工具酶与基因工程oweroin演示文稿

第一部分

工具酶与基因工程

一．限制性核酸内切酶1．限制性核酸内切酶的发现

2．I类和III类限制和修饰酶的基本特征

3．II类限制和修饰酶的基本特征

4．甲基化酶的基本特征

二．其它工具酶

1．DNA连接酶2．聚合酶3．末端脱氧核苷酰转移酶(TdT)4.SI核酸酶5．Bal31核酸酶6．碱性磷酸单脂酶

限制性内切酶(RestrictionEndonuclease)

*存在于任何一种原核细菌中.

*在特异位点上催化双链DNA分子的断裂,产生相应的限制性片段.

*各种生物呈现特征性的限制性内切酶切图谱.

*在生物分类,基因定位,基因重组,疾病诊断,刑事侦察领域极为重要.

一．限制性内切酶的发现：(宿主细胞的限制和修饰作用)宿主细胞的限制和修饰作用：两种不同来源的入-噬菌体入K；入B，能高频感染各自大肠杆菌宿主细胞（K株，B株）。当它们分别与其它宿主菌交叉混合培养时，感染下降数千倍。一但入K噬菌体在B株成功，由B株繁殖出入K后代，能感染B株,不能感染原来K株.1宿主细胞的限制和修饰作用；1．两种不同来源的入-噬菌体（入-K，入-B）。2．能高频感染各自大肠杆菌宿主细胞（K株，B株）。3．当它们分别与其它宿主菌交叉混合培养时，（入K-B，入B-K）感染下降数千倍。4．一但入K噬菌体在B株成功，由B株繁殖出入-K后代，能感染B株,不能再感染原来K株.

称为：宿主细胞的限制和修饰作用二．限制和修饰作用的分子机制1．大肠杆菌宿主细胞K株，B株，有各自的限制和修饰系统。1）

它们均有三个连续的基因位点控制，hsdR;hsdM;hsdS.2）

hsdR编码限制性核酸内切酶---识别DNA分子特定位点，将双链DNA切断。（DNA分子转化细胞：受体细胞去掉hsdR基因位点）3）

hsdM编码产物是DNA甲基化酶---催化DNA分子特定位点的碱基甲基化反应。4）

hsdS表达产物的功能是---协助限制性核酸内切酶和甲基化酶，识别特殊的作用位点。

2.入噬菌体长期生长在大肠杆菌宿主细胞K株，B株中，1）宿主细胞甲基化酶，将染色体DNA和噬菌体DNA特异性保护.2）封闭自身所产生的核酸内切酶的识别位点。------（修饰）3．当外来DNA入侵时，遭到宿主限制性内切酶的特异降解----------（限制）

4.由于降解不完全，外来少数DNA分子在宿主细胞中繁殖过程中被宿主细胞的甲基化酶修饰，虽然是外来却不被降解。

5．但丧失在原宿主细胞中的存活能力，因为接受了新宿主菌甲基化修饰的同时丧失了原宿主菌修饰的标记(一但入-K噬菌体在B株成功，由B株繁殖出入-K后代，能感染B株,不能感染原来K株.)

6．细菌利用限制和修饰系统来区分自身DNA与外来DNA。C株不能产生限制性内切酶，其它来源入-噬菌体可以感染C株，而在C株繁殖入-噬菌体则在K株和B株受到严格的限制作用三．限制性内切酶的分类：（三大类）I．I类，II类,III类.2．I类，III类为限制---修饰酶。限制性内切活性和甲基化活性，都作为亚基的功能单位包含在同一酶分子中。3．II类限制性内切酶与甲基化酶是分离的，切割位点专一，适合于DNA重组。四．原核细胞中限制和修饰系统四．原核细胞中限制和修饰系统I类酶II类酶III类酶

酶分子三亚基双功能内切酶与甲基化酶分离二亚基双能

识别位点二分非对称序列4-6bp序列，回文结构5-7bp非对称序列

切割位点距识别位点1000bp在识别位点中或靠识别位点在识别位点下游24-26bp限制性反应互斥分开反应同时竟争与甲基化反应限制作用需要ATP需要需要不需要

五．I类酶，III类酶限制-修饰酶基本特怔

1）I类酶，EcoK，EcoB。（1）异源多聚体，亚基R.M.S分别具有限制,修饰酶的作用，特异性位点识别活性。（2）I类酶与DNA识别位点结合依赖亚基M与辅助因子S—腺苷甲硫氨酸(SAM)相互作用。（3）S—腺苷甲硫氨酸(SAM)通过变构作用使酶处于活性状态，酶与DNA识别位点结合后，根据甲基化状态发挥相应酶的活性，或限制,或限修饰，或不限制不限修饰

