第三章 发酵培养基

第三章发酵工业培养基设计第一节发酵培养基的要求和种类第二节发酵培养基的成分及来源第三节发酵培养基的设计原理与优化发酵培养基的要求①培养基能够满足产物最经济的合成。②发酵后所形成的副产物尽可能的少。③培养基的原料应因地制宜，价格低廉；且性能稳定，资源

丰富，便于采购运输，适合大规模储藏，能保证生产上的

供应。④所选用的培养基应能满足总体工艺的要求，如不应该影响

通气、提取、纯化及废物处理等。二、培养基的类型及功能1、按纯度合成培养基

:原料其化学成分明确、稳定重复性强

天然培养基:采用天然原料适合于各类微生物的生长，而一般自养生物不能生长半合成养基:既含有天然原料，又含有化学药品

应用范围广泛2、按物理状态固体培养基、半固体培养基、液体培养基3、按用途（从发酵生产应用考虑）

培养基按其用途可分为孢子（斜面）培养基、种子培养基和发酵培养基三种

孢子培养基是供制备孢子用的培养基；营养不宜丰富种子培养基是满足菌种生长的培养基；营养丰富，浓度不高；与发酵培养基成分接近发酵培养基是满足大生产中大量菌体生长和繁殖以及代谢产物积累的营养基质。第二节发酵培养基的成分及来源

一、碳源1、作用提供微生物菌种的生长繁殖所需的能源和合成菌体所必需的碳成分

提供合成目的产物所必须的碳成分2、来源糖类、油脂、有机酸、烃和醇类3、工业上常用的糖类①葡萄糖

所有的微生物都能利用葡萄糖

但是会引起葡萄糖效应

工业上常用淀粉水解糖，但是糖液必须达到一定的质量指标不同的制糖工艺生产的糖液质量差别很大②糖蜜糖蜜是制糖生产时的结晶母液，它是制糖工业的副产物。

糖蜜主要含有蔗糖，总糖可达50%～75%。一般糖蜜分甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜。不用加工方法对甘蔗糖蜜的影响糖蜜使用的注意点：除糖份外，含有较多的杂质，其中有些是有用的，但是许多都会对发酵产生不利的影响，需要进行预处理。例：谷氨酸发酵有害物资：胶体成分（起泡、结晶）、钙盐（结晶）

生物素（发酵控制）预处理：澄清→脱钙→脱除生物素例：柠檬酸发酵有害物质：铁离子含量高（导致异柠檬酸的生成）预处理：→黄血盐②淀粉、糊精使用条件：微生物必须能分泌水解淀粉、糊精的酶类缺点：难利用、

发酵液比较稠、一般>2.0%时加入一定的α-淀粉酶

成分比较复杂，有直链淀粉和支链淀粉等等。优点：来源广泛、价格低

难利用，可以解除葡萄糖效应例：地衣芽孢杆菌生产α-淀粉酶碳源对生长和产酶的影响碳源细胞量α-淀粉酶葡萄糖4.20蔗糖4.020糊精3.0638.2淀粉3.0940.2该淀粉酶是诱导酶。4.油和脂肪微生物需具有脂肪酶。分解脂肪的需氧量大。低浓度的高级脂肪酸可刺激细菌生长，但浓度较高时往往有毒害作用。常用：豆油、花生油、菜籽油、棉籽油等5.有机酸如甲酸、乙酸、丙酸、丁酸等低级脂肪酸；乳酸、柠檬酸、反丁烯二酸、琥珀酸、苹果酸、α-酮酸、酒石酸等。注意发酵液酸碱度变化。6.烃和醇类正烷烃已用于有机酸、氨基酸、维生素、抗生素和酶制剂的工业发酵中。醇类中甘露醇、甘油、低浓度的乙醇都可作为碳源。二、氮源主要用于构成菌体细胞物质（氨基酸，蛋白质、核酸等）和含氮代谢物。常用的氮源可分为两大类：有机氮源和无机氮源。

1、无机氮源种类：铵盐、硝酸盐和氨水特点：微生物对它们的吸收快，所以也称为快速利用的氮源。但无机氮源的迅速利用常会引起pH的变化如：

(NH4)2SO4

→2NH3+2H2SO4

NaNO3+4H2

→NH3+2H2O+NaOH

无机氮源被菌体作为氮源利用后，培养液中就留下了酸性或碱性物质，这种经微生物生理作用（代谢）后能形成酸性物质的无机氮源叫生理酸性物质，如硫酸铵，若菌体代谢后能产生碱性物质的则此种无机氮源称为生理碱性物质，如硝酸钠。正确使用生理酸碱性物质，对稳定和调节发酵过程的pH有积极作用。所以选择合适的无机氮源有两层意义：

