釉成熟蛋白多肽多克隆抗体的制备及其功能,免疫学论文

釉成熟蛋白多肽多克隆抗体的制备及其功能,免疫学论文釉成熟蛋白〔amelotin〕是一种在人的成釉细胞特异性表示出的蛋白，在小鼠、猪、大鼠等物种中高度保守，相对分子质量〔Mr〕21000~38000[1-3].小鼠amelotin全长cDNA序列为1022bp,编码213个氨基酸，富含亮氨酸、脯氨酸、苏氨酸残基，与人的amelotin高度同源[4-6].Amelotin家族成员在5端均具有16个氨基酸的信号肽序列[7],因此它们可能是一种分泌性的蛋白。研究发现，amelotin介入釉质的发育、成熟经过，其构造和功能的改变与釉质发育相关疾病有密切关系[8-10].国外公司有商品化的抗体出售，价格昂贵，并且特异性不强，灵敏度不高，无法知足当前的实验要求。本课题组曾根据amelotin的全长氨基酸序列，应用构建重组融合蛋白的方式方法制备了amelotin多克隆抗体[11],但是该方式方法制备的抗体的特异性及效价已经缺乏以知足我们的后续实验需要；并且该方式方法制备抗体的经过程序繁琐，耗时较长，影响实验进程。为进一步讨论amelotin在釉质的发育、成熟经过中的功能，我们应用设计合成多肽的方式方法制备了效价高、特异性好的amelotin多肽多克隆抗体，其辨别抗原表位的能力更强。1材料和方式方法1.1材料完全Freund佐剂〔completeFreundsadjuvant,CFA〕、不完全Freund佐剂〔incompleteFreundsadjuvant,IFA〕、丙烯酰胺购自Sigma公司；牛血清白蛋白〔bovineserumalbumin,BSA〕、多聚赖氨酸、辣根过氧化物酶〔horseradishperoxidase,HRP〕标记的山羊抗兔IgG、ABC免疫组织化学检测试剂盒、DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司；放射免疫沉淀技术〔radioimmunoprecipitationassay,RIPA〕裂解液、二辛可宁酸〔bicinchoninincacid,BCA〕蛋白浓度测定试剂盒购自上海碧云天公司；聚偏二氟乙烯〔polyvinylidenefluoride,PVDF〕膜购自Roche公司；ECLPlus化学发光试剂盒购自SantaCruz公司。出生后3、7d昆明小鼠各2只，新西兰大白兔2只〔3kg/只〕由潍坊医学院实验动物中心提供。1.2方式方法1.2.1Amelotin抗原表位的分析由GenBank蛋白质数据库中获取amelotin蛋白氨基酸序列，利用在线蛋白分析工具ANTHEPROT5.0、DNAStar等进行亲水性〔hydrophilicity〕、外表可及性〔surfaceaccessibility〕、柔韧性〔flexicity〕、抗原性和二级构造等参数的综合预测，并应用Blast程序进行同源性和保守性分析，最终确定需要合成的多肽序列。1.2.2兔抗amelotin多肽抗体的制备Amelotin多肽由武汉三鹰生物有限公司合成，将合成的amelotin多肽肽链与钥孔戚血蓝素〔keyholelimpethemacyanin,KLH〕采用戊二醛连接法进行交联[3],构成amelotin-KLH偶联物，此大分子物质即为我们之后免疫动物所用的半抗原。取2mg〔1000L〕的多肽KLH偶联物与等体积的CFA混合，充分乳化。在新西兰大白兔背部选取4个注射点进行注射，每点约250L.4周后加强免疫1次，用IFA将剂量减半的多肽偶联抗原充分乳化后进行背部注射。之后2周加强免疫1次。兔耳缘静脉采血进行抗血清效价测定，达理想效价后，再次注射无佐剂的amelotin-KLH抗原250L/点，加强免疫1次，3d后颈动脉放血，收集并分离血清，无菌分装，-80℃保存备用。1.2.3Amelotin多肽抗体的纯化采用亲和层析法进行多肽抗体纯化。