2））III类类限限制制修修饰饰酶酶基基本本特特怔怔（1））亚亚基基R，，MS亚亚基基组组成成。。MS亚亚基基具具有有识识别别和和甲甲基基化化修修饰饰双双重重作作用用.（2））修修饰饰与与限限制制取取决决于于两两亚亚基基之之间间的的竟竟争争。。（3））切切割割位位点点无无特特异异性性，，只只与与识识别别位位点点的的距距离离有有关关MboII识识别别5’’-AAGA-3’’切割割位位点点5’’-GAAGANNNNNNNN/N-3’’3’’-CTTCTNNNNNNN/NN-5’’3））II类类限限制制修修饰饰酶酶基基本本特特怔怔（1））命名名规规则则：：生物物体体属属名名的的第第一一大大写写字字母母和和种种名名前前两两个个小小写写构构成成基基本本名名称称基本名称称+菌菌株名名的字母母+罗罗马字字母（发发现顺序序）HidIIIHaemophilusinfuenzaed株中中的第三三个酶EcoRI基因位于于Escherichiacoli抗药药性R质质粒上EcoRI细菌属名名细细菌菌种名种种菌菌株类类型有有几种限限制酶（2）特特点A．识别别序列––4，5或或6个碱基基对，EcoRI识识别别5’’-G/AATTC-3’’序列列3’-CTTAA/G-5’B．180度度旋转对称回回文结构，对对称轴在第三三，四碱基之之间。C．任何一个个DNA分子子，每9对碱碱基出现一个个II类酶切切口。（3）切割割方式A．以酶切特特点来分同位酶：识别别相同序列切切点不同。同裂酶：识别别位点相同，，酶的来源不不同。同尾酶：识别别位点不同，，切出片段有有相同末端序序列。B．以切出片片段末端性质质不同可分，，粘性末端和和平末端。粘性末端：（（CohesiveEnds）两两个突出末端端可退火互补补——DNA是分子子重组的基础础限制内切酶切切出的三种断断口六．甲基化酶的的基本特征：：1)Ⅱ类限制制性内切酶有有相应甲基化化酶伙伴，a)限制性内内切酶，甲基基化酶的识别别位点相同，，序列内使碱碱基甲基化，，封闭酶切口口。b)甲基化酶酶封闭一个限限制性内切酶酶切口同时产产生另一种酶酶切口。c)DNA腺嘌呤甲甲基化酶DarnDNA胞嘧啶啶甲基化酶Dcm七．酶切图谱谱示意图1。一圈表示一种种酶。2．单切口酶在里里圈，越多切切口酶越在外外面。3．大写英文字母母表示片段（（A，B，，C…A>B）。。4．两种片段同样样大小（A1A2A3…E1E2E3……）。几次实实验后，大小小不一致致以虚线线表示不肯定定。八．DNA切切接反应的影影响因素1．限制性内切酶酶的切割反应应10-50mmol/LTris-HCl(PH7.5),10mmol/LMgCl2,1mmol/LDTT(二硫苏糖糖醇)只是盐浓度不不同，分低盐盐，中盐，高高盐组,1）需两种酶酶切同一分子子，酶对盐浓浓度相同，可可同时反应。。2）需两种酶酶切同一分子子，酶对盐浓浓度要求差别别不大，中，，高盐，可同时反反应。利于酶酶较贵重的盐盐浓度缓冲液液。3）两种酶切切同一分子，，酶对盐浓度度要求差别大大，低，高盐盐，不可同时时反应。a)低盐盐组先切，加加热灭活后，，补加盐浓度度再切。b)沉淀淀后重新加入入另一种盐浓浓度缓冲液c）两种酶不不能同时反应应，有先有后后。图图3-162．酶量标准反应37度反应1小小时完全水解解1微克所需需的酶量。0.1—1.0微克DNA5微升10倍缓冲液液2微升酶1微升（10倍过量））无菌水12微升总体积20微升酶加入量不超超过总体积十十分之一.九．酶切位点点的确定lineDNAW=N+1cccDNAW=N1.片段大小2450lineDNAW=N+1cccDNAW=N2.两单酶切成三三个片段,说说明各有两个个切点------p-------p---------75050012003.Pst1,1200,750不见,说明明:(1)另另外两两个酶的切点点在其中---x-----p------p---x------Xbo1500(2)两两个Pst1酶的切切点相距500500---1200---4.1200---300+900(被Xbo1)---x-----p------p---x-----300900Pst1距Xbo1为300--750----5.750—150+600----x------p-----p---x-----150600Pst1距Xbo1为600-------1400-------6.1400——600+500+300---x------p------p---x-----600500300-------------2450-------------7.2450-150+600+500+300+900---x------p------p----x-----150600500300900基因重组的其其它工具酶1．DNA连接酶催化的基本反反应形式：图图3-11DNA双链分分子上相邻3’羟羟基和和5’磷磷酸酸集团共价结结合，形成3’-5’’磷酸二二酯键，使原来断开的的缺口重新连连接起来。（1）T4DNA连接接酶由T4噬菌体基因因编码，分分子量60KD。