月季的花药培养

3.2月季的花药培养知识回顾：练习：小麦高杆（D）对矮杆（d）为显性，抗锈病（T）对不抗锈病（t）为显性，现有高杆抗锈病和矮杆不抗病的两种纯合体，如何快速获得矮杆抗锈病的纯种？P：DdTt，高秆抗锈病DT，Dt,dT,dtddTT矮秆抗锈病↓杂交花药离体培养DT，Dt,dT,dt↓秋水仙素处理高杆抗锈病（DDTT）×矮秆不抗锈病（ddtt）

F1：的基因型和表现型：各种配子的种类：符合要求的单倍体的基因型：

良种的基因型表现型↓花药离体培养单倍体植株（N）秋水仙素处理植株（2N）1.明显缩短育种年限2.后代植株都为纯合子正常植株（2N）单倍体育种的过程是什么？特点：一、基础知识（一）被子植物的花粉发育1、被子植物的花的结构：花托花萼花瓣雄蕊花药花丝雌蕊柱头花柱子房被子植物子房的结构胚珠的结构卵细胞极核子房壁珠被珠孔植物的双受精作用：花雄蕊雌蕊花药花粉粒精子精子子房胚珠胚囊子房壁珠被卵细胞两个极核受精卵受精极核胚胚乳种皮种子果皮果实有丝分裂有丝分裂1n1n2n1n3n2n2n2n2n胚是一个新个体的幼体（胚芽胚根子叶胚轴）小孢子母细胞小孢子花粉囊花药花粉粒（双核期）成熟花粉2、被子植物花粉的发育花粉是花粉母细胞经过减数分裂而形成的。因此，花粉是单倍体的生殖细胞。①经历时期：四分体时期、单核期、双核期小孢子四分体单核双核②花粉粒的形成1花粉母细胞4个小孢子

(小孢子四分体)减数分裂有丝分裂1个花粉管细胞核1个生殖细胞核有丝分裂2个精子单核居中期单核靠边期双核期1个营养细胞1个生殖细胞(2n)(n)(n)(n)(n)(n)(n)(n)(n)花粉粒花粉粒类型一个成熟的花粉粒即为雄配子体，有两种情况：成熟的花粉粒中，只含花粉管细

胞核和生殖细胞核。（精子在花粉管

中形成）。有些植物的花粉，在成熟前，生

殖细胞进行一次有丝分裂，形成两个

精子，这样的花粉在成熟时，含有一

个营养核和两个精子。二核花粉粒:三核花粉粒:被子植物的雌蕊营养细胞在花粉萌发过程中的作用：控制花粉的萌发并提供营养例1：关于被子植物花粉发育的说法，不正确的是（）A、花粉粒是在花药中的花粉囊里形成的B、被子植物精子的形成是直接减数分裂的结果C、被子植物的花粉的发育要经历四分体时期、单核期、双核期等阶段D、花粉粒在发育过程中，核先位于细胞一侧，再移到细胞中央BD（二）产生花粉植株的两种途径①②移栽花药中的花粉胚状体脱分化愈伤组织花药中的花粉脱分化分化

丛芽再分化

丛芽诱导生根体细胞胚（胚状体）：在组织培养过程中，某些细胞在形态上转变为与合子发育成的胚非常相似的结构，发育过程亦与合子胚类似。体细胞体细胞胚类似合子发育成的胚的结构（具有胚根、胚芽、胚轴等结构）植物组织培养过程中单倍体性细胞花粉胚知识拓展①胚状体②胚状体的结构及其发育过程与种子相似1、形成原因培养基中的激素种类及浓度配比2、植株的特点：单倍体植株，植株弱小，高度不育。思考：（1）为什么愈伤组织和胚状体到丛芽分别称为分化和再分化？胚状体就像种子，有胚芽、胚轴、胚根等结构。胚状体到丛芽就是由原始的分化状态继续生长和分化完成的。而愈伤组织形成丛芽的过程是从脱分化状态进入再分化形成丛芽的过程。（2）花粉植株弱小，高度不育，是否就没有利用价值？用于单倍体育种技术，可明显缩短育种周期，培育纯合新品种。

