊断标准定为6.5％血糖控制指标（HbA1c＜7％）HbA1c为糖尿病患者心血管事件的独立预测危险因素评价HbA1c检测结果不受存在的变异型血红蛋白及其衍生物的影响。GHb的形成与红细胞的寿命有关，各种原因引起红细胞寿命缩短时，GHb明显减少；异常血红蛋白病也会导致GHb改变。HbA1c的检测方法已标准化、与糖尿病长期并发症的相关性更强，生物变异性小检测方法血液中的葡萄糖与血清蛋白的N末端发生非酶促的糖基化反应，形成高分子酮胺（ketoamine）化合物，其结构类似果糖胺(fructosamine)，总称为糖化血清蛋白。由于90％以上糖化血清蛋白是糖化白蛋白（glycatedalbumin,GA，葡萄糖与血清白蛋白链内第189位赖氨酸结合），因此GA可以反映糖化血清蛋白的总体水平。五、糖化蛋白的检测包括糖化血清蛋白与糖化白蛋白五、糖化白蛋白1.检验项目【项目检测依据】血液中的葡萄糖与血清蛋白的末端发生非酶促糖基化反应，形成高分子酮胺化合物，其结构类似果糖胺，总称为糖化血清蛋白。

90％以上糖化血清蛋白是糖化白蛋白（glycatedalbumin,GA），故GA可以反映糖化血清蛋白的总体水平。酮胺氧化酶法【检测原理】【参考区间】10.8％～17.1％（中国血糖监测临床应用指南2011年版）【方法学评价】本法简便快捷、精密度高、准确性好、胆红素对其干扰较小，可用于自动化生化分析仪。

2.检测方法基于所带电荷不同：阳离子交换层析法和电泳法基于糖化基团结构不同：亲和层析法和免疫学方法化学分析技术：包括比色法和酶法常用的是硫代巴比土酸法和酮胺氧化酶法。【临床意义】评价短期血糖控制情况；辅助鉴别应激性高血压；筛查糖尿病：GA≥17.1％可以筛查出大部分未经诊断的糖尿病患者【应用评价】反映了2~3周血糖的平均水平，是一个短期血糖控制的评价指标。非酶促作用使葡萄糖与长寿命蛋白质（如胶原）或DNA相连，产生稳定的Amadori早期糖化产物。产物经一系列分子重排、脱氢和断裂反应，产生不可逆的晚期糖化终末产物（advancedglycationendproduction,AGE）。AGE提供了一种比GHb更长期的糖尿病控制指标。

