精浆的生化检验技术(三修)

1精浆生化检验郑大三附院检验科袁恩武二00八年七月

2

一、精浆的来源及作用

二、精浆α-葡萄糖苷酶测定

三、精浆果糖测定

四、精子顶体酶的测定

五、其他生化项目测定3一、精浆的来源及作用男性生殖系统的结构外生殖器内生殖器

—阴囊＋阴茎—生殖腺（睾丸）、输送管道（附睾、输精管、射精管和尿道）和附属腺体（精囊、前列腺、尿道球腺）4

男性生殖腺分泌功能睾丸:精子、雄性激素、转铁蛋白、附睾

:中性α-葡萄糖苷酶、肉毒碱、甘油磷酸胆碱、唾液酸等，与精子的功能性成熟有关精囊腺:分泌果糖、前列腺素等，呈碱性前列腺:

分泌酸性磷酸酶、柠檬酸、谷氨酸转肽酶、PSA、锌、镁等，其分泌物呈酸性5精液的组成和来源精液是由精子和精浆组成的混合物精子产生于睾丸精浆产生于附睾、前列腺、精囊腺和尿道球腺等附属腺体正常精液中精子占5%，精浆占95%在精浆中约30%来自前列腺，60%来自精囊腺，5-10%来自于附睾及尿道球腺67正常精浆应具备精浆量≥2.0ml

外观和粘稠度都正常

PH值7.2-7.8

精浆各项生化指标正常精液WBC＜1×106/ml

细菌培养阴性或细菌计数＜1000/ml8精浆主要化学成分水:约占90%以上糖类:果糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖等蛋白质:白蛋白及非酶蛋白质脂类:包括胆固醇、睾酮、前列腺素等酶蛋白:酸性磷酸酶、透明质酸酶、糖苷酶、精素、纤溶酶原激活剂等9肽类激素：如FSH、LH、催乳素等胺类：如精胺、亚精胺、精胺素等氨基酸：如精氨酸、谷氨酸等20多钟有机酸及有机碱：如柠檬酸、肉毒碱、甘油磷酸胆碱、乳酸等无机离子：锌、镁、钙、铜、钾、氯、钠等10精浆的生理作用作为一种介质把精子输送到女性生殖道内，为精子提供营养物质参与精液的凝固和液化精浆组成一个适当的pH值和渗透压环境，具有一定的缓冲能力，以适应精子活动的需要精浆中含有调节输卵管及子宫活动的物质，同时还含有使宫颈粘液水解的物质。11精液的凝固与液化精液刚射出时为一粘性、略呈灰黄色的液体，射出后立即呈胶冻样凝块，5～20min后又会自动液化，并仍呈一定粘度。当精液射于阴道内5min可以完全液化，比体外液化的时间为快12精液液化一旦形成，精子在此液状环境中才开始有效的自由活动，且有充分活动力，可由阴道进入宫颈、子宫及输卵管，最后与卵子结合而致孕。精囊（凝固酶）和前列腺（液化因子、PSA）在精液的凝固和液化过程中起重要作用13男性不育疾病中精浆生化指标的改变凝固液化PHα-糖苷酶果糖酸性磷酸酶柠檬酸副睾疾病正常正常急性>8慢性<7降低正常正常正常精囊缺如不正常

<7正常降低正常正常前列腺疾病正常不

>8正常正常升高降低降低输精管阻塞正常正常正常降低正常正常正常14精浆生化检验的目的精子功能指标：评价精子受孕能力用于男性生殖道炎症的诊断了解副性腺功能确定梗阻性无精子症及梗阻部位15男科实验室开展的精浆生化项目精浆α-葡萄糖甘酶测定精浆果糖测定精浆酸性磷酸酶的测定精子顶体酶的测定精浆锌的测定精浆乳酸脱氢酶X同工酶的测定精浆柠檬酸定量测定16二、精浆中性α-葡萄糖甘酶测定（酶法）

