神经系统安全性评价3 - 副本

药物的神经系统安全性评价

第一节：概述

第二节：药物神经系统安全性评价的内容

第三节：药物安全性评价的意义

一、概述

近年新药研发领域，大量药物由于神经系不良反应而退出市场，甚至有药物由于神经系统不良反应不能进入临床试验，从而造成人力资源的巨大浪费，人为地拉长了新药研发的周期，给患者造成了严重的身心危害。

药物的神经系统不良反应包括：

1.药物致脑炎样反应：人用狂犬病疫苗、麻疹毒活疫苗、咪唑类驱虫药等。

2.药物致脑血管损害：三环类抗抑郁药、肾上腺皮质激素、雄激素等，均可致血压升高，造成脑出血。

3.药物致颅内压增高：皮质激素类、氨节西林、氟喹诺酮类等。

4.药物致中毒性脑病：头孢菌素类、抗结核药、苯妥英钠、丙戊酸钠、卡马西平等。

5.药物致锥体外系反应：吩噻嗪类三氟拉嗪、三氟丙嗪、甲哌氯丙嗪、氟奋乃静和奋乃静、氯丙嗪；某些钙离子拮抗剂:盐酸氟桂嗪以及甲氧氯普胺等。

6.药物致周围神经损害：抗结核药物、氨基糖苷类、利尿剂等。

7.药物致神经—肌肉阻滞型病变：肾上腺皮质激素类、氨基糖苷类抗生素、氯喹、苯妥英钠等。

8.药物致中枢神经系统的其它不良反应：甲硝唑、万古霉素、洋地黄、喹诺酮类抗生素等。神经系统安全性在体研究1.运动/感觉反射：采用热刺激大鼠尾部的方法，测定甩尾潜伏期(TFL)作为痛阈，以痛阈提高的百分数作为评判对神经系统影响的指标。2.自发活动计数：小鼠自主活动记录仪是通过检测大小鼠自发的水平运动或直立运动的频度从而评价小鼠自主活动的能力。3.运动协调性：转棒式疲劳仪可做疲劳实验，骨骼肌松驰实验、中枢神经抑制实验，以及其它需用运动方式检测药物作用的实验。4.学习记忆：被动回避跳台试验和方位水迷宫是简单的学习模式,可综合反映动物的学习和记忆能力。5.体温的变化(一)动物:SPF级动物昆明种小鼠共207只，符合纳入标准200只。200只小鼠雌雄各半，体重18-22g，饲养于国家成都中药安全性评价中心普通动物房，实验前动物适应环境。选择健康(雌性须未孕)动物作为受试动物，雄性、雌性动物分开饲养，每笼饲养5只，饲养条件符合国标GB14925-2001，室温21士5℃，相对湿度55士15%,12小时明暗交替。动物以鼠饲料喂养，去离子水自由饮用。以丙泊酚为例：从运动/感觉反射、自发活动计数、运动协调性和学习记忆四方面评价HX0507对小鼠神经系统的安全性。(二)仪器1.小鼠自主活动测试仪:仪器型号为JXDH-I，由河北冀星试验仪器公司提供。活动仪中装有定位的红外线光束，小鼠在有机玻璃格中活动可切断光束，活动仪则自动记录小鼠切断光线的次数，即记录自发活动数。2.小鼠甩尾仪:由BiologicalReseachApparatus(Italy)公司提供。有辐射热加热点，可记录小鼠逃避热反射的时间。3.转杆仪:XZC-4B转棒式疲劳仪。调整传送带位置，按动转动按钮，转棒转动，调整疲劳仪的转速为巧转/分。提小鼠尾将小鼠放到转棒上按下清零按钮，清零后开始记时，当小鼠跌落下来后压动下踏板，记时器被锁住，显示时间为小鼠在转棒上停留的时间。4.Morris水迷宫:北京天坛公司制造，由平台、不锈钢圆形水槽、不锈钢支架，摄像机支架、摄像机及广角镜头、图像采集卡和软件等部分组成。5.其他:电子天平、秒表、Iml注射器、小鼠固定器等。(三)实验分组:根据《化学药物一般药理学研究技术指导原则》，对神经系统应“定性和定量评价给药后动物的运动功能、行为改变、协调功能、感觉/运动反射和体温等的变化”。小鼠共计207只，符合纳入标准200只。200只小鼠分为四大组。第一大组观测甩尾潜伏期第二大组观测自发活动计数第三大组观测小鼠转杆疲劳仪落下个数第四大组观测逃避潜伏期每一大组各用5O只(体温的测定在Beagle犬中进行)，雌雄各25只，随机再分为5小组，即HX0507高、中、低3个剂量组、DIPRIVAN对照组及溶剂(生理盐水)对照组，每小组10只动物。

