届药学专业本科生毕业论文

本科生毕业论文（设计）题姓学专班学

目名院业级号

白藜芦醇对亚硝酸盐清除及亚硝胺阻断作用研究刘玉锋食品药品学院药物制剂09级2班2303090213精选资料导教:

张孝林

职:

讲师2012年12安徽科技学院教务处可修改编辑2222目

录摘要·················································································································1关键··············································································································1前言·················································································································11剂和仪····································································································21.1试剂···········································································································21.2仪器···········································································································22原理·············································································································22.1亚硝酸钠的清除率的测定···········································································22.2阻断亚硝胺合成的原···············································································23验方法·······································································································33.1溶液的配·································································································33.2NaNO标准液的制备及吸光度的测定·······················································33.3不同浓度白藜芦醇溶液在时对亚硝酸钠的清除率的测定··················43.4不同浓度白藜芦醇溶液在时对亚硝胺合成的阻断率测定··················44结果及分···································································································54.1NaNO溶液的标准曲线的绘制···································································54.2不同浓度的白藜芦醇在对亚硝酸钠的清除率及对亚硝胺的阻断率·55论及结····································································································7致谢·················································································································7参考文献··········································································································8精选资料英文摘要··········································································································9白藜芦对硝酸盐清及亚硝阻断作研究药物制剂：刘玉锋指导老师：张孝林摘：目：以亚硝酸盐的清除率和亚硝胺合成的阻断率为指标，研究不同浓度的白芦醇在酸性下对亚硝酸盐的清除和对亚硝胺合成的阻断作用。

方法分别配制0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.8mg/mL、0.16mg/mL、0.32mg/mL和0.64mg/mL浓的白藜芦醇溶液和5ug/mL亚酸钠溶在pH=3模胃条件下采用分光光度法别测定不同浓度的白藜芦醇对亚硝酸钠的清除率及亚硝胺生成的阻断[。结：酸性条件下，不同浓度的白藜芦醇对亚硝酸钠均有较强清除作用，在浓度小0.32时着浓度增大而增大最大达到63.48%同时对亚硝胺生成有较强的阻断率大到40.94%结：可修改编辑精选资料白藜芦醇对亚硝酸盐有很强的清除能力，对亚硝胺的生成有较强的阻断能力。关键词亚硝酸盐，白藜芦醇，分光光度法，亚硝胺，清除，阻断癌症是当前威胁人类生活的最大杀手,根据世界卫生组织统计,全世界每年约有500万左右的人被癌症夺去生命。在致癌物中,亚硝胺是最令人关注的一类化学致癌物质亚硝酸盐作为一种发色剂和防腐剂2]

在肉制品加工中得到了普遍的应用3]

许多蔬菜中天然含有的硝酸盐在人体内通过细菌的作用也可被还原为亚硝酸盐硝酸盐是合成亚硝胺的前体之一[4]，人体内的这些亚硝酸盐在一定条件下可以与食物中的仲胺叔胺等形成亚硝胺。N-亚硝基化合物是一种致癌性很强的化合物5]

，已研究的近300种N-亚硝基化合物中，约90%以上具有动致癌性，并证明N-亚基化合物可在体内外由前体物胺类与硝酸盐或亚硝酸盐形成[6]

。在体内代谢过程中，特别是在胃液中容易形成亚硝胺

因此降低胃内的亚硝酸盐含量及阻断亚硝胺前提的合成[7]

从而达到防癌抗癌的目的是人类同癌症斗争的有效途径之一，而白藜芦醇在这方面的研究鲜见报道。白藜芦醇(resveratrol简称Res)是非黄酮类的多酚化合物，日本人Tokaoka1940年首次从毛叶藜芦的根部分离得到1963等提出白藜芦醇是某些草药治疗炎症类代谢紊乱和心脏疾病等的有效成分存在于植物中的天然抗氧化剂葡萄、虎杖等[8]

被列为抗心血管抗癌最有前景的药物之一。白藜芦醇具有优良的药理活性和保健功能其市场需求很大且与日剧增目前已有大部分国家和地区都开发了白藜芦醇的相关保健品和其他产品。中国已将含白藜芦醇的植物提取物制成降脂美容的天然保健食品美国也已把白藜芦醇作为膳食补充剂本已将从植物提取的白藜芦醇作为食品添加剂[9]