满足菌体生长

稳定和调节发酵过程中的pH在黑曲霉发酵过程中用硫酸铵作氮源，培养液中留下的SO42-使pH下降，而这对提高糖化型淀粉酶的活力有利，且较低的pH还能抑制杂菌的生长，防止污染。氨水在发酵中除可以调节pH外，它也是一种容易被利用的氮源，在许多抗生素的生产中得到普遍使用。在制液体曲时，用NaNO3作氮源，菌丝长得粗壮，培养时间短，且糖化力较高。这是因为NaNO3的代谢而得到的NaOH可中和曲霉生长中所释放出的酸，使pH稳定在工艺要求的范围内。2、有机氮源工业上常用的有机氮源都是一些廉价的原料来源：尿素，动、植物粉类，玉米浆等动、植物粉类：花生饼粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、废菌丝体和酒糟。尿素：很常用的氮源，但其加热灭菌时不稳定，在工业上使用受到一定的限制。成分复杂：除提供氮源外，有些有机氮源还提供大量的无机盐及生长因子。例玉米浆：①可溶性蛋白、生长因子（生物素）、苯乙酸②较多的乳酸③硫、磷、微量元素等玉米浆是玉米淀粉生产中的副产物，含有各种必须的氨基酸、维生素和无机盐以及还原糖、磷、微量元素和生长素，是一种很容易被微生物利用的良好氮源，被广泛用于发酵工业制备培养基。

有机氮源成分复杂可以从多个方面对发酵过程进行影响，而另一方面有机氮源的来源具有不稳定性。所以在有机氮源选取时和使用过程中，必须考虑原料的波动对发酵的影响。

有机氮源除提供氮源外，一般还提供前体、生长因子、无机盐及微量元素等。氮源使用的一些相关问题：

有机氮源和无机氮源应当混合使用早期：容易利用易同化的氮源—无机氮源中期：菌体的代谢酶系已形成，则利用蛋白质

有些产物会受氮源的诱导和阻遏例：蛋白酶的生产

有机氮源选取时也要考虑微生物的同化能力

开发效果好、有针对性的有机氮源仍然是令人感兴趣

的课题三、无机盐及微量元素1、作用：各种不一样2、来源：C、N源，以盐的形式补充3、用量：根据具体的产品，以实验决定，P454、使用注意点对于其它渠道有可能带入的过多的某种无机离子和微量元素在发酵过程中必须加以考虑例：铁离子青霉素发酵中，铁离子的浓度要小于20μg/ml

发酵罐必须进行表面处理B、使用时注意盐的形式（pH的变化）例：黑曲酶NRRL-330,生产α-淀粉酶，P对酶活的影响pH酶活不加4.25120分钟加K2HPO45.4530分钟加KH2PO44.6275分钟四、生长因子、前体和产物促进剂

从广义上讲，凡是微生物生长不可缺少的微量的有机物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等均称生长因子。

1、生长因子

如以糖质原料为碳源的谷氨酸生产菌均为生物素缺陷型，以生物素为生长因子,生长因子对发酵的调控起到重要的作用。

有机氮源是这些生长因子的重要来源，多数有机氮源含有较多的B簇维生素和微量元素及一些微生物生长不可缺少的生长因子，如玉米浆。前体指某些化合物加入到发酵培养基中，能直接被微生物在生物合成过程中合成到产物物分子中去，而其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入前体而有较大的提高。2、前体青霉素：分子量356苯乙酸:分子量136COOHCH2作用：前体有助于提高产量和组份用量：前体的用量可以按分子量衡算，具体使用有个转化率的问题例：6000单位/ml的青霉素G-Na（MW356),需要多少苯乙酸(MW136)1mg=1667u

