实时荧光定量介绍

实时荧光定量介绍1February2,2023第一页，共五十页，2022年，8月28日主要内容RealTimePCR基础知识12RealTimePCR实验方法3RealTimePCR解析方法4RealTimePCR应用实例实时荧光定量PCR介绍2February2,2023第二页，共五十页，2022年，8月28日RealTimePCR基础知识1.RealTimePCR的用途及原理2.RealTimePCR的检测方法RealTimePCR基础知识1实时荧光定量PCR介绍3February2,2023第三页，共五十页，2022年，8月28日RealTimePCR的用途RealTimePCR用途定性分析定量分析病毒及病原菌定量分析导入基因拷贝数解析GMO定量检测差异显示结果验证基因芯片结果验证siRNA效果确认mRNA表达量分析病毒及病原菌检测物种鉴定基因分型绝对定量相对定量实时荧光定量PCR介绍4February2,2023第四页，共五十页，2022年，8月28日RealTimePCR的原理

激发光发射光使用RealTimePCR扩增装置实时监测PCR扩增产物并进行分析的方法。RealTimePCRCt值实时荧光定量PCR介绍5February2,2023第五页，共五十页，2022年，8月28日RealTimePCR基础知识1.RealTimePCR的用途及原理2.RealTimePCR的检测方法RealTimePCR基础知识1实时荧光定量PCR介绍6February2,2023第六页，共五十页，2022年，8月28日TaqManProbeCyclingProbeMolecularBeaconetc.SYBRGreenI荧光染料嵌合法荧光探针法RealTimePCR的检测方法实时荧光定量PCR介绍7February2,2023第七页，共五十页，2022年，8月28日荧光染料嵌合法（SYBRGreenI）SYBRGreenI：是一种能结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的 具有绿色激发波长的染料。SYBRGreenI实时荧光定量PCR介绍8February2,2023第八页，共五十页，2022年，8月28日Primer退火FFFFSYBRGreenI法作用机理示意图Pol.FPrimerPol.延伸FFFFFFPrimer热变性FFFF实时荧光定量PCR介绍9February2,2023第九页，共五十页，2022年，8月28日TaqMan法作用机理TaqMan探针为一寡核苷酸，5’端标记一个报告基团（Reporter），3’端标记一个淬灭基团（Quencher）。RQ实时荧光定量PCR介绍10February2,2023第十页，共五十页，2022年，8月28日RQPrimerRQPrimerRQPrimerPol.Pol.热变性退火延伸TaqManProbe法原理示意图

实时荧光定量PCR介绍11February2,2023第十一页，共五十页，2022年，8月28日One-StepRT-PCR特异性高多重PCR检出Probe设计要求高

Probe法

Probe合成费用高SYBRGreenI法与Probe法比较常用于mRNA表达量分析等SYBRGreenI法

简便易行价格便宜要求反应的特异性不能进行多重PCR常用于SNP解析，病毒、病源菌检测实时荧光定量PCR介绍12February2,2023第十二页，共五十页，2022年，8月28日主要内容2RealTimePCR实验方法反转录反应RealTimePCR反应实时荧光定量PCR介绍13February2,2023第十三页，共五十页，2022年，8月28日RT

Primer的选择

RandomPrimer

OligodTPrimerGeneSpecificPrimerRandom6merPrimerGeneSpecificPrimerOligodTPrimerPCRR-PrimerPCRF-Primer实时荧光定量PCR介绍14February2,2023第十四页，共五十页，2022年，8月28日目的片段在距Poly(A)Tail1.5kbp以内适用，RT效率较高。OneStepRT-PCR只能使用GeneSpecificPrimer，但不适用于复数基因的检出。5’3’GeneSpecificPrimer目的片段RFAAA···5’3’目的片段RF1,500baseOligodTPrimerRandom目的片段5’3’RF目的片段在mRNA任何位置都能使用。通常mRNA表达量分析最适。OligodTPrimer5’3’RFAAA···目的片段Random适用于mRNA表达量分析，提升反应检测的灵敏度。RT