白藜芦醇的药理功能引起了人们的广泛兴趣，因为它涉及到与人体健康密切相关的许多生理疾病，例如，动脉粥样化、老年痴呆症、病毒性肝炎、胃溃疡、炎症与过敏反应可修改编辑00x0精选资料等。随着人们对白藜芦醇的深入研究，已经显示白藜芦醇具有抗癌、抗氧化、抗菌、抗炎以及预防食物过敏等作用，可广泛地应用于医药、保健品、食品、化妆品等领域。所以，对白藜芦醇的研究及开发是白藜芦醇对亚硝酸盐的清除及阻断作用具有良好的市场前景及重要的意义。11.1试剂白藜芦醇（纯99%，购于陕西西慈生物技术有限公司）、蒸馏水、二乙胺盐酸盐、二水合柠檬酸三钠、十二水合磷酸氢二钠、二甲胺盐酸盐、磷酸二氢钠（均AR，购于国药集团化学试剂有限公司）、亚硝酸钠（AR，淮化试剂厂）、无水对氨基苯磺酸（上海山浦化工有限公司）95%乙醇、氢氧化钠、盐酸（均，合肥工业大学化学试剂厂）1.2仪器紫外可见分光光度计UV-5500PC型（上海元析仪器有限公司子分析天平（上海精密科学仪器有限公司温水浴（江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司工作台（苏州苏净有限公司）22.1亚硝酸钠的清除率的测定亚硝酸钠在弱酸性的条件下,能与氨基苯磺酸重氮化后,再与N-1-萘乙二胺盐盐偶合生成红色的化合物，本实验通过测定相同条件下亚硝酸钠含量的变化来反映白藜芦醇对亚硝酸根离子的清除能力，并计算清除率：清除率=(A-A)/A×100%可修改编辑0x0x精选资料A—没有加入白藜芦醇的亚硝酸钠溶液空白实验的吸光度值；A—加入不同浓度白藜芦醇溶液时的反应液的平均吸光度值。温度37℃在p的条件下，当用相同量的亚硝酸钠溶液同具有一定浓度梯度的白藜芦醇溶液反应后，再测量吸光度。吸光度越小，溶液中残存的亚硝酸钠含量就越小，表明白藜芦醇对亚硝酸盐的清除率越高；反之，表明白藜芦醇对亚硝酸盐的清除率越低。2.2阻断亚硝胺合成的原理二甲胺与亚硝酸钠在37条件下,可适宜地生成二甲基亚硝胺,反应式如下:)322

)·NO++H322为)NH+HONO)·+H32322当往白藜芦醇溶液中依次加入二甲胺与亚硝酸钠时白藜芦醇优先同亚硝酸钠作用使得二甲胺不能与亚硝酸钠反应,达到阻止二甲基亚硝胺生成的目的。据此可以比较相同条件下生成二甲基亚硝胺量的多少来反映白藜芦醇阻断能力的强弱生成二甲基亚硝胺量少,白藜芦醇的阻断能力就强,反之则弱紫外光照射下二甲基亚硝胺可分解成二甲基仲胺和亚硝酸根,反应式如下:HO+))NH++NO-2323222亚硝酸根与对氨基苯磺酸重氮化后,再与1-胺偶合生成红色化合物。用紫外分光光度计测出该红色化合物的吸光度值可反映出溶液中亚硝酸根离子的含量，亚硝酸根离子的含量可反映出原来溶液中二甲基亚硝胺含量的多少。33.1

溶液的配制可修改编辑222222222222精选资料3.1.10.4%氨基苯酸溶液的配：用分析天平精确称取对氨基苯磺酸0.4g充分溶解后，定容至100mL。3.1.20.2%酸萘乙胺溶液的配：精确称取盐酸萘乙二胺0.2g充分溶解后，定容至100mL。3.1.31-萘胺溶液的配：精确称取1-萘胺0.1g充分溶解后，定容至100mL。3.1.4浓度为1mmol/L的二甲胺盐酸溶液的制精确称取二甲胺盐酸盐0.08541g充分溶解后，定容至。3.1.5浓度为1mmol/L亚硝酸溶液的制：确称取亚硝酸钠0.069g分溶解后，定容至1000mL3.1.6同浓度白藜芦溶液的配制精确称取64mg藜芦醇，置于烧杯中，加适量95%乙醇溶解，用蒸馏水定容于100mL容量瓶中，配制成0.64mg/mL的白藜芦醇溶液并标记为7号容量瓶，再分别稀释配制成0.01mg/mL、、0.04mg/mL0.08mg/mL0.16mg/mL0.32mg/mL白藜芦醇溶液分别标记为1,2,3,4,5,6号容量瓶，避光保存，备用。3.2NaNO标准液的制备及吸光度的测定12]NaNO标准液制备:天平精确称取亚硝酸钠20mg，充分溶解后，定容至得20mg/L的NaNO溶液。然后准确取mg/L的NaNO溶液一1L的容量瓶中并用蒸馏水稀释容至刻度匀后得到浓度为NaNO标准液