检测目的主要是附睾分泌功能的指标，较左旋肉毒碱和甘油磷酸胆碱对附睾更敏感、更特异先天性副睾发育不良明显降低、急慢性副睾炎降低

正常见于单纯输精管阻塞无精症17原理P-硝基酚吡喃葡糖苷（底物）对硝基酚（产物）

淡黄色物质，在405nm波长有最大吸收峰加酸是抑制酸性α-葡萄糖甘酶，保护中性α-葡萄糖甘酶加酸α-葡糖苷酶Na2CO318试剂组成酸性抑制剂600μl×1瓶糖苷酶抑制剂（冻干粉）1瓶底物（冻干粉）2瓶终止液50ml×1瓶标准品（1~5）各2.5ml质控液100μl×1瓶底物溶解液5ml×1瓶19实验设备及用具酶标仪低速自动平衡离心机微量水平振荡器水浴箱（37℃）精密移液器（加样枪）

0.5~20ul、50~200ul、100~500ul、200~1000ul石英定时钟20实验操作方法试剂准备糖苷酶抑制剂冻干粉以120μl蒸馏水溶解，4℃可使用20天，分装保存-20℃可长期使用（切勿反复冻融）每瓶底物冻干粉以2.2ml底物溶解液充分溶解，分装保存溶解后的底物液，4℃保存可用5天，-20℃保存可用数月（切勿反复冻融）21标本准备记录受检者一次射精的精液总量(ml)精液液化后以3000g离心10分钟，保留精浆若样本不能立即测定，可以Eppendorf管分装精浆，-20℃保存待检根据离心力计算离心速度公式N：离心速度Rcf：离心力R：离心半径22操作方法质控测定管质控对照管标本测定管标本对照管酸性抑制剂（ul）————1010蒸馏水（ul）1010————质控液（ul）55————样本（ul）————55糖苷酶抑制剂（ul）——5——537℃预温5min，底物同时预温5min。底物（ul）10010010010037℃准确反应25min。终止液（ul）1000100010001000每管各取250ul，标准液250ul,在微孔板上按特定方法排列，酶标仪405nm比色。23比色与计算

计算标准管浓度对应的标本浓度值

1单位（U）葡糖苷酶活性=37℃下每分钟产生1umolPNP标本系数=总孵育体积÷样本体积÷反应时间(min)=1115÷5÷25=8.92标准管浓度对应的标本浓度值(umol/L)=标准管实际浓度×8.9224标准管实际浓度（umol/l）输入酶标仪程序时标准管浓度（U/L）000.54.4618.92217.84435.68

各标准管计算浓度如下25根据酶标仪功能选择比色计算方式直接计算检测样本浓度（适用于可设置多样本空白的酶标仪，如：BIO-TEKELx800系列等）方式：酶标仪可为每个测试孔（包括标准和待检标本）设置空白，并自动完成每例ΔA的计算，然后根据ΔA拟合曲线，直接计算出检测标本浓度26

各检测孔在微孔板上的位置排列方式如下1234……AS1R3R3B……B

S2R4R4B……CS3R5R5B……DS4R6R6B……ES5

R7

R7B……FQQBR8R8B……GR1R1BR9R9B……HR2R2B┇┇……S：标准孔Q：质控孔QB：质控对照孔R：标本测定孔RB：样本对照孔27Bio-TekELx800酶标仪程序设置，主要参数如下MAPPINGDIRECTION:DOWN;BLANKMAP:P-DOWN;ENTERNUMBEROFSTANDARDS:05ENTERNUMBEROFSTANDARDREPLICATES:01CONCN.OFSTD1:0CONCN.OFSTD2:4.46CONCN.OFSTD3:8.92CONCN.OFSTD4:17.84CONCN.OFSTD5:35.68按“平滑曲线”方式拟合标准曲线酶标仪打印输出结果，即为检测标本真实浓度（U/L）28优点