神经系统安全性离体研究对小鼠脑组织重量的影响：

脑组织脏器系数的测定：

脑组织蛋白含量的测定：对小鼠脑组织脂质过氧化作用的影响：脑组织SOD活力，GSH-Px活力，MDA含量的测定

对小鼠脑组织神经递质的影响：脑组织乙酰胆碱，NO，Glu含量的测定

对小鼠脑组织能量代谢的影响：脑组织SDH活性，ATPase活性的测定

实验动物与分组实验动物健康小鼠48只,体重（18士2）g，雌雄各半。按照随机分组的原则，将小鼠分为对照组和实验组，剂量（高、中、低）分别为21.Omg/m3(1/24LC50),42.Omg/m3(1/12LC50)和84.0mg/m3(1/6LC50)。每组12只小鼠，雌雄各半。实验分组染毒方法采用静式吸入染毒，每天2h，每周6d，共染毒12w，对照组吸入新鲜空气，染毒组吸入既定浓度的甲醛。主要试剂与仪器氯化乙酞胆碱(Ach)超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒谷肤甘肤过氧化物酶(GSH-Px)试剂盒丙二醛(MDA)试剂盒一氧化氮(NO)试剂盒谷氨酸(Glu)试剂盒琥珀酸脱氢酶(SDH)试剂盒ATP酶(ATPase)试剂盒考马斯亮蓝蛋白试剂盒752紫外光栅分光光度计电热恒温水浴箱离心机台式离心机磁力加热搅拌器TN-1OOB型托盘式扭力天平结果甲醛对小鼠脑组织脂质过氧化作用的影响1/6LC50组小鼠脑组织SOD活力明显低于对照组和1/24LC50组(P<0.05)，各染毒组小鼠脑组织GSH-Px活性明显低于对照组(P<0.01或P<0.05)，而MDA含量显著高于对照组(P<0.01)。甲醛对小鼠脑组织神经递质的影响各染毒组小鼠脑组织Ach含量低于对照组，其中1/12LC50剂量组和1/6LC50。剂量组有显著性差异(P<0.O1),1/12LC50和l/6LC50。剂量组小鼠脑组织Ach含量显著低于1/24LC50组(P<0.0l);NO较对照组有所降低，但均没有显著性差异;各染毒组小鼠脑组织Glu含量明显高于对照组(P<0.01)o甲醛对小鼠脑组织能量代谢的影响各染毒组小鼠脑组织SDH均下降，其中1/6LC50组与对照组比较有显著性差异(P<0.05)，各染毒组Na+-K+ATPase、Ca2+-Mg2+ATPase的活性均下降，但都没有显著性差异。℃以吗啡为例讨论药物对神经系统的不良反应丘脑内侧与疼痛整合、感受有关边缘系统及蓝斑核与情绪、精神有关延髓孤束核阿片受体与呼吸、咳嗽有关脑干极后区阿片受体与胃肠道有关水通道AQP4参与吗啡依赖的机制研究

水通道4（Aquaporin4，AQP4）是中枢神经系统中含量最丰富的水通道亚型，在中枢神经系统水代谢和渗透压调节中占据主导地位。我室前期实验证明AQP4与吗啡成瘾密切相关，在吗啡依赖形成过程中，AQP4与GLT-1(谷氨酸转运体-1)的表达均下调。AQP4基因敲除能够抑制吗啡慢性处理所致的GLT-1表达下调、谷氨酸重摄取能力的降低及突触间隙谷氨酸水平的改变，并且给予GLT-1特异性抑制剂二氢卡因酸盐（Dihydrokainate，DHK）能够增加AQP4基因敲除小鼠吗啡躯体依赖的形成。但AQP4与GLT-1之间是否有直接关系仍然不清楚。大鼠采用递增给药的方式，从第1天至第5天皮下注射吗啡，剂量分别10、20、30、40、50mg/kg，每天两次（8:00和17:00），建立慢性吗啡躯体依赖模型。用戒断症状评分以判断模型建立是否成功。症状：死狗样摇体、齿抓、咀嚼、纵涎、流泪、毛发直立、眼睑下垂、腹泻等戒断症状进行评分

