实验一质粒的提取和鉴定

实验一质粒的提取和鉴定第一页，共三十三页，2022年，8月28日分子生物学从分子水平上研究生命现象物质基础的学科。研究细胞成分的物理、化学的性质和变化以及这些性质和变化与生命现象的关系，如遗传信息的传递，基因的结构、复制、转录、翻译、表达调控和表达产物的生理功能，以及细胞信号的转导等。第二页，共三十三页，2022年，8月28日基因工程第三页，共三十三页，2022年，8月28日移液器和EP管第四页，共三十三页，2022年，8月28日质粒质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，独立于染色体之外的、能自主复制的双链环状脱氧核糖核酸物质。质粒的存在使宿主具有一些额外的特性，如对抗生素的抗性等。F质粒(又称F因子或性质粒)、R质粒(抗药性因子)和Col质粒(产大肠杆菌素因子)等都是常见的天然质粒。

能稳定地独立存在于染色体外，并传递到子代，一般不整合到宿主染色体上。现在常用的质粒大多数是经过改造或人工构建的，常含抗生素抗性基因，是重组DNA技术中重要的工具。第五页，共三十三页，2022年，8月28日分类：单拷贝质粒；多拷贝质粒；紧密控制型；松弛控制型；第六页，共三十三页，2022年，8月28日第七页，共三十三页，2022年，8月28日质粒DNA的提取方法碱裂解法；煮沸裂解法；酚氯仿抽提法；概括起来主要是用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理。第八页，共三十三页，2022年，8月28日基本思路培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离质粒DNA(有时还要求纯化质粒DNA，根据实验所需)电泳检测；第九页，共三十三页，2022年，8月28日碱裂解法的基本原理十二烷基磺酸钠(SDS)可使细胞膜裂解。经SDS处理后，细菌染色体DNA会缠绕附着在细胞碎片上，同时由于细菌染色体DNA比质粒大得多，易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段。当用强热或酸、碱处理时，细菌的线性染色体DNA变性，而共价闭合环状DNA(CovalentlyclosedcircularDNA，简称cccDNA)的两条链不会相互分开。当外界条件恢复正常时，线状染色体DNA片段难以复性，而是与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起，而质粒DNA双链又恢复原状，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解状态存在于液相中。第十页，共三十三页，2022年，8月28日实验步骤1、将含有质粒的DNA细菌在LB培养基中培养过夜。取1.5mlLB培养液倒入1.5mleppendorf管中，4℃下12000g离心30秒。2、弃上清，将管倒置于卫生纸上数分钟，使液体流尽。3、菌体沉淀重悬浮于100μl溶液Ⅰ中（需剧烈振荡）。4、加入新配制的溶液Ⅱ200μl，盖紧管口，快速温和颠倒eppendorf管数次，以混匀内容物（千万不要振荡），冰浴2分钟。5、加入150μl预冷的溶液Ⅲ，盖紧管口，颠倒混匀，冰浴中5-10分钟，4℃下12000g离心5-10分钟。6、上清液（450uL）移入干净eppendorf管中，加入等体积的饱和酚（1:1），充分颠倒混匀，4℃下12000g离心10分钟。第十一页，共三十三页，2022年，8月28日7、将水相（400uL）移入干净eppendorf管中，加入等体积酚/氯仿，颠倒混匀，12000rpm离心10min。8、将水相（350uL）移入干净eppendorf管中，加入2倍体积的无水乙醇，振荡混匀后置于-20℃冰箱中20分钟，然后4℃下12000g离心10分钟。8、弃上清，将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出，加入0.5ml

70％乙醇洗沉淀一次，4℃下12000g离心5-10分钟。9、吸除上清液，将管倒置于卫生纸上使液体流尽，真空干燥10分钟或室温干燥。10、将沉淀溶于10μlTE缓冲液（pH8.0，含20μg/mlRNaseA）中，储于-20℃冰箱中。第十二页，共三十三页，2022年，8月28日LB液体培养基（Luria-Bertani）称取蛋白胨（Tryptone）10g，酵母提取物（Yeastextract）5g，NaCl10g，溶于800ml去离子水中，用NaOH调pH至7.5，加去离子水至总体积1升，高压下蒸气灭菌20分钟。第十三页，共三十三页，2022年，8月28日溶液I50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris.Cl（pH8.0），10mmol/L

EDTA（pH8.0）。溶液Ⅰ可成批配制，每瓶100ml，高压灭菌15分钟，储存于4℃冰箱溶液I：重悬细菌；葡萄糖：比重大，使细菌不易沉淀；Tris－HCl：缓冲体系；EDTA：螯合金属离子；第十四页，共三十三页，2022年，8月28日溶液Ⅱ0.2mol/L

