基因克隆载体

基因克隆载体第一页，共九十六页，2022年，8月28日基因克隆载体的特点具备与外源DNA片段连接和重组的克隆位点．进入受体细胞后能稳定存在于细胞质中或与染色体整合在一起．在宿主细胞或受体细胞中自我复制或随整合的受体细胞染色体DNA一起复制．外源基因能在受体细胞中表达．克隆载体进入细胞后有可供选择标记．第二页，共九十六页，2022年，8月28日２克隆载体的分类质粒载体大肠杆菌质粒载体，枯草杆菌质粒载体，酵母质粒载体，农杆菌质粒载体，蓝细菌质粒载体噬菌体质粒载体双链DNA噬菌体载体：λ

单链DNA噬菌体载体：M13，T3，T7病毒载体植物病毒载体CaMV（花椰菜花斑病病毒）动物病毒载体SV40（猿猴空泡病毒）2.1按构建克隆载体DNA的来源分类第三页，共九十六页，2022年，8月28日质粒和噬菌体DNA兼有的载体

Phasmid载体（含有f1噬菌体的ori）

Cosmid载体（含有λDNA的Cos区）染色体和质粒DNA兼有的载体（Chrosmidvector）基因整合平台系统ＹＡＣ克隆载体其它克隆载体第四页，共九十六页，2022年，8月28日2.2按克隆载体的用途分类cDNA克隆载体：λgt11，pT7T3

原核（Prokaryotic）表达载体：pKK223-3

原核基因融合（Prokaryoticgenefusion）载体：

pGEX-2T，pGEX-3X

真核（Eukaryotic）表达载体：pSVK3，pBPV

转录（Transcription）载体：pSL1190

普通载体（Generalvector）：pBR322，pUC18第五页，共九十六页，2022年，8月28日第二节质粒克隆载体１质粒载体的一般特性质粒是一种广泛存在于细菌细胞中染色体以外的能自主复制的裸露的环状双链DNA分子，比病毒更简单。在霉菌、蓝藻、酵母和一些动植物细胞中也发现了质粒，目前对细菌的质粒研究得比较深入。第六页，共九十六页，2022年，8月28日质粒载体的一般特性

质粒的组成与构型细胞内：超螺旋环状共价双链DNA分子细胞外：超螺旋、开环，线形双螺旋共价闭合环（超螺旋）开环双螺旋（一个裂口）线状双螺旋（两个裂口）第七页，共九十六页，2022年，8月28日

质粒DNA分子的大小：细菌质粒的大小相差较大，小的仅不足1kb，大的可达数百kb.

不相容性（Incompatible）：两种类似的但又不同的质粒不能存在于同一细胞中．可转移性：质粒可通过接合作用等方式转移到新的宿主细胞中．复制性：质粒DNA分子只在宿主细胞内进行单向复制，其复制受质粒本身和宿主细胞遗传系统的双重控制，质粒提供复制的起始位点和核苷酸的序列．第八页，共九十六页，2022年，8月28日6）相关基因

A）COP因子：决定质粒的拷贝数，在质粒的复制过程中指令细胞合成阻物，当质粒复制到一定的拷贝时，阻物的量也积累到足以阻止质粒的复制．B）Rep基因：在质粒的复制过程中，Replication基因会指令宿主细胞合成一种调节蛋白，促进质粒的复制．C）Inc基因：决定两种亲缘关系相近的两种质粒不能存在于同一宿主细胞中．D）Tra基因：指令宿主细胞合成菌毛（Pilus）和细胞表面物，促使宿主细胞与受体细胞表面结合，遗传物质的转移．E）抗性基因：抗菌素抗性基因，Apr，Tcr．F）产毒素基因：大肠杆菌素基因（Col-质粒）．G）降解基因：降解重金属、有机物和农药等．H)致瘤基因：诱导某些组织形成肿瘤，如Ti质粒，Ri质粒．

第九页，共九十六页，2022年，8月28日２几种常见的质粒载体１）pBR322：含有双抗基因（Apr，Tcr）ColE1复制起始子第十页，共九十六页，2022年，8月28日2）pUC18-19：含有pBR322的Apr基因和复制的起始点，部分缺失的Lac操纵子片段，并在LacZ’区组装了MCS．