首先将1mgamelotin多肽与溴化氰〔cyanogenbromide,CNBr〕活化后的Sepharose4B偶联，制备多肽亲和层析凝胶。取20mL兔抗amelotin血清与1.6mL多肽偶联凝胶，4℃旋转混合6h,参加层析柱；PBS冲洗平衡凝胶，之后参加1mL0.1mol/LpH2.9甘氨酸缓冲液洗脱10次；用10支预先参加100LpH7.5Tris-HCl缓冲液的收集管收集洗脱液。为确保实验效果，操作均在4℃下进行。通过BCA蛋白浓度测定试剂盒对蛋白质进行定量，SDS,考马斯亮蓝染色了解纯化效果。1.2.4间接ELISA测定抗血清效价以1mg/L多肽KLH偶联物100L/孔包被96孔酶标板，4℃过夜。滴加5g/LBSA〔160L/孔〕37℃封闭2h.参加稀释的纯化多肽抗体、免抗血清或非免疫血清〔100L/孔〕，37℃孵育1h.滴加HRP标记的山羊抗兔IgG〔1∶3000〕，37℃孵育1h;TMB显色液室温避光显色15min,2mol/L硫酸终止显色，测定样品在450nm的吸光度〔A〕值。以A抗血清/A阴性2.1作为阳性判定的根据1.2.5Westernblot法鉴定amelotin多肽抗体的特异性利用RIPA裂解液试剂盒制备成釉细胞总蛋白，用2SDS上样缓冲液悬浮大肠杆菌中表示出的小鼠amelotin融合蛋白〔潍坊医学院口腔医学研究所实验室制备储存〕、含有活性amelotin的小鼠成釉细胞蛋白裂解液及KLH,95℃加热7min后，冰上冷却10min.以40g/孔的量进行上样，经SDS分离蛋白质，电转至PVDF膜上。经50g/L脱脂奶粉室温封闭1h后，滴加1∶1000稀释的纯化多肽抗体，室温孵育2h.洗涤后，参加HRP标记的山羊抗兔IgG〔1∶5000〕，室温孵育1h.ECLPlus化学发光试剂盒处理5min,于暗室曝光到X光胶片上。1.2.6制备的amelotin多肽抗体的应用免疫组织化学染色观察amelotin在小鼠下颌中的表示出。取出生后3、7d昆明小鼠下颌骨组织，置于100mL/L甲醛中，4℃固定16h;经100g/LEDTA溶液4℃脱钙6d,常规制作石蜡切片。组织切片脱蜡入水，将切片于pH6.0柠檬酸钠缓冲液中，95℃40min进行抗原修复；50mL/LH2O2甲醇中15min去除内源性过氧化物酶活性，滴加1∶50的正常羊血清37℃封闭30min;滴加纯化兔抗amelotin多肽抗体〔1∶50〕，同时以商品化的amelotin抗体为对照，以非免疫血清为阴性对照，4℃孵育过夜，ABC免疫组织化学检测试剂盒进行检测。DAB显色，中性树胶封片，显微镜下观察结果，以棕黄色染色断定为阳性结果。2结果2.1Amelotin的氨基酸序列分析用在线蛋白工具对amelotin的蛋白质氨基酸序列进行分析，以避免制备的多肽抗体与其他同源蛋白之间的穿插反响，提高抗体的特异性。针对蛋白质的亲水性、柔韧性、二级构造、抗原性及外表可及性等参数预测结果进行综合研究，确定amelotin的第197~210位的14个氨基酸〔ATHTTEGTTIDPPN〕为需要合成的多肽序列〔图1〕。2.2Amelotin抗血清效价的测定及多肽抗体的纯化利用amelotin多肽KLH偶联物为抗原免疫新西兰大白兔，获得兔抗血清，亲和层析法对amelotin抗血清进行纯化，经SDS后条带单一，BCA蛋白浓度测定试剂盒检测免疫2只大白兔获得的抗体的浓度分别为300g/mL和450g/mL,选用高浓度抗体进行下一步实验〔图2〕。间接ELISA检测表示清楚免疫获得的抗血清的效价可到达1∶100000,纯化后的amelotin抗体效价可达1∶1000000〔图3〕。2.3Amelotin多肽抗体的特异性鉴定以制备的小鼠amelotin大肠杆菌融合表示出蛋白、含有活性amelotin的小鼠成釉细胞蛋白裂解液作为抗原，amelotin多肽抗体为一抗进行Westernblot法检测，条带1~2显示多肽抗体与amelotin大肠杆菌融合表示出蛋白互相作用，出现1条清楚明晰的带，与融合表示出蛋白amelotin的Mr大小相符；条带3~5显示与活性amelotin的成釉细胞蛋白裂解液互相作用，出现1条清楚明晰的目的条带，与活性amelotin大小相符；而与KLH互相作用则无条带出现〔图4〕。