仪器可设置多样本空白，直接计算待检样本浓度缺点

操作繁锁（对酶标仪操作技术要求较高）浪费试剂每次试验最好作标准曲线29通过人工计算检测样本浓度（适用于不能设置多样本空白的酶标仪，如大多数普通酶标仪）酶标仪对空白处理方式有限，但可设置一个空白孔单孔，所有检测孔吸光度均为之相减。30各检测孔在微孔板上的位置排列方式如下：A

BR1R5

……BS1R1BR5B……CS2R2R6

……DS3R2BR6B……ES4R3R7

……FS5R3BR7B……GQR4R8

……HQBR4BR8B……1234……B：空白孔S：标准孔Q：质控孔QB：质控对照孔R：标本测定孔RB：样本对照孔31设置酶标仪程序时，标准浓度输入值分别为0、4.46、8.92、17.84和35.68。按“平滑曲线”方式拟合标准曲线人工计算方法：检测管实际浓度(U/L)=检测管浓度-对照管浓度。如：质控管实际浓度=Q－QB标本1实际浓度=R1－R1B

32结果报告

标本最终检测结果以“精浆中性α-葡糖苷酶总活性”方式报告，即总活性=标本浓度(U/L)×一次射精的精液体积(ml)=mU/一次射精正常参考值≥20mU/一次射精（WHO）

33试验中注意事项严格控制禁欲时间和样本离心速度操作时加样要准确，混匀充分底物液直接于37℃水浴状态加入反应完毕迅速加入终止液每个样本必须做样本空白对照34掌握好温度和孵育时间质控液不能加酸性抑制剂比色前微孔板应进行充分振荡（非常重要）糖苷酶抑制剂溶解后应迅速分装，-20℃冷冻保存底物见光易分解，注意蔽光保存35

质量控制目的评价精浆α-葡糖苷酶检测中离心速度、禁欲时间、以及冻融对精浆α-葡糖苷酶水平的影响，为精浆α-葡糖苷酶检测实现标准化及实验室内部和实验室之间的质量控制提供指导不同速度离心后的精浆中α-葡糖苷酶水平见表1、36表1精浆α-葡萄糖苷酶在精浆标本2000r/min

离心10min和3500r/min离心15min结果比较组别nα-葡萄糖苷酶

(U/ml）精浆(2000r/minfor10minutes)5150.31±18.94精浆

(3500r/minfor15minutes)5147.09±17.92*两组结果比较*:P=0.00137不同速度离心后的精浆中精子密度的比较精液经2000r/min离心10min后，84.31%（43/51）的精浆含有精子，平均精子密度为(2.43±3.95)×106/ml，而经3500r/min离心15min后，23.53%（12/51）的精浆含有精子，平均精子密度为（0.22±0.87）×106/ml，结果见图1。38图1不同速度离心后的精浆中精子密度的比较05101520253015913172125293337414549例数精子密度(106/ml)Centrifugationat2000r/minfor10minutesCentrifugationat3500r/minfor15minutes39

冻融后的精浆α葡糖苷酶的检测结果所有6份标本加与不加PMSF对α-葡糖苷性检测没有影响（P>0.05）。连续20天（隔一天检测一次）的检测结果表明，6份标本的CV为2.22%～5.29%。见表240表2精浆样本在加入PMSF和未加入

PMSF后活性变化情况Samplen加入PMSFα-葡萄糖苷酶(U/ml)未加PMSFα-葡萄糖苷酶(U/ml)CV(%)11020.84±0.663.1721.23±0.683.2021023.01±1.054.5622.87±1.215.2931033.43±1.163.4733.78±0.752.2241036.54±1.744.7636.63±1.754.7851048.48±1.583.2649.04±1.673.4161055.98±1.753.1356.72±1.632.87CV(%)41不同速度离心后的精浆α-葡糖苷酶水平与禁欲时间的关系见表3、图242表3精浆中α-葡萄糖苷酶在不同的禁欲期间离心

2000r/min10min或3500r/min15min结果比较2~3天比较,*:P<0.05;4~5天比较,#:P<0.05;6~7天比较,△:P<0.05禁欲时间(d)nα-葡萄糖苷酶(U/ml)