第十一页，共九十六页，2022年，8月28日pUC18-19多克隆位点第十二页，共九十六页，2022年，8月28日3）pBluescriptM13：含有M13噬菌体DNA复制起点的载体，该起点以互为相反方向插入到含有T3和T7噬菌体启动子的一个来自pUC质粒的载体当中．

第十三页，共九十六页，2022年，8月28日pBluescriptM13多克隆位点第十四页，共九十六页，2022年，8月28日4）Ti质粒载体第十五页，共九十六页，2022年，8月28日第十六页，共九十六页，2022年，8月28日病毒区基因及功能第十七页，共九十六页，2022年，8月28日Ti质粒T-DNA的边界序列第十八页，共九十六页，2022年，8月28日３质粒载体的构建1）构建的质粒载体能转化受体细胞,并在其中进行松弛型复制.*选择松弛型质粒复制起始子(Ori)2)构建的质粒载体含有克隆外源DNA的位点(MCS)*构建的质粒载体含有选择标记基因(Apr,Tcr,Kmr)*构建的质粒载体分子量小,转化效率高,插入外源片段较大.3.1质粒构建的基本要求第十九页，共九十六页，2022年，8月28日3.2pBR322质粒载体的构建第二十页，共九十六页，2022年，8月28日３.3pUC18-19质粒载体的构建以pBR322为出发质粒，用含乳糖操纵子O、P和Z’的DNA片段取代pBR322上的Tcr基因，并在Z’区组入一个多克隆位点．第二十一页，共九十六页，2022年，8月28日pUC18-19的构建第二十二页，共九十六页，2022年，8月28日3.４蓝藻质粒载体的构建

蓝藻作为受体细胞的特点

a）原核生物，能进行光合作用，具有固氮能力．

b）基因组简单，50%的蓝藻含有质粒．

c）细胞大（10-10于E.coli）储藏蛋白多，单一蛋白可达

25%，而大肠杆菌仅为5%．

d）蛋白更新慢，容受性比较大

e）蛋白酶的降解作用比较低，产物比较均一．

蓝藻质粒的特点

a）双向载体（需要两种Ori）．

b）合适的选择标记．

c）分子大小合适．

d）拷贝高．第二十三页，共九十六页，2022年，8月28日蓝藻质粒载体pAQE17的构建第二十四页，共九十六页，2022年，8月28日3.５农杆菌Ti质粒载体的构建设计原理:保留T-DNA两侧的边界序列,插入选择性标记,除去致瘤基因和无关基因.共整合质粒载体:将T-DNA区段编码致瘤基因和冠瘿碱合成酶的基因由pBR322上的一段DNA片段取代,当携带目的基因片段的pBR322衍生中间载体进入农杆菌细胞后,两者相同的pBR322序列之间发生同源交换,导致外源目的基因片段整合到Ti质粒上.第二十五页，共九十六页，2022年，8月28日

外源片段共整合到Ti质粒上的过程第二十六页，共九十六页，2022年，8月28日双向载体：由两个以上的质粒构建而成.将Ti质粒的Vir与广宿主范围质粒的携带目的基因(MCS)、选择性标记、转移和复制功能整合在一起.双向载体可在大肠杆菌和农杆菌中进行复制并稳定存在下去．双向Ti质粒载体的构建第二十七页，共九十六页，2022年，8月28日第三节噬菌体衍生的克隆载体１.1λ噬菌体的一般特性

λ噬菌体的组成结构：外壳蛋白

DNA

形态：头部尾部１λ噬菌体克隆载体第二十八页，共九十六页，2022年，8月28日λ噬菌体的电子显微镜照片第二十九页，共九十六页，2022年，8月28日a)在噬菌体内呈线性双链DNA分子(48502bp)

在两端各有12个碱基组成的5’单链互补粘性末端(Cohesiveend),进入宿主细胞后,

粘性末端连接形成环状分子(Cos位点)．

5’-GGGCGGCGACCTXX…XXG-3’

XX…XXCCCCGCCGCTGGA-5’b)λ基因组DNA上有多种限制酶识别位点．

c)λ噬菌体包装DNA的大小为原λDNA长度的

75-105%(38-54kb)．λ基因组DNA的特点第三十页，共九十六页，2022年，8月28日1.2λ基因组DNA的结构第三十一页，共九十六页，2022年，8月28日噬菌体的组装第三十二页，共九十六页，2022年，8月28日1.3λ噬菌体载体构建的策略a)去除部分限制酶识别位点b)去除非必需区DNAc)插入可供选择的标记基因第三十三页，共九十六页，2022年，8月28日常用的λ噬菌体衍生载体载体名称分子大小(kb)可克隆外源DNA片段大小(kb)Charon3A4.830–21.4Charon4A

