实验层析技术血清球蛋白的分离纯化与鉴定

实验层析技术血清球蛋白的分离纯化与鉴定第一页，共三十页，2022年，8月28日层析技术实验原理实验思路实验流程及操作注意事项第二页，共三十页，2022年，8月28日层析技术1.定义：层析法，又称色谱法，是一种广泛运用的物质分离纯化、分析鉴定技术.第三页，共三十页，2022年，8月28日2.分离依据：混合物中各组分的理化性质差异—吸附力、分子形状、大小、酸碱性或分子极性、分子亲和力以及分配系数。第四页，共三十页，2022年，8月28日固定相—固定不动

流动相—对固定相作单向相对运动，推动样品中各组分通过固定相向前移动。各组分理化性质不同，对流动相和固定相具有不同的作用力，因此在流动相推动样品通过固定相的过程中，通过不断地吸附、解吸、吸附、解吸作用，造成混合物中各组分在固定相中的迁移距离不等，达到分离。3．基本原理：固定相和流动相第五页，共三十页，2022年，8月28日4．分类：

①流动相的物理状态：气相和液相

→

气液/固，液固/液

②方式：纸、薄层、柱

③原理：吸附、分配、凝胶、离子交换、亲和、金属螯合、疏水、反相第六页，共三十页，2022年，8月28日5．凝胶层析

(凝胶过滤、凝胶色谱、分子筛层析、分子排阻层析)

①定义：指混合物随流动相流经固定相的层析柱时，混合物中各组分按其分子大小不同而被分离的技术。第七页，共三十页，2022年，8月28日②基本原理：

固定相：凝胶，惰性三维空间多孔网状结构，故称分子筛，包括琼脂糖、交联葡聚糖、聚丙烯酰胺、琼脂糖-葡聚糖复合凝胶。

流动相：洗脱液pH7.4磷酸盐缓冲液第八页，共三十页，2022年，8月28日交联葡聚糖凝胶多聚葡萄糖与环氧丙烷交联而成，网状结构珠状颗粒，商品名为SephadexG系列G—交联度：G后面的阿拉伯数字表示不同的规格型号，有G-10，G-15，G-25，G-50，G-75，G-100，G-150，和G-200八种，具体含义为凝胶得水值的10倍或吸水量（g）/10g干胶交联度与孔径大小成反比：交联度越大，孔径越小，吸水性小；交联度越小，孔径越大，吸水性大。因此，“G”反映凝胶的交联程度，膨胀程度及分部范围。第九页，共三十页，2022年，8月28日长链状葡聚糖分子间以环氧丙烷连接第十页，共三十页，2022年，8月28日凝胶层析的基本原理样品加于柱上，样品随洗脱液的流动而向下移动，同时作垂直向下运动和不定向扩散运动→小分子可进入凝胶空内部，流程长，速度慢，后流出；大分子不能进入凝胶空内部，颗粒间移动，流程短，先流出→大小分子彼此分开第十一页，共三十页，2022年，8月28日第十二页，共三十页，2022年，8月28日第十三页，共三十页，2022年，8月28日③影响因素*层析柱的选择及装填：柱大小—分离样品量凝胶型号—分辨率：各种分子筛的孔隙大小分布有一定范围，有最大极限和最小极限。凝胶分离范围之外的分子，难以分离。如大小不同的两种全排阻分子/完全渗透分子。*洗脱液：溶解待分离物质，不变性*加样量：1%～5%*凝胶的再生第十四页，共三十页，2022年，8月28日离子交换层析定义:离子交换层析是利用固定相偶联的离子交换基团和流动相解离的离子化合物之间发生可逆的离子交换反应而进行的分离方法.第十五页，共三十页，2022年，8月28日原理:离子交换交换层析是利用离子交换剂对各种离子的亲和力不同，借以分离混和物中各种离子的一种技术。其主要特点是依靠带有相反电荷的颗粒之间的吸引力的作用。第十六页，共三十页，2022年，8月28日分类:阴离子交换剂带正电荷，与混合物中带负电的组分结合阴离子交换层析阳离子交换剂带负电荷，与混合物中带正电的组分结合阳离子交换层析第十七页，共三十页，2022年，8月28日第十八页，共三十页，2022年，8月28日交联葡聚糖凝胶层析介质的有关技术参数凝胶型号颗粒大小（μm)溶胀体积(ml/g)分离范围（Mr）G-1040～1202～3＜7×102G-1550～1502.5～3.5＜1.5×103G-2550～1504～61×103～5×103G-5040～1209～111.5×103～3×104G-7540～12012～153×103～8×104G-10040～12015～204×103～1×105第十九页，共三十页，2022年，8月28日分离依据：蛋白质理化性质的和个性实验原理共性：