2标准曲线的绘制:分别准确吸取浓度为的NaNO标准液0mL,0.2mL,0.4mL,0.6mL,0.8mL,1.0mL,1.5mL,2.mL置于10mL具塞试管中，并分别编号为0123456，试管。然后分别向各试管中加入0.对氮基苯磺酸mL，摇匀，静可修改编辑2220x2220x02x2精选资料置35，再加入0.2%的盐酸萘乙二胺溶液mL,水稀释至刻度，摇匀得到浓度分别为0，，0.3ug/mL,0.4ug/mL,0.5ug/mL,0.75ug/mL,1.0ug/mL的NaNO溶液，将所得到的溶液静置15min后，亚硝酸根离子在nm下存在最大吸收峰，因此本实验在538nm下测定其吸光度的值，绘制标准曲线。3.3不同浓度的白藜芦醇溶液在H=3时对亚硝酸钠的清除率的测定取个10mL具塞试管，分别标记为0，1，，3，456，号试管，依次向各试管中加入5ug/mL的NaNO的溶液1mL然后分别取，，23，，5，67100mL容量瓶中的白藜芦醇溶液分别依次向0，1，，，，，7具塞试管中顺序加入mL,并依次向各试管中分别加入1mLpH=3.0的柠檬酸钠-盐酸缓冲液

,之后将个试管置于37℃恒温水浴槽中反1时。反应结束后，取出试管后立即分别向试管中加入质量分数为0.4%的对氨基苯磺酸溶液各mL,匀静置35钟后再向各试管加入质量分数为0.2%酸萘乙二胺溶液各1,摇匀放置5min后,用分光光度计在538nm处分别测出01，234，57试管反应液吸光度值A）,其中以加入除白藜芦醇溶液和亚硝酸钠溶液外其他所有等量的其他试剂的溶液作为参比溶液，每个浓度配制3个样品测量吸光度求平均值。根据下列公式求得白藜芦醇对亚硝酸根离子的清除率：清除率=(A-A)/A×100%A—没有加入白藜芦醇溶液的试管中aNO的吸光度值，即0试管的吸光度值；A—加入不同浓度白藜芦醇溶液反应后试管中aNO的吸光度值。3.4不同浓度的白藜芦醇溶液在H=3时对亚硝胺合成的阻断率测定取810mL具塞试管，分别标记为123，567试管。分别取1，2345，7号100mL容量瓶中的白藜芦醇溶液分别依次向1234，67具塞试管中顺序加入0.5mL,然后再依次向各试管中分别加入mLpH=3.0的柠檬酸可修改编辑20x002x22220x002x2222精选资料钠盐酸缓冲液,然后依次向各试管加入mmol/mL的N的溶液1mL,向各试管加入1mmol/mL的二甲胺溶液1mL。用蒸馏水将各试管定容刻度为mL将各试管置于37℃恒温水浴槽中反应1小时。反应结束后，置于紫外分析仪上照15,取出后加1%对氨基苯磺酸溶液1mL,加.1%的1-萘胺1后摇匀放置5min,用分光光度计在525nm处测吸光度值(A),其中以加入除白藜芦醇溶液和亚硝酸钠溶液外其他所有试剂的溶液为参比溶液，每个浓度配制3样品测量吸光度求平均值。根据下列公式求得白藜芦醇对亚硝胺合成的阻断率：阻断率=(A-A)/A×100%A—没有加白藜芦醇溶液试管中aNO的吸光度值，即0号试的吸光度值；A—加入不同浓度的白藜芦醇溶液后试管中aNO的吸光度值。44.1NaNO溶液的标准曲线的绘制：NaNO标准液在538nm下测定其吸光度的值如表1所示,标准曲线如图示。从标准曲线可NaNO知在浓度0.1-1ug/mL存在很好的线性关系，随着亚硝酸根离子浓度的增大吸光度增大。表1NaNO标准液的吸光度21TheabsorbancestandardsolutionofNaNO2序号

1234567浓度(ug/mL)

0.10.20.30.40.50.751可修改编辑精选资料吸光度A0.0040.0070.0110.0140.0170.0250.0340.040.0350.030.0250.0150.010.0050

NaNO2y=0.0331x+0.0007R2=0.99910

0.20.4NaNO2图1NaNO标曲线21standardcurveofNaNO2

14.2不同浓度的白藜芦醇在时对亚硝酸钠的清除率及对亚硝胺的阻断率从表2图2知白藜芦醇浓度在0.01-0.32mg/mL时对亚硝酸根离子的清除率随着浓度的增大而增大，对亚硝酸根离子的清除率最大达到63.48%。随后对亚硝酸根离子的清除率并不再继续随着浓度的增大显著增加。表2pH=3不同浓度白藜芦醇对亚硝酸钠的清除率2TherateofresveratrolatdifferentconcentrationsclearingsodiumnitrateunderPH=3序号白藜芦醇浓度