Primer的选择实时荧光定量PCR介绍15February2,2023第十五页，共五十页，2022年，8月28日RealTimePCR引物设计目的是获得目的基因，对非特异性反应和引物二聚体要求不严格。目的是让目的基因按照理论值进行扩增，对非特异性反应和引物二聚体要求严格。RealTimePCR用引物与普通PCR引物设计要求不同=>对引物设计要求严格普通PCR引物RealTimePCR引物实时荧光定量PCR介绍16February2,2023第十六页，共五十页，2022年，8月28日两条引物的Tm值尽量接近，应用专用软件计算Tm值★★★Tm值40-60%(最好45-55%)

★GC含量Primer长度80-150bp(尽量限制在300bp以内)★扩增片段大小★17-25base使用BLAST检索，确认引物特异性★★★特异性

△

引物内部或两条引物之间避免3base以上的互补序列

△

引物3’末端避免2base以上的互补序列★★★互补性3’末端序列

△

整体上碱基不能过偏

△

个别部分避免GCrich或ATrich(特别是3’端)

△

避免T/C连续，A/G连续★序列★

△

3’末端避免GCrich或ATrich

△

3’末端碱基最好为G或C

△

3’末端碱基尽量避免为T尽量在Exonjunction上设计引物，限制基因组DNA扩增★★★RT-PCR用引物RealTimePCR引物设计原则实时荧光定量PCR介绍17February2,2023第十七页，共五十页，2022年，8月28日探针的Tm比引物高8-10℃★★★Tm值20-24bp★★Probe长度探针5’末端的第一个碱基不能是G★5’末端序列△目的序列GC含量相对较高的区域设计

△整体上碱基不能过偏

△个别部分避免GCrich或ATrich(特别是3’端)；避免T/C

连续，A/C连续★序列Probe内部或Probe与两条引物之间避免3base以上的互补序列★★★互补性BLAST检索确认Probe特异性★★★特异性RealTimePCR用TaqMan探针设计原则RealTimePCR探针设计原则实时荧光定量PCR介绍18February2,2023第十八页，共五十页，2022年，8月28日线性关系、扩增效率确认检测灵敏度确认PCR扩增效率（E）：35Cycles内可得到好的定量结果。如果采用SYBR检测方法，30Cycles内无非特异性产物扩增。NoTemplateControl确认30Cycles内无引物二聚体产生。相关系数（r2）：大于0.98反应性能确认实时荧光定量PCR介绍19February2,2023第十九页，共五十页，2022年，8月28日主要内容3RealTimePCR解析方法1.标准曲线分析2.融解曲线分析3.绝对定量和相对定量解析方法实时荧光定量PCR介绍20February2,2023第二十页，共五十页，2022年，8月28日标准曲线制作扩增曲线标准曲线标准品梯度的选择：5～6个梯度标准品稀释倍数的选择：标准品稀释倍数通常为10105104103102101100

105

104103102101100实时荧光定量PCR介绍21February2,2023第二十一页，共五十页，2022年，8月28日标准品的种类基因组DNA

质粒TotalRNA&cDNA

体外转录RNADNA样品定量标准品

RNA样品定量标准品实时荧光定量PCR介绍22February2,2023第二十二页，共五十页，2022年，8月28日质粒标准品构建流程基因组DNAPCR目的基因克隆目的基因目的基因目的基因质粒质粒提取，OD值定量。将质粒梯度稀释至105-101copies/ul，作为标准品。实时荧光定量PCR介绍23February2,2023第二十三页，共五十页，2022年，8月28日体外转录RNA标准品构建流程RNA纯化后，测OD定量。将RNA梯度稀释至105-101copies/ul，作为标准品。T7RNApolymerase体外转录RNATotalRNAPCRcDNARTT7PromoterTTTT•••TPCR产物目的基因目的基因目的基因AAAA•••AAAAA•••A实时荧光定量PCR介绍24February2,2023第二十四页，共五十页，2022年，8月28日理想的标准品扩增曲线基线平整NegativeControl为水平线指数区较明显，陡度大平台区汇于一起线性范围宽实时荧光定量PCR介绍25February2,2023第二十五页，共五十页，2022年，8月28日理想的标准曲线