通过实时定量PCR(Real-timePCR)Westernblot方法，从mRNA水平和蛋白水平检测AQP4、GLT-1、μ阿片受体（MuOpiateReceptor，MOR）在大鼠前额叶皮层、海马、伏隔核及纹状体的表达变化。

引物设计与合成经PrimerExpress3.0引物软件对大鼠AQP4、GLT-1、MOR和β-actin的序列进行引物设计。引物由北京博迈德科技发展有限公司合成。

AQP4:Forwardprimer：5’TGGCAGTTTTGTGTCTGTGG3’Reverseprimer：5’CGCCTTGGTTCTGTAGGTTC3’GLT-1:Forwardprimer：5’GCAGGTGGAAGTGCGCATGCAC3’Reverseprimer：5’CACATACTGCTCCCAGGATGACA3’MOR:Forwardprimer：5’GCCTGATGATCTTACGACTCAAGA3’Reverseprimer：5’GCGCAGATTCCTGTCCTTTT3’β-actin:Forwardprimer：5’GGGAAATCGTGCGTGACATT3’Reverseprimer：5’GCGGCAGTGGCCATCTC3’

QP4、GLT-1、MOR在大鼠吗啡躯体依赖模型中伏隔核mRNA表达的变化QP4、GLT-1、MOR在大鼠吗啡躯体依赖模型中纹状体mRNA表达的变化QP4、GLT-1、MOR在大鼠吗啡躯体依赖模型中海马mRNA表达的变化W-BQP4、GLT-1、MOR在大鼠吗啡躯体依赖模型中前额叶皮层蛋白表达的变化AQP4、GLT-1、MOR在星形胶质细胞吗啡依赖模型中表达变化新生SD大鼠皮层星形胶质细胞的分离与培养

用荧光显微镜及CCD进行图像采集。

吗啡激动阿片受体后，通过G蛋白抑制腺苷酸环化酶，降低细胞内的CAMP（环磷腺苷酸）水平。

星形胶质细胞吗啡依赖模型的建立实验分组吗啡组(Mor)、纳洛酮伴随吗啡给药组（Nalo+Mor）。按照随机分组原则，将培养至第15天的星形胶质细胞分为如下几组：对照组(Con)、吗啡组(Mor)、纳洛酮伴随吗啡给药组（Nalo+Mor）。

所有细胞均采用3次独立培养的细胞进行重复，避免不同细胞培养造成的实验结果的差异。

DMEM（Dulbecco’sModifiedEagleMedium，高糖型）培养基、MEM（ModifiedEagleMedium）培养基、马血清（Equineserum）、胎牛血清（FetalBovineSerum）均购自Gibco公司；L-多聚赖氨酸（poly-L-lysine，P1524）、阿糖胞（cytosinearabinofuranoside，Ara-C）、谷氨酰胺（L-glutamine）、dBcAMP（N6,2’-O-Dibutyryladenosine3’5’-cyclicmonophosphatesodiumsalt）、纳洛酮（Naloxone）均购自Sigma公司；4′,6-二脒基-乙苯基吲哚（4,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI）购自Amresco公司；GFAP抗体购自antaCruz公司；山羊抗兔Ig-G/FITC、山羊血清工作液、一抗稀释液均购自北京中杉金桥公司

时间分辨荧光共振能量转移免疫实验（LANCEcAMP试剂盒）该试剂盒是一种时间分辨的荧光共振能量转移免疫分析，该反应是一个竞争免疫反应，即铕标的cAMP示踪复合物与体系中的cAMP竞争结合标有AlexaFlour47染料的cAMP抗体。铕标cAMP示踪复合物是通过Biotin标记的cAMP与铕标的抗生物素蛋白链菌素与抗体的复合物紧密结合产生的。当抗体结合到示踪剂上时，340nm的激发光激发铕标分子，导致能量转移到AlexaFluor647染料上，结果产生665nm的发射光。荧光的强度与样品中的cAMP含量成反比。本试剂盒用于检测在GPCR激动剂刺激下活细胞或者细胞膜制备品产生的cAMP。对于偶联Gas的受体，激动剂刺激导致665nm的荧光强度降低，而拮抗剂则可以逆转这一效应吗啡慢性处理细胞72h后，用10μM的纳洛酮处理催促(30min),观察cAMP发生超射的情况。cAMP的变化具有显著差异（F=21.45p=0.0018<0.05）。吗啡处理组（Mor）纳洛酮催促30min，胞内cAMP含量明显升高，与对照组（Con