4.54

0–20.1Charon174.640-22.4Charon2040.360–21.37Charon21A41.70–21.08Charon2839.390–20.05Charon3046.760-20.24LA7–140.60–24.1Sep6-lac544.30–22.4BF10146.06.3–24.4第三十四页，共九十六页，2022年，8月28日2.Cosmid克隆载体2.1Cosmid载体的特点

a)兼有λ噬菌体和质粒载体的特点．含有λ噬菌体Cos位点(可进行体外包装)和细菌质粒载体的复制子(选择标记,可在细菌中保存和大量复制)．

b)可插入大片段外源DNA．第三十五页，共九十六页，2022年，8月28日2.2部分Cosmid载体Cosmid载体复制子分子量(kb)选择标记克隆位点克隆能力(kb)C2XBpMB16.8Apr,Kmr

BamHI,ClaI,EcoRI32-45

HindIII,PstI,SmaIpHC79pMB16.4Apr,Tcr

EcoRI,HindIII,SalI29-46

BamHI,PstI,CalIpHS262ColE12.8Kmr

BamHI,EcoRI,HincII34–46pJC74ColE115.8Apr

EcoRI,BamHI,SalI21–37pJB8ColE15.4Apr

BamHI,HindIII,SalI31–47MUA-3pMBI4.8Tcr

PstI,EcoRI,BalI32-48pTL5pMBI5.6Tcr

BgalI,BalI,HpaI31–47pMF7pMBI5.4Apr

EcoRI,SalI32–48第三十六页，共九十六页，2022年，8月28日3.M13衍生的克隆载体3.1M13噬菌体的特点*环状单链DNA(6407碱基),可转导E.coli*含有基因间隔区(IS-Intersequence)*具有转染作用(E.coli)第三十七页，共九十六页，2022年，8月28日3.2M13DNA的复制与M13噬菌体的增殖a)M13噬菌体吸附在大肠杆菌表面F性毛上,M13ss-DNA(+链)进入细胞．

b)在宿主细胞内以+链为模板合成大量的-DNA

链,成为双链复制型DNA(RF-DNA),同时在宿主细胞内合成大量的特异性蛋白与+链DNA

结合．

c)RF-DNA以-DNA为模板不断合成+链DNA,

与特异性蛋白结合,组装成新的噬菌体颗粒.

释放到细胞外,而不破坏宿主细胞．第三十八页，共九十六页，2022年，8月28日3.3M13衍生的克隆载体第三十九页，共九十六页，2022年，8月28日第四节植物病毒载体1.花椰菜花斑病病毒（CauliflowerMosaicVirus,CaMV)．

环状双链DNA病毒，由蚜虫以非持久方式或半持久方式传播、感染十字花科和少数非十字花科植物

第四十页，共九十六页，2022年，8月28日1）CaMV-DNA的一般特性

环状双链DNA（8031bp），在病毒颗粒中以开环的形式存在，分别在-链上有一个缺口(1），+链上有两个缺口（2，3），在缺口中形成三链结构．第四十一页，共九十六页，2022年，8月28日花椰菜花斑病病毒DNA缺口的结构缺口1：GAATTTTTTAA5’3’GCATTTTTTAA5’5’CGCTTAAAAAATT3’缺口2：5’GGTTGATTACTCGAGCC5’GGTTGATTACTCGAGAA3’3’CCAACTAATGAGCTCGGTT5’缺口3：5’TCCAATAGTCTTCTTTTTCAG5’TCCAATAGTCTTCTTTTTGAA3’3’AGGTTATCAGAAGAAAAACTCTT5’第四十二页，共九十六页，2022年，8月28日

CaMVDNA分子上有八个开放阅读框（ORF)和三个间隔区．

ORFI：编码运动蛋白，负责CaMV在细胞间运转．

ORFII：表达产物与蚜虫口针或前肠的特殊位点相结合，参与蚜虫的感染．

ORFIII：编码病毒结构蛋白．

ORFIV：编码反转录酶．2)CaMV基因区第四十三页，共九十六页，2022年，8月28日病毒增殖缺口闭合侵染编码病毒反转录酶，35S反转录表现症状和宿主范围编码外壳蛋白