青霉素＝6000*0.6（微克）＝36mg/ml

苯乙酸＝（36*136）/356=13.8mg/ml=1.38%实际使用时的转化率在46-90%之间

例某厂单耗为：0.337（kg/10亿青霉素）

转化率为：0.6/(0.337*36/13.8)=68%

前体一般都有毒性，浓度过大对菌体的生长不利

用法：前体使用时普遍采用流加的方法前体相对价格较高，添加过多，容易引起挥发和氧化，流加也有利于提高前体的转化率。苯乙酸，一般基础料中仅仅添加0.07%3、产物促进剂指那些非细胞生长所必须的营养物，又非前体，但加入后却能提高产量的添加剂。

促进剂提高产量的机制还不完全清楚，其原因是多方面的。

有些促进剂本身是酶的诱导物；

有些促进剂是表面活性剂，可改善细胞的透性，改善

细胞与氧的接触从而促进酶的分泌与生产，

也有人认为表面活性剂对酶的表面失活有保护作用；

有些促进剂的作用是沉淀或螯合有害的重金属离子。五、水

对于发酵工厂来说，恒定的水源是至关重要的，因为在不同水源中存在的各种因素对微生物发酵代谢影响甚大。

水源质量的主要考虑参数包括pH值、溶解氧、可溶性固体、污染程度以及矿物质组成和含量。对于酿造行业，水的重要性不言而喻对于常规发酵，可靠、持久，能提供大量成分一致清洁的水。第三节发酵培养基的设计和优化

目前还不能完全从生化反应的基本原理来推断和计算出适合某一菌种的培养基配方，只能用生物化学、细胞生物学、微生物学等的基本理论，参照前人所使用的较适合某一类菌种的经验配方，再结合所用菌种和产品的特性，采用摇瓶、玻璃罐等小型发酵设备，按照一定的实验设计和实验方法选择出较为适合的培养基。

一、培养基成分选择的原则

菌种的同化能力

代谢的阻遏和诱导

合适的C、N比100∶0.2～2.0

pH的要求

（一）、理论转化率与实际转化率

理论转化率是指理想状态下根据微生物的代谢途径进行物料衡算，所得出的转化率的大小。

实际转化率是指实际发酵过程中转化率的大小

如何使实际转化率接近于理论转化是发酵控制的一个目标

二、成分含量的确定例:

如在酒精生产中葡萄糖转化为酒精的理论转化率计算如下∶

葡萄糖转化为酒精的代谢总反应衡算式为∶C6H12O6─→2C2H5OH+2CO2

葡萄糖转化为酒精的理论得率为∶2*46

Y=───=0.51180（二）、实验设计

培养基成分的含量最终都是通过实验获得的

合理的实验方法多因子实验：均匀设计、

正交实验设计、

响应面分析等。单因子实验③当培养基成分确定后，剩下的问题就是各成分最适的浓度，由于培养基成分很多，为减少实验次数常采用一些合理的实验设计方法。三、培养基设计的步骤①根据前人的经验和培养基成分确定时一些必须考虑的问题，初步确定可能的培养基成分；②通过单因子实验最终确定出最为适宜的培养基成分；类胡萝卜素高产菌Y11的鉴定及培养条件的优化郭秒,食品与工业发酵，2004类胡萝卜素的作用：色素、营养保健产生菌：类球红细菌

原培养基:

初步确定可能的培养基成分(以碳源为例)

通过单因子实验确定适宜的培养基成分(以碳源为例)考虑到成本：乙酸钠是较为合适的碳源进一步：乙酸钠的浓度2%比较好

正交设计确定优化的配方结果：碳源：乙酸钠0.2%氮源：氯化铵0.2%

酵母膏0.03%无机盐:复合无机盐0.05%改进后培养基原培养基第三章发酵工业培养基的设计改进后培养基的发酵结果四、摇瓶水平到反应器水平的优化配方摇瓶、反应器培养基研究的两个层次

摇瓶——培养基设计的第一步

反应器—最终的优化的基础配方例：青霉素发酵发酵摇瓶：玉米浆4%，乳糖10%，(NH4)SO40.8%

轻质碳酸钙1%发酵罐:葡萄糖流加控制总量10-15%，玉米浆总量4-8%

补加硫酸、前体等摇瓶发酵培养基和发酵罐培养基差别可能很大很大摇瓶优化配方：菌种筛选，反应器研究的基础发酵罐：反应器水平,

可以得出最终优化的基础配方pH控制摇床：反应器水平上的摇瓶研究五、培养基设计时注意的一些相关问题

原料及设备的预处理

原材料的质量

发酵特性的影响

在抗生素发酵生产中往往喜欢所谓的“稀配方”，因为它既降低成本、灭菌容易、且使氧传递容易而有利于目的产物的生物合成。如果营养成分缺乏，则可通过中间补料方法予以弥补。