相关系数（r2）：大于0.98，越接近1，结果可信度越高。扩增效率（E）：，越接近1，越理想。扩增效率

相关系数

扩增效率（E）计算方法

标准曲线X轴表示起始模板浓度（log10)，Y轴表示Ct值时

E=10-1/a-1

标准曲线X轴表示Ct值，Y轴表示起始模板浓度（log10)E=10-a-1实时荧光定量PCR介绍26February2,2023第二十六页，共五十页，2022年，8月28日RealTimePCR解析方法3RealTimePCR解析方法1.标准曲线分析2.融解曲线分析3.绝对定量和相对定量解析方法实时荧光定量PCR介绍27February2,2023第二十七页，共五十页，2022年，8月28日融解曲线分析

Tm值是指双链DNA分子解链一半时的温度。

SYBRGreenI法进行检出时，要根据融解曲线确认PCR产物的特异性。实时荧光定量PCR介绍28February2,2023第二十八页，共五十页，2022年，8月28日特异性产物非特异产物引物二聚体对PCR产物特异性进行分析融解曲线分析实时荧光定量PCR介绍29February2,2023第二十九页，共五十页，2022年，8月28日3RealTimePCR解析方法1.标准曲线分析2.融解曲线分析3.绝对定量和相对定量解析方法RealTimePCR解析方法实时荧光定量PCR介绍30February2,2023第三十页，共五十页，2022年，8月28日绝对定量解析方法提取样品引物设计标准品制备RealTimePCR反应数据分析流程实时荧光定量PCR介绍31February2,2023第三十一页，共五十页，2022年，8月28日绝对定量解析方法通过制作标准曲线来确定样品的初始模板拷贝数或浓度。通常应用于病毒、细菌、衣原体、支原体的定量检测及转基因食品的检测。105104103101扩增曲线图标准曲线图

检测样品检测样品102实时荧光定量PCR介绍32February2,2023第三十二页，共五十页，2022年，8月28日相对定量解析方法以上条件不可能同时得到满足，必须用内对照基因（管家基因）校正，进行相对表达量分析。SampleBSampleA目的基因扩增效率相同RNA提取效率相同细胞起始数相同进行相对表达量分析必要性实际上目的基因表达量分析实时荧光定量PCR介绍33February2,2023第三十三页，共五十页，2022年，8月28日相对定量解析方法管家基因

维持细胞基本代谢活动所必须的基因,如：GAPDH、β-actin等。筛选方法

根据文献提供通过具体实验筛选实时荧光定量PCR介绍34February2,2023第三十四页，共五十页，2022年，8月28日主要内容RealTimePCR基础知识12RealTimePCR实验方法3RealTimePCR解析方法4RealTimePCR应用实例

对SARS病毒培养液中所含SARS病毒RNA进行定量分析绝对定量相对定量

分析小鼠某目的基因药物处理不同时间点表达量变化实时荧光定量PCR介绍35February2,2023第三十五页，共五十页，2022年，8月28日绝对定量应用例

对SARS培养液中所含SARS病毒RNA进行定量检测方法

TaqMan®

probe法

检测样品3个从SARS病毒培养液中提取的TotalRNA

目的基因

SARS病毒RNA

内参

SARSInternalControl

RNA

标准品

SARSControlRNA

试剂

OneStepPrimeScript®RT-PCRKit（PerfectRealTime）（DRR064）

仪器

SmartCyclerⅡ实时荧光定量PCR介绍36February2,2023第三十六页，共五十页，2022年，8月28日

SYN247F02SYN247R03SYN247F01SYN247R02SYN247R01SYN247F01BamHⅠ

HindⅢpBluescriptIISK(+)VectorT7PromoterBamHⅠ

HindⅢSacⅠsiteSARSControlRNA构建绝对定量应用例

对SARS培养液中所含SARS病毒RNA进行定量实时荧光定量PCR介绍37February2,2023第三十七页，共五十页，2022年，8月28日

纯化的SARSControlRNAOD值测定结果

体外转录的SARSControlRNA电泳照片M1M2M1:-HindⅢdigestM2:DL2,000MarkerDNaseI处理前DNaseI处理后绝对定量应用例