*生命高分子：透析、超滤、超离心、凝胶层析

*蛋白质溶液是亲水胶体：稳定因素为水化膜和电荷→盐析/有机溶剂沉淀

*两性电解质和等电点：pH>pI，蛋白质带负电；反之带正电→电泳、离子交换层析

*有一定的功能：抗原性→免疫沉淀

个性：蛋白质的分子量、等电点、亲水程度、形状不同第二十页，共三十页，2022年，8月28日实验思路分段盐析去除杂蛋白凝胶层析脱盐交联葡聚糖吸水浓缩醋酸纤维素薄膜电泳鉴定上午完成先粗后细下午完成第二十一页，共三十页，2022年，8月28日①分段盐析：常用中性盐：硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。硫酸铵：温度系数小，溶解度大，蛋白谱广，分段盐析效果好，不易引起变性。溶液pH约4.5～5.5，可用硫酸/氨水按需要调节pH值。分段盐析：各种蛋白大小、亲水程度、pI不同，所需的盐浓度、pH也不一样。如清蛋白分子小，亲水性强，需高盐浓度才沉淀，球蛋白分子大，亲水性弱，较低盐浓度即可沉淀。因此调节盐浓度及pH可使各种蛋白质分段沉淀。实验流程及操作注意事项第二十二页，共三十页，2022年，8月28日影响因素：

①温度：温度与溶解度成正比。一般室温即可,少数温度敏感型蛋白质需4度操作，而血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白在25度比0度时溶解度低，更易盐析。

②pH值：大多数蛋白质在pI时溶解度最低。pH=pI效果更好。

③蛋白质浓度：浓度高时产生共沉。盐析前血清加等量生理盐水稀释，控制蛋白质含量在2.5-3.0%。第二十三页，共三十页，2022年，8月28日②凝胶层析脱盐：常用透析，需时较长，最好低温。也可用葡萄糖凝胶G-25/50过柱，用时较短。

固定相：sephadexG-25

流动相：pH7.4的0.01M磷酸盐缓冲液（0.9%NaCl）

原理同前，蛋白质大分子，硫酸铵小分子。第二十四页，共三十页，2022年，8月28日③浓缩：sephadexG-25吸水，利用高分子性质。第二十五页，共三十页，2022年，8月28日注意事项：

1．硫酸铵的滴加，边摇边逐滴加入

2．流洗柱子：3～4个柱长

3．上样：转圈滴加，起跑线一致

4．防止柱上液层干涸

5．洗脱液收集无需分部，用载玻片检测蛋白，无纳氏试剂

6．G-25干胶用纸条少量多次加入，液层高<0.5ml

7.用过的G-25干胶倒入收集缸，回收利用。第二十六页，共三十页，2022年，8月28日电泳：带电粒子在电场的作用下，向着与其电性相反的电极移动的现象。电泳技术：利用电泳现象对混合物进行分离分析的技术。电泳系统：电泳支持介质、电泳缓冲液、电场④鉴定：醋酸纤维素薄膜电泳第二十七页，共三十页，2022年，8月28日电泳用于分离物质的原理COO-COO-COOH╱+H+╱+H+╱Pr←————→Pr←————→Pr╲+OH-╲+OH-╲NH2NH3+NH3+PH>PIPH=PIPH<PI蛋白质为两性电解质，有一定的等电点，在大于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动，由于各种蛋白质的分子大小与结构不同，所带表面电荷的多少不同，因而在电场中向阳极移动的速度不同。经过一定的电泳时间后可形成许多蛋白质区带，每一个区带代表一组迁移率相近似的蛋白质。第二十八页，共三十页，2022年，8月28日醋酸纤维素薄膜电泳

介质：醋酸纤维素薄膜，纤维素的羟基经乙酰化所形成的纤维素醋酸酯。溶于有机溶剂后涂成薄膜，具均一的泡沫状结构，有强渗透性。

电泳缓冲液：pH8.6的巴比妥缓冲液第二十九页，共三十页，