花椰菜花斑病病毒基因组DNA的结构第四十四页，共九十六页，2022年，8月28日3)CaMVDNA的间隔区IR1：位于ORFVI和ORFVII之间，长度为

700bp，含有启动转录35SRNA的启动子．

IR2：位于ORFVII和ORFI之间，长度为60bp．

IR3：位于ORFV和ORFVI之间，长度为60bp，含有启动19SRNA转录的启动子．第四十五页，共九十六页，2022年，8月28日CaMV35S启动子序列第四十六页，共九十六页，2022年，8月28日4）CaMV-DNA限制性内切酶识别位点在CaMV-DNA的非必需区（II区和VII区）含有限制酶识别位点（如BstEII和XhoI），这些单酶切位点可用于插入外源DNA片段．第四十七页，共九十六页，2022年，8月28日CaMV（CabbB-S）DNA的部分酶切位点第四十八页，共九十六页，2022年，8月28日5）CaMV-DNA的存在状态与感染能力

DNA状态伤口感染

CaMV+CaMV-DNA+CaMV-DNA-单酶切+CaMV-DNA-双酶切5%CaMV-DNA-双酶切-插入DNA-CaMV-DNA+克隆载体-第四十九页，共九十六页，2022年，8月28日6）CaMV的转录复制与CaMV的增殖第五十页，共九十六页，2022年，8月28日7)CaMV-DNA克隆载体的构建

基本策略和要求

*利用病毒对宿主细胞感染的特性*利用DNA分子上的单酶切位点*替换非必需区*高拷贝地存在于植物细胞中第五十一页，共九十六页，2022年，8月28日互补载体系统由缺陷型CaMV-DNA分子(携带外源目的基因)+辅助CaMV-DNA分子(携带缺陷型感染所需的基因)

共同感染进入植物细胞并表达缺点:突变体之间发生重组,重新产生野生型CaMV第五十二页，共九十六页，2022年，8月28日

混合载体系统将CaMV-DNA整合到Ti质粒DNA分子上,使新的载体同时具有CaMV和Ti载体的特性.通过根癌农杆菌转移到植物细胞中.

特点:*扩大了CaMV的正常宿主范围*避免了CaMV突变体之间的基因重组第五十三页，共九十六页，2022年，8月28日2.烟草花叶病毒（TMV)克隆载体

烟草花叶病毒为短杆状，基因组为单链＋RNA，长为6395个碱基，包括四个阅读框．

ORF1：编码126kD蛋白质，参与病毒复制．

ORF2：编码183kD蛋白质，参与病毒复制．

ORF3：编码移动蛋白（MP)，分子量（30kD）

ORF4：编码病毒外壳蛋白（CP,17.5kD）第五十四页，共九十六页，2022年，8月28日TMV的结构特征第五十五页，共九十六页，2022年，8月28日TMV克隆载体构建的策略第五十六页，共九十六页，2022年，8月28日

第五节动物病毒基因克隆载体

1.猿猴空泡病毒40（Simianvirus40，SV40)第五十七页，共九十六页，2022年，8月28日1)SV40DNA的一般特性

SV40DNA为环状双链DNA（5243bp），与宿主细胞组蛋白H4，H2A，H2B和H3结合，组成念珠状核小体-微型染色体（mini-chromosome）

SV40DNA编码两个基因区，早期转录区和晚期转录区，分别以相反的方向转录第五十八页，共九十六页，2022年，8月28日SV40基因转录图第五十九页，共九十六页，2022年，8月28日SV40DNA单识别位点限制性内切酶位点

限制性内切酶识别位点

KpnI294

NaeI343

HpaII346

HaeII832

EcoRI1782

BamHI2533

BstXI2759

TaqI4739

BglI5235第六十页，共九十六页，2022年，8月28日2）SV40-DNA的转录、复制与增殖

SV40感染并进入细胞

病毒DNA进入细胞核进行早期转录，合成T抗原启动病毒DNA复制

晚期转录，合成包装蛋白

组装成病毒颗粒，细胞裂解第六十一页，共九十六页，2022年，8月28日3）SV40DNA衍生的克隆载体的构建

构建SV40DNA衍生克隆载体的策略

a)保留完整的T-抗原基因.b)保留复制起始点(Ori),间隔区和终止序列

c)替换晚期转录区基因.第六十二页，共九十六页，2022年，8月28日SV40DNA晚期转录区取代型载体第六十三页，共九十六页，2022年，8月28日SVGT5-RG---SV40病毒晚期区段取代载体第六十四页，共九十六页，2022年，8月28日重组病毒质粒载体含有完整早期区段和复制起始点的病毒质粒载体第六十五页，共九十六页，2022年，8月28日2.腺病毒克隆载体