对SARS培养液中所含SARS病毒RNA进行定量实时荧光定量PCR介绍38February2,2023第三十八页，共五十页，2022年，8月28日DNA

BNITMSARAs2AdaptorRSacⅠsiteBamHⅠsiteBNITMSARS1AdaptorFT7PromoterSARSInternalControlRNA的构建AApBluescriptIISK(+)Vector

绝对定量应用例

对SARS培养液中所含SARS病毒RNA进行定量实时荧光定量PCR介绍39February2,2023第三十九页，共五十页，2022年，8月28日探针的选择

TemplatePrimerTaqMan®Probe5’端报告基团3’端淬灭基团SARSControlRNAorSARSGenomicRNA共用FAM标记Eclipse标记SARSInternalControlRNA共用ROX标记Eclipse标记绝对定量应用例

对SARS培养液中所含SARS病毒RNA进行定量实时荧光定量PCR介绍40February2,2023第四十页，共五十页，2022年，8月28日SARSControlRNA105-101扩增曲线SARSGenomicRNASample1、２、３扩增曲线

SARSInternalControlRNA扩增曲线

标准曲线绝对定量应用例

对SARS培养液中所含SARS病毒RNA进行定量实时荧光定量PCR介绍41February2,2023第四十一页，共五十页，2022年，8月28日定量结果对三个样品所含SARS病毒RNA进行了准确定量。绝对定量应用例

对SARS培养液中所含SARS病毒RNA进行定量实时荧光定量PCR介绍42February2,2023第四十二页，共五十页，2022年，8月28日相对定量应用例

分析小鼠不同组织中PAH基因表达量的变化情况检测方法

SYBRGreenI荧光嵌合法管家基因

GAPDH基因目的基因

PAH基因标准品

cDNA试剂

PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser（DRR047）

SYBR®

PremixExTaqTMII(TliRNaseHPlus)（DRR820）

仪器

ThermalCyclerDice®RealTimeSystem（TP800）

实时荧光定量PCR介绍43February2,2023第四十三页，共五十页，2022年，8月28日TotalRNA提取TotalRNA基因组DNA去除标准品RNA制备标准曲线制作及预实验详细的实验资料获取实验设计及引物设计、合成样品RealTimePCR反应相对定量计算及数据分析数据整理及论文撰写相对定量应用例

分析小鼠不同组织中PAH基因表达量的变化情况实时荧光定量PCR介绍44February2,2023第四十四页，共五十页，2022年，8月28日提取TotalRNA后电泳照片提取试剂：TaKaRaRNAisoPlus

（D9108）相对定量应用例

分析小鼠不同组织中PAH基因表达量的变化情况MCLBMM：DL2,000DNAMarkerC：ControlRNAL：LiverRNAB：BrainRNA实时荧光定量PCR介绍45February2,2023第四十五页，共五十页，2022年，8月28日目的基因标准曲线制作结果扩增曲线图融解曲线图标准曲线图管家基因标准曲线制作结果相对定量应用例

分析小鼠不同组织中PAH基因表达量的变化情况实时荧光定量PCR介绍46February2,2023第四十六页，共五十页，2022年，8月28日扩增曲线图样品目的基因定量结果样品管家基因定量结果管家基因GAPDH目的基因PAH定量结果平均值定量结果平均值通过GAPDH校正的PAH校正值小鼠肝脏和脑中PAH的相对表达量样品a12288002221751966002011750.9053757212700204400样品a2227300207100219900196600样品b133360034097576.8082.182.41×10-4134030092.65样品b235410082.4633590076.80相对定量应用例

分析小鼠不同组织中PAH基因表达量的变化情况实时荧光定量PCR介绍47February2,2023第四十七页，共五十页，2022年，8月28日通过双标准曲线方法计算得出，苯丙氨酸羟化酶（PAH）基因在小鼠肝脏中的表达量明显高于其在脑组织中的表达水平，二者的表达量比例约为3757：1。相对定量应用例

分析小鼠不同组织中PAH基因表达量的变化情况实时荧光定量PCR介绍48February2,2023第四十八页，共五十页，2022年，8月28日RealTimePCR试剂使用荧光探针检测使用Cycling探针检测扩