NaOH（临用前用10mol/LNaOH母液稀释），1％SDS溶液II——破膜，变性基因组DNA和蛋白质；SDS——破膜作用，变性蛋白质；NaOH——破膜，变性基因组DNA；第十五页，共三十三页，2022年，8月28日溶液Ⅲ5mol/LKAc60ml，冰醋酸11.5ml，H2O28.5ml，定容至100ml，并高压灭菌。溶液终浓度为：K+3mol/L，Acˉ5mol/L。溶液III——中和溶液，复性质粒DNA；第十六页，共三十三页，2022年，8月28日酚/氯仿（1:1）酚——变性蛋白质；氯仿——萃取溶液中的酚；分为两层，上层为水层，下层为酚氯仿混合液。吸取时不要震荡。第十七页，共三十三页，2022年，8月28日乙醇无水乙醇（2倍体积）——沉淀质粒DNA；70%乙醇——洗涤质粒DNA沉淀，除去沉淀中的盐分；第十八页，共三十三页，2022年，8月28日电泳

Electrophoresis

第十九页，共三十三页，2022年，8月28日

一、定义

电泳—带电粒子在直流电场中向着电性相反电极移动的现象。电泳分析技术—利用电泳现象进行物质分离的技术。第二十页，共三十三页，2022年，8月28日二、电泳分析技术发展概况1809年发现电泳现象1937年Tiselius自由界面电泳1948年Wieland滤纸电泳1980年

毛细管电泳

(capiliaryelectrophoresis)第二十一页，共三十三页，2022年，8月28日三、电泳分析技术的分类1.根据被分离样品的量多少分析电泳制备电泳2.根据电泳电压的高低常压电泳0～500V

高压电泳500～3000V3.根据电泳中是否使用支持物自由电泳—不使用支持物，在溶液中进行。区带电泳—使用支持物第二十二页，共三十三页，2022年，8月28日4.按支持物的物理性状不同滤纸及其他纤维薄膜电泳，如醋酸纤维素、玻璃纤维、聚氯乙烯纤维凝胶电泳，如琼脂、琼脂糖、硅胶、淀粉胶、聚丙烯酰胺凝胶电泳粉末电泳，纤维素粉、淀粉、玻璃粉电泳丝状电泳，如尼龙丝、人造丝电泳第二十三页，共三十三页，2022年，8月28日5.按支持物的装置形式不同平板式电泳垂直板式电泳垂直柱式电泳第二十四页，共三十三页，2022年，8月28日6.根据电泳系统pH是否连续连续pH电泳—指电泳过程中pH保持不变；不连续pH电泳—指电极缓冲液和电泳支持物的不同区段也有不同的pH；第二十五页，共三十三页，2022年，8月28日电泳技术的特点:凡是带电物质均可应用某一电泳技术进行分离,并可进行定性或定量分析;样品用量极少;设备简单;可在常温进行;操作简便省时;分辨率高.第二十六页，共三十三页，2022年，8月28日四、电泳的基本原理一个分子，如能解离或能吸附带电质点，在电场中便会向正极或负极移动。

第二十七页，共三十三页，2022年，8月28日移动速度——以蛋白质分子为例:F=EQ（Q：有效电荷;E：电位梯度）F’=6rv（F’：摩擦阻力;v：在介质粘度η中半径为r的颗粒的移动速度）F=F’EQ=6rv

EQv=————6r

第二十八页，共三十三页，2022年，8月28日

迁移率（Mobility)——带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度。

VQM==E6r

第二十九页，共三十三页，2022年，8月28日五、影响电泳速度的因素1.电场强度（E）E↑→电流↑→热效应→支持介质上的水分蒸发→样品的热变性

E↓→电泳速度慢→延长电泳时间→样品扩散→区带模糊不清→分辨率下降2.带点颗粒的半径

r↑→阻力↑→电泳速度变慢3.支持物介质——吸附作用；电渗作用；分子筛作用缓冲液

离子强度（I）：I↑→缓冲能力越大→缓冲液所载的分电流增加，而样品所载的电流相应减少→电泳速度减慢

pH：pH值决定了化合物解离的程度，也决定了质点所带的净电荷。第三十页，共三十三页，2022年，8月28日电泳在一定电场强度下，DNA分子的迁移取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型(相对分子质量不同的DNA片段泳动速度不一样)，且DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子。第三十一页，共三十三页，2022年，8月28日琼脂糖凝胶从琼脂中除去带电