淋巴细胞分离、E花环

淋巴细胞分离、E花环微生物免疫教研室实验目的掌握密度梯度离心法分离外周血淋巴细胞的的原理和方法。掌握E花环测定原理和判定标准熟悉E花环测定操作方法实验原理外周血淋巴细胞分离常用方法是聚蔗糖-泛影葡胺密度梯度离心法。PBMC与血液中的其他成分存在密度差异，利用密度在1.077±0.002之间，而且近于等渗的Ficoll-Hypaque混合溶液（称为淋巴细胞分层液）作密度梯度离心时，各种血液成分将按密度梯度重新分布聚集。血浆和血小板由于密度较低，故悬浮于分层液的上部；红细胞与粒细胞由于密度较大，故沉于分层液的底部；PBMC密度稍低于分层液，故位于分层液界面上，这样就可获得淋巴细胞。实验材料与试剂①肝素（100U/毫升）、D-Hanks液、淋巴细胞分离液（ficoll）、瑞氏染液②离心机、显微镜、试管，吸管等。实验方法与步骤1、采集兔静脉血，注入盛有肝素（20U/ml）的搪瓷缸中，立即轻轻摇匀，使血液抗凝。2、每组用吸管吸取2ml抗凝血，加入等体积即2ml的室温D-Hanks液，使血液等倍稀释。3、每组取已加入2ml淋巴细胞分离液的试管1支，将离心管倾斜45角，在距分层液界面上1cm处将稀释血液沿试管壁缓慢加至分层液上面，每管4ml，注意保持两者界面清晰，勿使血液混入分层液内。4、2500转/分离心20min，离心后，管内可分为四层：上层为血浆、血液稀释液及绝大部分血小板；下层为红细胞及粒细胞；中层为细胞分层液；分层液与血浆交界部位混浊的灰白色层即为淋巴细胞层。5、另取1只10ml试管，加入6mlD-Hanks液，用毛细吸管轻轻插到白膜层，取吸淋巴细胞层至此试管中，1500转/分离心10min洗涤，共2次。6、弃上清，用1mlD-Hanks定容细胞，混匀。7、用瑞氏染液染色，观察所分离细胞的形态和结构，并画图。瑞氏染色吸取淋巴细胞涂片，待涂片干燥后，滴加瑞氏染料3-5d，铺满玻片，0.5-1min后滴加等量的瑞氏染料缓冲液，用洗耳球吹匀，使染料混合均匀，5-10min后用流水冲洗，待干后镜检。注意事项1、将稀释血液加入Ficoll上时动作要轻，使界面清楚，避免与Ficoll混合。2、操作应轻柔，细胞悬液应充分混匀，避免损伤细胞活性及细胞丢失。3、细胞分层液的密度是影响分离效果的关键之一，最适密度在室温下应为1.077±0.002；应避光4℃下保存，取出后逐渐升至室温后混匀，方可使用；使用中应避免细菌污染。4、离心时的温度对分离效果亦有影响，温度过低，离心时间需适当延长，淋巴细胞丢失增多；温度过高，增加红细胞凝聚，且影响淋巴细胞活性。离心时最适温度为18-25℃。E花环实验（示教）实验原理正常人的T淋巴细胞表面具有能与绵羊红细胞（SRBC）表面糖肽相结合的受体（E受体），即CD2分子，是一种糖蛋白，是T细胞所特有的表面标志，在体外一定条件下T细胞能直接与SRBC结合，形成玫瑰花样细胞团，称为E花环。此实验即为E玫瑰花环试验，常用于检测T细胞的数量、活性及分离T细胞。实验材料器材：离心机、显微镜、试管、玻片、毛细吸管、试剂：详见实验教材P248实验方法1、分离得到淋巴细胞，计数后，用Hanks液配成1×107/ml细胞悬液。2、取0.1ml淋巴细胞悬液，加入0.1ml1%SRBC及20μl灭活小牛血清，混匀37℃静置5min，以低速500rpm离心5min，然后放入4℃冰箱2h或过夜。3、取出试管，在细胞悬浮前，吸弃一半上清液，加入0.8%戊二醛溶液0.1ml，轻轻旋转混匀，置于4℃冰箱固定15min，制成湿片观察计数或制成干片，经瑞氏染色后镜检，此为Et花环，t代表细胞总数。4、部分T细胞具有高度亲和力的SRBC受体，当SRBC与淋巴细胞按8:1混合，低速离心后不经低温放置，即能迅速形成E花环，称为Ea花环。结果与分析凡能结合三个以上SRBC者即为E花环阳性细胞，计数200个淋巴细胞，算出花环形成细胞的百分率，Et花环正常值60%-80%。Ea花环正常值25%-40%注意事项1、试验用的SRBC要新鲜，脱纤维血4℃保存不超过10天。