基本活性:图图3-121）修复双双链DNA上单链缺缺口2）连接RNA-DNA杂交交双链上DNA链缺缺口3）连接完完全断开两两个平头双双链DNA分子。修复双链DNA上单单链缺口口，连接RNA-DNA杂交交双链上DNA链缺口，，连接完全断断开两个平平头双双链DNA分子子。2．聚合酶酶DNA聚合合酶活性3-131）5’---3’’聚合酶活活性2）3’---5’’外切酶活活性3）5’---3’’外切酶活活性4）核酸内内切酶活性性Klenow酶1）5’---3’’聚合酶活活性2）3’’---5’外切酶酶活性作用用：：1））修修复复限限制制性性内内切切酶酶造造成成3凹凹端端，，成成为为平平末末端端。。2））用用同同位位素素对对DNA标标记记。。3））催催化化第第二二链链合合成成4））测测定定DNA序序列列3．．末末端端脱脱氧氧核核苷苷酰酰转转移移酶酶(TdT)图图3-141））适适合合于于带带有有3’’游游离离羟羟基基的的双双链链分分子子。。2)DNA双链链3’端突出出时，TdT将脱氧氧核苷酸聚合合在二条链的的3’端。作用：TdT在人工粘性性末端的构建建极为有用。。4.SI核酸酶1）降解单链链DNA或RNA2）反应方式式为外切和内内切3）酶量大时时降解双链核核酸作用：切平突突出单链末端端,和发卡卡结构中环状状。制作SI图谱5．Bal31核酸酶图图3-151）3’端外外切酶活性2）5’端外外切和内切活活性。作用：1）从双链DNA两端连连续降解2）单链DNA外切和内内切3）超螺旋结结构的线性化化4）在在分子子克隆隆中可可控制制性截截短DNA分子子6．碱碱性磷磷酸单单脂酶酶BAP细菌菌的碱碱性磷磷酸单单脂酶酶，CIP牛小小肠的的碱性性磷酸酸单脂脂酶作用：：1）催催化核核苷酸酸性5’端端除磷磷反应应。2）重重组DNA中用用于载载体的的5’’末端端除磷磷操作作以提提高重重组效效率。。3）用用于外外源DNA片段段5’’端除除磷防防止外外源片片段之之间连连接。。7．T4DNA聚合合酶1）5’--3’聚聚合酶酶活性性2）3’---5’’外切切酶活活性3）5’---3’’外切切酶活活性生生成平平头分分子。。作用：：用于于修平平非平平头以以及由限制制性内内切酶酶水解解产生生3’’突出出末端端。9、静夜四无无邻，荒居居旧业贫。。。1月-231月-23Friday,January6,202310、雨中黄叶叶树，灯下下白头人。。。14:24:0514:24:0514:241/6/20232:24:05PM11、以我我独沈沈久，，愧君君相见见频。。。1月-2314:24:0514:24Jan-2306-Jan-2312、故人江江海别，，几度隔隔山川。。。14:24:0514:24:0514:24Friday,January6,202313、乍乍见见翻翻疑疑梦梦，，相相悲悲各各问问年年。。。。1月月-231月月-2314:24:0514:24:05January6,202314、他乡乡生白白发，，旧国国见青青山。。。06一一月月20232:24:05下下午14:24:051月-2315、比不了得得就不比，，得不到的的就不要。。。。一月232:24下下午1月-2314:24January6,202316、行行动动出出成成果果，，工工作作出出财财富富。。。。2023/1/614:24:0514:24:0506January202317、做前，，能够环环视四周周；做时时，你只只能或者者最好沿沿着以脚脚为起点点的射线线向前。。。2:24:05下午午2:24下午午14:24:051月-239、没有失败败，只有暂暂时停止成成功！。1月-231月-23Friday,January6,202310、很多事情努努力了未必有有结果，但是是不努力却什什么改变也没没有。。14:24:0514:24:0514:241/6/20232:24:05PM11、成成功功就就是是日日复复一一日日那那一一点点点点小小小小努努力力的的积积累累。。。。1月月-2314:24:0514:24Jan-2306-Jan-2312、世间间成事事，不不求其其绝对对圆满满，留留一份份不足足，可可得无无限完完美。。。14:24:0514:24:0514:24Friday,January6,202313、不知知香积积寺，，数里里入云云峰。。。1月-231月-2314:24:0514:24:05January6,202314、意意志志坚坚强强的的人人能能把把世世界界放放在在手手中中像像泥泥块块一一样样任任意意揉揉捏捏。。06一一月月20232:24:05下下午午14:24:051月月-2315、楚楚塞塞三三湘湘接接，，荆荆门门九九派派通通。。。。。一月月232:24下下午午1月月-2314:24January6,202316、少年年十五五二十十时，，步行行夺得得胡马马骑。。。2023/1/614:24:0514:24:0506January202317、空山新新雨后，，天气晚晚来秋。。。2:24:05