讲明所制备的抗体既可辨别含有半抗原的抗原表位蛋白，又能与天然的amelotin蛋白结合。2.4制备的多肽抗体检测amelotin在小鼠下颌组织的表示出用纯化的amelotin多肽抗体对3、7d小鼠的下颌组织进行免疫组织化学染色，在3、7d小鼠的磨牙釉质全层观察到强阳性信号带〔图5A、B〕。商品化amelotin抗体组仅在7d小鼠磨牙釉质见到较弱的阳性信号，以非免疫血清代替一抗组未检测到amelotin阳性表示出信号〔图5C、D〕.另外，在7d小鼠下颌下腺的导管上皮细胞的胞质中还观察到amelotin的表示出，而腺泡细胞则呈阴性反响，但3d小鼠的下颌下腺中未见amelotin的表示出〔图5E、F〕。3讨论Amelotin是近期发现的一种新的与牙釉质的发育成熟有关的釉质基质蛋白，它定位于人的4号染色体q13.3区域与釉蛋白〔enamelin〕和成釉蛋白〔ameloblastin〕严密相连[12-14].Amelotin在釉质分泌阶段未见明显表示出，随着釉质发育成熟amelotin在成釉细胞中的表示出逐步增加，可见此蛋白可能与牙釉质矿化经过有关联[15-16].遗传性釉质发育不全〔amelogenesisimperfects,AI〕的致病基因定位于4q11-4q21区域，而amelotin可能与AI的发生密切相关[17-18].我们研究小组在2018年根据amelotin的全长氨基酸序列，构建了pET32a-Amelotin原核融合表示出载体，根据重组融合蛋白制备了amelotin多克隆抗体[11],该方式方法制备的抗体特异性和效价已经无法知足我们的实验要求，为更好地研究amelotin的生理及病理特性，我们设计合成了amelotin多肽，之后制备了amelotin多肽多克隆抗体，经实验证明该抗体特异性强、灵敏度高，该方式方法的优势在于使用少量的多肽抗原即可获得大量质量均一的特异性amelotin蛋白，经济简单。通过对amelotin氨基酸序列的亲水性、外表可及性、柔韧性、二级构造及抗原性等参数应用软件综合评价预测结果的分析[18],我们最终确定amelotin的第197~210位区域14个氨基酸作为其抗原决定簇。同时在蛋白质数据库中进行同源性检索，验证其特异性。为增加合成的小分子多肽的免疫原性，我们设计多肽时在其C端加1个半胱氨酸，并与载体KLH偶联。通过ELISA和Westernblot实验，我们发现制备的amelotin多肽KLH具有很好的免疫原性，获得的抗血清具有较高的效价，可到达1∶1000000,与我们以前制备的amelotin效价1∶12800相比[11],抗体效价明显提高，能够知足后续的实验应用。并且制备的amelotin多肽抗体既能特异辨别融合的蛋白，又能辨别天然构象的蛋白，这表示清楚我们利用所设计和合成的多肽制备的抗体是成功的。利用制备的多肽抗体进行的免疫组织化学染色，结果显示amelotin在出生3、7d小鼠的磨牙牙釉质中高表示出，与我们之前利用重组融合蛋白的方式方法制备amelotin抗体的检测结果一致[11],与商品化的amelotin抗体相比，特异性更高层次。另外，还在7d小鼠下颌下腺的导管上皮细胞的胞质中观察到amelotin的表示出，但3d小鼠中未见表示出。作为介入釉质发育成熟的特异性蛋白，为何在腺体中有所表示出，并且表示出量呈现时空特异性，能否amelotin也与腺体的发生分化及发育异常有关，还有待于进一步研究。以上实验证明我们成功设计和合成了amelotin多肽片段，制备的多肽抗体效价高、特异性好，符合实验要求。Amelotin合成多肽及其抗体的成功制备，为下一步进行amelotin的分子功能及蛋白