精浆

(2000r/min)精浆

(3500r/min)2~31236.47±12.2434.04±11.224~51649.62±16.86*47.73±17.37*6~71451.14±19.76*46.76±17.70*>8968.70±14.10*#△63.86±13.63*#△43图2

不同禁欲时间与α-葡萄糖苷酶活性相关系数A02040608010012005101520禁欲天数α-葡萄糖苷酶活性(U/ml)B02040608010012005101520禁欲天数α-葡萄糖苷酶活性(U/ml)标本离心2000r/min标本离心3500r/min442000r/min离心后的精浆及3500r/min离心后的精浆中α-葡糖苷酶水平与禁欲时间之间的相关系数（r）分别为0.538和0.486(P均<0.001)。提示，随着禁欲时间的延长，精浆α-葡糖苷酶水平不断升高。45在精浆α-葡糖苷酶的检测中，应该注意离心速度对结果的影响，要想得到单纯的精浆，离心速度≥3500r/min，只有如此，各实验室之间的检测结果才具有可比性46精浆α-葡糖苷酶水平检测的最佳禁欲时间最好为4～7天，即精浆α-葡糖苷酶检测中禁欲时间亦应标准化，应规定为4～7天对α-葡糖苷酶活性检测来说，冷藏精浆标本可作为不同实验室之间的质控品47果糖含量直接反映精囊分泌功能，间接反映睾丸间质细胞分泌睾酮功能．结合α-葡糖苷酶用于判断先天性输精管精囊发育缺陷无精子症和阻塞性无精子症的判断:如下表

三、精浆果糖的测定（酶法）量PH凝固睾丸输精管果糖α-糖苷酶先天性输精管精囊缺如少＜7不正常无无正常降低输精管阻塞正常正常正常正常有正常降低无48试验原理果糖5-酮基果糖甲替类化合物（淡黄色）其在490nm处有最大吸收峰，其颜色深浅与果糖含量成正比特异性酶脱氢递氢体49试剂组成缓冲液酶液（冻干粉）显色剂终止液酶液（冻干粉）溶解液果糖标准液标本稀释液实验设备及用具同α-葡萄糖苷酶测定50操作方法试剂准备每瓶酶液冻干粉加0.6ml酶干粉溶解液溶解，室温溶解30min，待用溶解后的酶液4℃保存可用1月，分装后-20℃保存至少可用1年（切勿反复冻融）临用前配制工作液，方法是：缓冲液∶显色剂=9∶1，充分混匀，待用51标本准备新鲜精液液化后，迅速取部分精液2000g离心10分钟，留取精浆立即检测或-20℃储存待分析检测前，将待检精浆标本用样本稀释液1:4稀释，充分混匀制备标准曲线将8mmol/L果糖标准液用样本稀释液稀释为4、2和1mmol/L三个浓度52检测步骤标准零管