灭菌

在大规模发酵中应该尽可能的采取连续灭菌的操作，而且保证灭菌条件的稳定是保证发酵稳定的前提

有时避免营养物质在加热的条件下，相互作用，可以将营养物质分开消毒。

有些物质由于挥发和对热非常敏感，就不能采用湿热的灭菌方法

Na2HPO4+CaCO3→CaHPO4+Na2CO3第四节、重组产品培养基的介绍

大肠杆菌高密度度培养：碳源：葡萄糖、甘油氮源：胰蛋白胨、酵母粉无机盐：磷、镁等蛋白胨、酵母粉(OXOID)章越，生物工程学报，2004

动物细胞培养基基础培养基:F12、DMEM等血清(5-10%)：胎牛(FBS)、小牛(CS)、马(HS)水：超纯水其它：NaHCO3（CO2）、抗生素GONG,J.B.B.2003本章小节：

培养基—菌体生长所需的营养以及其它必须的条件

了解发酵培养基的组成，发酵培养基常用的原料以

及其中的基本概念

发酵培养基的优化与设计是发酵工程的基本问题，掌握发酵培养基优化与设计的思路、了解其中的方法。习题1、生物技术的几大组成部分：基因工程、细胞工程、酶工程和发酵工程，虽可自成体系，构成独立完整的技术，但它们又是相互(

)

，形成了对社会的广泛影响。A加强

B补充

C渗透

D作用2、酶工程和发酵工程是生物技术实现(

)的关键环节。

A产业化

B商品化

C社会化

D安全化一、选择题BC3．以下发酵产品中不属于微生物代谢产物的是（）

A．味精B．啤酒C．“人造肉”

D．人生长激素5．微生物代谢的调节属于（）A．神经调节B.激素调节C．酶的调节

D.基因调节4．关于单细胞蛋白叙述正确的是(）A．是微生物细胞中提取的蛋白质B．通过发酵生产的微生物菌体C．是微生物细胞分泌的抗生素D．单细胞蛋白不能作为食品CB6．用于谷氨酸发酵的培养基需添加的生长因子是（）A．氨基酸B．碱基C．核苷酸D．生物素8．不能作为异养微生物碳源的是（）

A．牛肉膏B．含碳有机物

C．石油D．含碳无机物7.不能以糖类作为碳源的细菌是（）

A．假单胞菌B．乳酸菌

C．甲基营养菌D．固氮菌DCD9．配制培养基的叙述中正确的是（）A．制作固体培养基必须加入琼脂B．加入青霉素可得到放线菌C．培养自生固氮菌不需要氮源D．发酵工程一般用半固体培养基10．发酵是利用微生物大量生产有用代谢产物的一种生产方式。通常说的谷氨酸发酵又属于

（）A.液体发酵和需氧发酵B．液体发酵和厌氧发酵

C．固体发酵和需氧发酵D．固体发酵和厌氧发酵C11．在赖氨酸发酵中，应用的不能合成高丝氨酸脱氢酶的黄色短杆菌是如何选育的（

）

A自然界中菌种的筛选

B人工诱变

C基因工程

D细胞工程12.在次级代谢物的发酵生产过程中，添加前体一般是（）添加。A少量多次B多量少次C在细胞生长期13．在实验中我们所用到的淀粉水解培养基是一种（

）培养基A基础培养基B加富培养基C选择培养基D鉴别培养基15.要从多种细菌中分离某种细菌，培养基要用（）A.加入青霉素的培养基B．加入高浓度食盐的培养基C．固体培养基

D.液体培养基16．根据培养基的物理状态，划分的发酵种类是

(

)A抗生素发酵

B、维生素发酵

C、氨基酸发酵

D、液体发酵工业发酵的发展经历了以下几个阶段：

、

、

、

、

、和

。2.制备淀粉水解糖的方法有

、

、和

。（天然发酵阶段、纯培养技术的建立、通气搅拌发酵技术的建立、代谢控制发酵技术的建立、开拓新型发酵原料时期、基因工程段。）（酸法、酸酶法、双酶法）3.培养基的种类繁多，一般可根据其营养物质的不同来源分为（）、（）和（），根据培养基的物理状态的不同分为（