烟草花药培养胚状体发育途径：愈伤组织转接种到再生培养基愈伤组织分化形成再生植株水稻花药培养部分花药产生愈伤组织接种在平板上的水稻花药愈伤组织发育途径：（三）影响花药培养的因素1、材料的选择从花期看：月季的初花期从花粉发育时期看：单核期从花蕾看：完全未开放的(可挑选到单核期的花药，菌少、易消毒)选择单核期以前的花药接种，质地幼嫩，极易破碎；选择单核期之后的花药接种，花瓣已有些松动，又给材料的消毒带来困难，且难以挑选到单核期的花药。其它时期选择的缺点:2、培养基：花药培养基所采用的培养基可能因植物的不同而有所变化。小麦为N6培养基，马铃薯、月季为MS培养基，油菜为B5培养基。3、其他因素亲本植株的生长条件、材料的低温预处理以及接种的密度等对诱导成功都有一定的影响思考：为什么花瓣松动会给材料的消毒带来困难？花瓣松动后，微生物就可能侵入到花药，给材料的消毒带来困难。二、实验操作（一）材料的选取选择花药时一般通过镜检确定花粉发育时期，此时需要对花粉细胞核进行染色。②某些植物的花粉细胞核不易着色，需采用焙花青-铬矾法，这种方法能将花粉细胞核染成蓝黑色。①最常用的方法有醋酸洋红法(将染色体染成红色)1、方法①醋酸洋红法染色机理醋酸洋红为碱性染色剂，而花粉细胞内有染色体，染色体主要成分是DNA和蛋白质,易被碱性染料着色染成红色

。将体积分数45％的醋酸100ml煮沸，缓缓加入1g洋红，再加热回流8h，冷却至50℃，过滤即可。②醋酸洋红的配置2、醋酸洋红法将花药放在载玻片上，加一滴质量分数1％的醋酸洋红，用镊柄将花药捣碎，盖上盖玻片在显微镜下检查。③染色操作3、焙花青—铬钒法将无水酒精与冰醋酸按体积比为3：1的比例混匀①卡诺氏固定液的配制方法

花药应该在卡诺氏固定液中固定20min，然后取出放在载玻片上，加焙花青—铬钒溶液染色，盖上盖玻片后在显微镜下检查。这种方法能将花粉细胞核染成蓝黑色。将5g铬明矾[K2SO4Cr2(SO4)·24H2O]加入90ml蒸馏水中，溶解后加入0.1g焙花青，混匀并加热至沸腾，煮沸5分钟后冷却至室温，过滤，加蒸馏水定容至100ml。②焙花青—铬钒溶液的配制方法③染色操作（二）材料的消毒花蕾（70％酒精）大约30s（无菌水）清洗（无菌吸水纸）吸干

水分（1％氯化汞溶液）2～4min（无菌水）冲洗说明：用于培养的花药，实际上多数未熟，由于它的外面有花萼、花瓣或颖片保护，通常处于无菌状态，所以只要将整个花蕾或幼穗消毒即可。思考：月季花蕾的消毒与菊花外植体的消毒相比较，二者有何不同？在酒精消毒前，花药不需要预先用流水冲洗、洗衣粉洗涤和软刷刷洗。（三）接种和培养在无菌条件下除去萼片和花瓣用镊子取出花药②要彻底去除花丝，因为与花丝相连的花药不利于愈伤组织或胚状体的形成。

立即将花药接种于培养基上，通常每瓶接种花药7-10个。1、剥取花药①勿损伤花药，否则接种后容易从受伤部位产生愈伤组织。2、接种注意：①培养条件：温度控制在25℃左右，不需要光照。幼小植株形成后才需要光照。

3、培养②培养：一般经过20-30天培养后，会发现花药开裂，长出愈伤组织或释放出胚状体。长出愈伤组织则将愈伤组织及时转移到分化培养基上，以便进一步分化出再生植株。③注意：如果花药开裂释放出胚状体，则一个花药内就会产生大量幼小植株，必须在花药开裂后尽快将幼小植株分开，分别移植到新的培养基上，否则这些植株将很难分开。

在花药培养中，特别是通过愈伤组织形成的花粉植株，常常会出现染色体倍性的变化（主要原因是营养细胞核和生殖细胞核融合造成的）。4、鉴定和筛选三、结果分析与评价1、选材是否恰当2、无菌技术是否过关3、接种是否成功选材是否成功是花药培养成功的关键。如果出现了污染现象，说明某些操作步骤，如培养基灭菌、花蕾消毒或接种等有问题。如果接种的花药长出愈伤组织或释放出胚状体，花药培养的第一步就成功了。要