3、糖化终末产物AGE：【临床意义】AGEs通过影响蛋白质和细胞外基质的功能，促进糖尿病的微血管和大血管病变，参与糖尿病慢性并发症、动脉粥样硬化、尿毒症、阿尔茨海默病、白内障等多种疾病和衰老的发生、发展。【应用评价】比HbA1c更长期的糖尿病控制指标，监测长期血糖水平、评估糖尿病并发症的程度。六、胰岛素（insulin）及C肽（C-peptid）检测方法胰岛β细胞粗面内质网的核糖核蛋白体首先合成前胰岛素原（preproinsulin），很快被酶切去信号肽后，生成胰岛素原（proinsulin），贮存在高尔基体的分泌小泡内，最后被蛋白水解酶水解成活性胰岛素（51个氨基酸残基）和含31个氨基酸残基的无活性的C肽（Cpeptide）。胰岛素相对分子量为5.8KD，分泌入血后在体内的生物半寿期为5～10min，主要为肝脏摄取并降解，少量由肾小球滤过后在近曲小管重吸收和降解。C肽分子量为3.6KD，没有生物活性，但对保证胰岛素的正常结构却是必须的。虽然胰岛素和C肽等摩尔数分泌入血，但由于C肽的半寿期更长（约35min），因此在禁食后血浆C肽的浓度比胰岛素高5～10倍。C肽主要在肾脏中降解，部分以原形从尿液排出。检测方法利用胰岛素和C肽的抗原性，采用免疫学方法进行检测。目前有放射免疫分析法（RIA）、酶联免疫吸附法（ELISA）、化学发光免疫分析法（CLIA）、电化学发光免疫分析法（ECLIA）等。参考区间空腹胰岛素（CLIA法）：4.0～15.6U/L。空腹胰岛素（ECLIA法）：17.8～173.0pmol/L。C肽（ECLIA法）：250.0～600.0pmol/L。由于各厂商的产品不同以及各地区的差异，各实验室应建立自己的参考值。临床意义胰岛素测定最主要的临床用途是：对空腹低血糖患者进行评估。确认需进行胰岛素治疗的糖尿病患者，并将他们与靠饮食控制的糖尿病患者分开。预测2型糖尿病的发展并评估患者状况，预测糖尿病易感性。通过测定血胰岛素浓度和胰岛素抗体来评估胰岛素抵抗机制。临床意义胰岛素测定最主要的临床用途是：对空腹低血糖患者进行评估。确认需进行胰岛素治疗的糖尿病患者，并将他们与靠饮食控制的糖尿病患者分开。预测2型糖尿病的发展并评估患者状况，预测糖尿病易感性。通过测定血胰岛素浓度和胰岛素抗体来评估胰岛素抵抗机制。葡萄糖刺激胰岛素分泌的动态试验有利于糖尿病类型鉴别C肽测定的主要用途：主要用于评估空腹低血糖评估胰岛素的分泌监测胰腺手术效果评价测定C肽比测定胰岛素有更多优点：①由于肝脏的代谢可以忽略，所以与外周血胰岛素浓度相比，C肽浓度可更好地反映β细胞功能；②C肽不受外源性胰岛素干扰且不与胰岛素抗体反应。C肽主要通过肾脏排泄，肾病时，血中C肽浓度会升高，同时尿C肽浓度的个体差异大，限制了其作为评价胰岛素分泌能力的价值。七、胰岛素原（proinsulin）检测方法是胰岛素的前体和主要储存形式，其生物活性仅为胰岛素的10％。正常情况下仅少量的胰岛素原（胰岛素的3％）进入血循环。但肝脏清除它的能力仅为清除胰岛素能力的25％，导致前者的半寿期比后者长2～3倍，约为30min，因此在禁食后血浆胰岛素原浓度可达血浆胰岛素浓度的10％～15％。利用胰岛素原的抗原性，采用免疫学方法进行检测。目前有放射免疫分析法（RIA）、酶联免疫吸附法（ELISA）、电化学发光免疫分析法（ECLIA）等多种方法。参考区间正常人空腹胰岛素原参考范围是1.11～6.9pmol/L（也有报道为2.1～12.6pmol/L）。各实验室需建立自己的参考值。临床意义胰岛素原浓度增加见于：胰腺β细胞肿瘤。罕见的家族性高胰岛素原血症。存在可能与抗体起交叉反应的胰岛素原样物质。1型糖尿病2型糖尿病妊娠糖尿病评价胰岛素原的检测仍较困难，其原因是：血浆中胰岛素原浓度低，难获得纯品，故抗体制备困难；不易获得胰岛素原参考品；多数抗血清与胰岛素和C肽有交叉反应（两者浓度都较高），同时胰岛素原转化中间体也会干扰检测结果。八酮体的检测乙酰乙酸、-羟丁酸和丙酮统称为酮体。是游离脂肪酸在肝脏的氧化代谢产物。（二）酮体的检测长链脂肪酸甘油三酯VLDL入血肝脏酯化转化正常情况下：胰岛素缺乏：酯化减弱，酯解增强长链脂肪酸氧化加强酮体肝脏（二）酮体的检测乙酰乙酸、-羟丁酸和丙酮健康人-羟丁酸：乙酰乙酸1：1糖尿病人-羟丁酸：乙酰乙酸6：1酮体含有三种成分，检测样本可来自血液和尿液。尿酮的检测多采用酮体检查片法（Acetest）和尿酮体试纸条法（Ketostix）作半定量测定。β-羟丁酸的测定方法包括酸氧化比色法、气相色谱法、酶法和毛细管电泳法。临床常用的是酶法。酮体检查片法（Acetest）、尿中酮体检查剂法（Ketostix）和Gerhardt’s氯化铁试验均可用于体液酮体的测定,但均不能检测酮体中的β-羟丁酸。参考区间以丙酮计，血浆酮体定量＜0.05mmol/L（20mg/L）。尿酮体定性为阴性，定量为20～50mg/d。健康成年人血清β-羟丁酸为0.03～0.3mmol/L。临床意义在未控制的糖尿病中，血液乙酰乙酸堆积，其中大部分转变为β-羟丁酸。尿酮体检测已广泛用于1型糖尿病的病情监测。（目前大多数尿液酮体试验仅检测乙酰乙酸，这将导致实验检测结果与病情不相符的情况出现。）尿酮体阳性还见于饥饿、高脂饮食、呕吐、腹泻、脱水、妊娠中毒血症、甲状腺中毒症、消化吸收障碍等。评价测定血液和尿液中酮体的常用方法中，没有一个方法能与乙酰乙酸、丙酮和β-羟丁酸同时起反应。丙酮和乙酰乙酸都有挥发性，且乙酰乙酸容易分解成丙酮，因此检查时要尽量用新鲜尿(至少在排尿后两小时内)以提高检出率。紧张、剧烈运动、浓缩尿、低pH值、高色素尿或含有大量甲基多巴代谢物的尿液标本可以呈酮体假阳性反应。酶法测定β-羟丁酸灵敏度高、速度快、干扰小、适合自动化分析。乳酸通过细胞膜弥漫进入血液后，再入肝，在肝内异生为葡萄糖；葡萄糖释入血液后，又被肌肉摄取，构成乳酸循环。九乳酸和丙酮酸的检测血浆乳酸的正常值为1.0士0.5mmol／L＜2mmol／L均可视为正常一般认为乳酸浓度超过5mmol/L以及pH小于7.25时提示有明显的乳酸中毒。（三）乳酸和丙酮酸的检测丙酮酸是糖无氧代谢的产物，临床上常和乳酸一同测定，并用二者的比值推测循环衰竭的严重程度，当机体处于无氧代谢状态时，丙酮酸被还原为乳酸。测定丙酮酸浓度可用于评价先天代谢紊乱致血清乳酸浓度增加的患者。乳酸／丙酮酸正常应为9左右乳酸／丙酮酸，＜25糖异生缺陷乳酸／丙酮酸，≥35细胞内缺氧（三）乳酸和丙酮酸的检测乳酸、丙酮酸的测定：乳酸：在340nm波长下测定NADH定量乳酸。该法特异性高，操作简便，为乳酸测定的首选方法。丙酮酸：测定NADH吸光度的下降定量样品中的丙酮酸。2、乳酸和丙酮酸的检测乳酸是糖代谢的中间产物，其测定方法有化学氧化法、酶催化法、电化学法和酶电极感应器法丙酮酸测定方法包括2,4-二硝基苯肼法、乳酸脱氢酶法、高效液相色谱法等。参考区间不同标本乳酸参考值乳酸酸中毒出现于下列情况下发生：①A型（缺氧型）：常见，与组织氧合作用降低有关，如休克、低血容量和左心室衰竭；②B型：与某些疾病（如糖尿病、肿瘤、肝病）、药物或毒物（如乙醇、甲醇、水杨酸）或先天代谢紊乱（如甲基丙二酸血症，丙酮酸血症和脂肪酸氧化缺陷