（S1）

标准管(1,2,4,8mM)（S2~S5）

标准空白管

（SB）

测定管

（R）

标本对照管（RB）稀释标本(ul)---1010标本稀释液(ul)10----标准液(ul)-10---酶液

(ul)1515-15-工作液(ul)200200200200200充分振荡混匀，封片，37℃避光准确反应40min

去掉封板膜，每孔加终止液50ul，振荡混匀。上酶标仪490nm比色

53比色与计算标准管浓度对应的标本浓度值(mmol/L)=标准管实际浓度×4。各标准管计算结果如下标准管实际浓度（mmol/L）输入酶标仪程序时标准管浓度（mmol/L）00142841683254直接计算检测样本浓度酶标仪同α-葡萄糖苷酶测定，只是多了一个标准空白孔人工计算检测样本浓度方法同α-葡萄糖苷酶结果报告方式报告：“μmol/一次射精”，一次射精果糖量(μmol)=精浆果糖浓度(mmol/L)×一次射精的精液总体积(ml)参考值：一次射精≥13μmol(WHO)55注意事项果糖标准液配好后4℃放2周后使用，期限约为2周即需更换（若为成品试剂盒应在1月内用完）严格按要求留取精液标本精液液化后应立即离心将精子和精浆分开糜蛋白酶对精浆果糖检测没有明显影响，不液化精液样本，可预先加酶处理56离心速度对精浆果糖浓度的影响不大冻融对精浆果糖水平没有明显的影响，冻融精浆可以作为监测不同实验室果糖检测的质控品标本检测结果出现极低值时，注意观察样本△A值和零标准△A值，结合标准曲线判断57精浆果糖检测标准化和管理果糖标准液吸光度的监测果糖标准液连续监测35天的OD值见图1图1果糖标准液OD值随时间变化58精液放置时间对果糖浓度的影响48份精液标本液化后立即（0h组）、2h（2h组）和4h（4h组）后3500r/min离心15min分离精浆，所得果糖浓度见表159表21

在精液0,2,和4小时液化过程中比较

精浆标本果糖含量（配对t检验）

组别n果糖(mg/ml)0h482.83±1.182h482.71±1.18*4h482.65±1.17#$0小时组比较,*:P=0.004,#:P=0.0002小时组比较,$:P=0.00660精液放置后果糖浓度的降低与精子浓度和活动率密切相关将每份标本0、2、4h的果糖值通过Excel作图求出斜率（K），以代表每份精液标本果糖的降低速率将每份精子的活率乘以精子浓度得到活动精子浓度，再将两者进行相关性分析r

=0.374，P=0.009，提示精液果糖浓度降低与活动精子浓度呈显著正相关，结果见图261图2

精浆果糖浓度降低速率（K）

与活动精子浓度之间相关性01020304050607080-0.050.050.150.250.35斜率(K)活动精子浓度(106/ml)62检测意义结构：丝氨酸蛋白溶解酶，属于膜结合性酶功能：水解卵细胞的透明带及卵黄膜以达成一条通道，便于精-卵结合完成受精过程顶体酶活性可反映精子质量，是判断男性精子功能和生育力强弱的重要评价指标四、精子顶体酶活力的测定63试验原理BAPNA

硝酰基苯胺BAPNA:Nα-苯甲酰-DL-精胺酸-ρ-硝酰基苯胺（410nm)试剂抑制剂缓冲剂终止液底物液精氨酸酰胺酶64操作方法标本准备以清洁塑料容器盛精液标本，液化标本室温可置3h，勿冷冻保存按每管参加反应的精子数为7.5×106个，根据标本精子浓度(M×106/ml)，计算实验所需精液量vml（计算方法：v=7.5/M）试剂准备反应液临用前配制底物﹢缓冲液﹦1﹕465操作方法测定管对照管抑制剂（ul）

100

100各反应管加盖，以手指轻弹管底使沉淀精子均匀悬浮反应液（ul）

1000

1000终止液（ul）

100

24℃准确孵育1h终止液（ul）

100

2000g离心15min0.5cm比色皿，410nm波长比色蒸馏水调零读取OD值66结果计算单位定义在24℃，水解1.0∪molBAPNA／min的底物量定义为1IU顶体酶活性计算顶体酶活性(μIU/106精子)＝×106正常参考值48.2~218.7μIU/106精子495×7.5（测定管OD值—空白管OD值）×267检测意义

升高前列腺肥大或早期前列腺癌降低前列腺炎试验原理对硝基酚磷酸盐对硝基酚黄色化合物，其显色程度于405nm波长与标本酸性磷酸酶浓度成正比

五、精浆酸性磷酸酶的检测精浆酸性磷酸酶加酸加碱68标本准备记录受检者一次射精的精液总量(ml)。精液液化后不超过30分钟，以3000g离心10分钟，保留精浆若样本不能立即测定，于Eppendorf管中加50ul精浆和50ulACP保存液，充分混匀。将精浆标本稀释5000倍

69比色及计算ACP国际单位（IU）：1单位酸性磷酸酶=37℃下每分钟产生1umolPNP标本系数=总孵育体积÷样本体积÷反应时间(min)×精浆稀释倍数标准管浓