012345670（mg/mL）清除率（%）0.00

0.010.020.040.080.160.320.6418.4428.7234.7539.0143.4363.4863.49可修改编辑%2%2精选资料pH=3清除-白藜芦醇浓度系）（率除清

70605040302010000.10.20.30.40.50.60.7白藜醇浓（）图2pH=3不同浓度白藜芦醇对亚硝酸钠的清除2TheclearingrateofNaNOonresveratrolwithdifferentconcentrationsatPH=3从表3图3知白藜芦醇浓度在0.01-0.32mg/mL时对亚硝胺的阻断率随着浓度的增大而增大，对亚硝胺的阻断率最大达到40.94%。随后对亚硝胺的阻断率并不再继续随着浓度的增大显著增加。表3时同浓度白藜芦醇对亚硝胺的阻断率3TheblockingofnitrosamineresveratrolwithdifferentconcentrationsatPH=3序号白藜芦醇浓度

012345670

0.010.020.040.080.160.320.64（mg/mL）阻断率（%）0.008.3912.7517.1124.1631.2140.9440.96可修改编辑精选资料图3不浓白藜芦醇对亚硝胺的阻断率3TherateofresveratroldifferentconcentrationsblockingnitrosaminesunderPH=35当溶液环境为酸性条件时相当于胃液环境条件下，随着白藜芦醇浓度的增大，白藜芦醇对亚硝酸盐的清除能力不断增强白藜芦醇浓度大约在.32mg/mL时有着63.48%的最大清除率；但是当白藜芦醇浓度增大到一定程度后，白藜芦醇对亚硝酸钠的清除能力不再随着白藜芦醇浓度的增大而显著增加，而是达到一个稳定的清除率水平。不同浓度的白藜芦醇溶液对亚硝胺的生成有一定的阻断作用，白藜芦醇浓度约在0.32mg/mL有着40.94%的最大阻断率但是当白藜芦醇浓度增大到一定程度后藜芦醇对亚硝胺的阻断能力也不再随着白藜芦醇浓度的增大而显著增加，而是达到一个稳定的阻断率水平。结果表明，白藜芦醇对人体中的亚硝酸盐有着良好的清除及阻断作用。人们应充分认识到白藜芦醇在日常生活中的重要作用，进而为有关白藜芦醇的药品、保健食品的开发和推广提供保障。可修改编辑精选资料短短的两个月的实验研究很快就结束了实验的成功完成离不开实验室老师的悉心指导和真诚帮助在此非常感谢张孝林老师的大力支持张老师为我们提供了优良的实验环境和完备的实验器材实验试剂他严谨博学认真以及对科学执着的精神让我非常感动、更让我无比的敬佩！参考文献[1]王广亚酸偶联反应及其应用于光度法测定亚硝酸根[2]李冬梅.降低肉制品中的亚硝酸盐含[肉类加工.1997,(3):16-19.[3]谭,庄松娟肉品中亚硝酸盐国标测定方的探.2005,(7):26-28.[4]曹会兰.亚硝酸盐对人体的危害和预[微量元素与康研,2003,(2):78-80.[5]徐国蔬菜、果N亚硝基化合物致癌的预防作外医卫生学分,1989,(2):93-94.[6]许后效.环境中的N-硝基化合物北京科出社1988:59-65.[7]褚衍信,冯华进亚酸根清除剂体外研究的新方法及其应[J].症1994,13(5):470-471.[8]李延华,王伟君白芦醇的研究现状及应用前[J].中国酿造2008.7:10-12.[9]高年发,姜丽等葡酒发酵过程中白藜芦醇含量变化的研[J].酒科,[10]赵劳,王晓妮,张海容等.山清除亚硝酸盐及阻断亚硝胺合成的研究食与发酵工业2006,32(10):29-31.[11]黄翁倪辉琯溪蜜柚果皮提取物抑制亚硝化反应的,2007(12):36-39.[12]张叶志汁对亚硝酸盐清除作用的一垦大学[13]王.种辛辣蔬菜抗氧性的研.食品与发酵工业2001,(5):123-126.[14]勃A有合成（第二北科学出可修改编辑精选资料Thestudyofresveratrol'sabilityonclearingsodiumnitrateandblockingnitrosamine可修改编辑精选资料YufengLiu,XiaolinZhangSchoolofFoodandDrug,AnhuiScienceandTechnologyUniversity,Fengyang233100,Anhui,ChinaAbstract:Objective:Itistheindicatortostudythedifferentconcentrationsofresveratrolintheacidicenvironmentandalkalineenvironment,clear