腺病毒（adenovirus）是一类无囊膜的20面体病毒，含有一个线性双链DNA分子．在每一条单链DNA的5’端共价结合一种特殊结合蛋白（5.5kD），当DNA从病毒颗粒中释放后，通过该蛋白连接成环状．第六十六页，共九十六页，2022年，8月28日腺病毒结构第六十七页，共九十六页，2022年，8月28日腺病毒DNA的结构结合蛋白反向重复序列第六十八页，共九十六页，2022年，8月28日腺病毒克隆载体的构建第六十九页，共九十六页，2022年，8月28日第五节反转录病毒衍生的克隆载体

反转录病毒（retrovirus)是一类含RNA的病毒．感染到动物细胞后，病毒RNA通过反转录产生双链DNA分子，可整合到宿主细胞染色体上或成为原病毒，随染色体DNA进行复制、转录和翻译．第七十页，共九十六页，2022年，8月28日1.劳斯肉瘤病毒(RousSarcomaVirus，RSV)1）RSV基因组的特点

基因组由四条RNA分子构成，两条38SRNA编码病毒的全部遗传信息，两条较小的RNA分子为宿主细胞的tRNATrp．

38SRNA链带有两段相同的r序列的非编码区，分别位于5’-末端和3’-末端.第七十一页，共九十六页，2022年，8月28日RSV病毒RNA分子结构（非编码序列）

被膜基因聚合酶基因抗原基因

第七十二页，共九十六页，2022年，8月28日2）RSV病毒的复制与原病毒DNA的转录翻译第七十三页，共九十六页，2022年，8月28日3)反转录病毒克隆载体构建策略a）从感病细胞中分离原病毒DNA.b）根据不同需要引入选择标记、外源基因及

DNA复制的启动子.c）与质粒载体重组构建反转录病毒克隆载体

d）转化受体细胞E.Colie）包装成新的反转录病毒颗粒.f）感染目的宿主细胞（动物细胞），外源基因导入动物细胞.第七十四页，共九十六页，2022年，8月28日第六节基因定位整合克隆载体

为了保证外源DNA在细胞中稳定遗传并不对宿主细胞的代谢产生较大的影响，建立基因整合平台系统，使外源基因定位整合到染色体特定的位点．它包括整合平台和整合克隆载体两部分．整合平台：受体细胞基因组上给定的DNA区域．整合克隆载体：含有一个或两个与整合平台区核苷酸序列同源的DNA片断．

第七十五页，共九十六页，2022年，8月28日外源DNA整合到染色体上第七十六页，共九十六页，2022年，8月28日1.定位整合克隆载体的种类1)内源平台双交换置换克隆载体第七十七页，共九十六页，2022年，8月28日2)外源平台双交换置换克隆载体第七十八页，共九十六页，2022年，8月28日3)内源平台双交换插入克隆载体第七十九页，共九十六页，2022年，8月28日4)内源平台单交换插入克隆载体第八十页，共九十六页，2022年，8月28日2.整合克隆载体的整合效率

基因定位整合的效率与受体细胞的种属和同源DNA片断的长短有关．鼠胚胎干细胞hprt基因整合平台系统定位整合效率第八十一页，共九十六页，2022年，8月28日3.定位整合克隆载体的应用蓝藻染色体定位整合克隆载体酵母染色体定位整合克隆载体植物染色体定位整合克隆载体动物染色体定位整合克隆载体第八十二页，共九十六页，2022年，8月28日第七节酵母人工染色体（YAC）克隆载体人工酵母染色体（YeastArtificialChromosome）

a）保持染色体稳定所必需的顺式作用因子被确定．

b）建立了酵母高效表达系统．

c）建立了大片段DNA分离的方法（脉冲场凝胶电泳）．目的：用于克隆大于100kb的基因组DNA．某些基因如人凝血因子VII基因长达180kb，肌营养不良基因大于1800kb．第八十三页，共九十六页，2022年，8月28日1.pYAC4人工染色体

第八十四页，共九十六页，2022年，8月28日2．YAC克隆载体的应用