病毒感染的检测方法与防治原则精品课件

病毒感染的检查方法

与防治原则11/19/2023012345678910111213WeekResponseClinicalillnessALTIgMIgGHAVinstoolInfectionViremiaEVENTSINHEPATITISAVIRUSINFECTION病毒感染检测：病毒感染的检测方法:（针对病原体，针对特异性免疫反应）细胞培养鉴定病毒直接观察检测病毒抗原检测病毒核酸中和检测IgM检测IgG4倍以上升高细胞因子检测1/19/20233特异性检测病毒特异性检测抗病毒免疫标本采集与运送

标本的采集采样时间尽可能在发病的初期，急性期或患者人院的当天进行。1/19/20234标本的采集标本种类的选择根据临床感染的症状及流行病学资料，判断可能感染病毒种类，选择相应部位采取标本。1/19/20235常见分离病毒标本的选择1/19/20236病毒咽拭子粪便血液脑脊液唾液组织柯萨奇A和B组+++心单纯疱疹病毒+脑膜腮腺炎病毒+++流感病毒+轮状病毒+HAV+HIV+

精液常见标本的采集方法血液：以无菌取抗凝血10ml。抗凝选用100n／ml肝素钠。用于分离CMV、HSV、黄病毒、EBV、HIV-1及新生儿肠道病毒。脑脊液：以无菌取脑脊液1～2ml，冰浴立即送检。在4℃可存放72h。用于分离柯萨奇病毒、ECHO病毒、肠道病毒、腮腺炎病毒。宫颈或阴道拭子：采取病灶部位分泌物，或将拭子伸人宫颈约lcm停留5秒取出，冰浴立即送检。用于分离HSV、CMV。粪便标本：取2～4ｇ粪便加10ml运送液立即送检，用于分离腺病毒、肠道病毒和轮状病毒。1/19/20237常见标本的采集方法含漱液：用无菌生理盐水让患者含漱。用于分离流感病毒、副流感病毒、鼻病毒、RSV等。喉拭子：用压舌板避免唾液污染，用拭子采取咽喉部表面。用于分离腺病毒、CMV、肠道病毒、HSV、流感病毒等。尿道拭子及尿液标本：尿道拭子伸入尿道4cm转动3次，以获得较多的上皮细胞，用于分离CMV和HSV。尸检标本：死亡后尽早采集各种器官，分别使用器械和容器。1/19/20238标本的运送和保存病毒抵抗力弱，室温中容易灭活，用于分离培养的标本要尽快送检，4℃下数ｈ或-70℃。冻存液中加入甘油或二甲基亚砜(DMSO)等作保护。病毒传送培养基以Hanks液为基础加灭活的小牛血清。为抑制细菌生长加青霉素100U／ml和链霉素100μg／ml，为了抑制真菌的生长加入2．5μg／ml二性霉素B或40μg／ml制霉菌素。1/19/20239病毒感染检测（标本采集）：病毒感染的检测方法:（针对病原体，针对特异性免疫反应）细胞培养鉴定病毒直接观察检测病毒抗原检测病毒核酸中和检测IgM检测IgG4倍以上升高细胞因子检测1/19/202310特异性检测病毒（感染位点/血液）特异性检测抗病毒免疫（血液）病毒培养细胞分离培养原代细胞培养：由供体组织直接分离培养的细胞，称之为原代细胞。二倍体细胞株：仍保持二倍体特性。寿命一般为40～50代，如人胚肺细胞。广泛用于病毒分离和疫苗制备。传代细胞系：来于肿瘤细胞，染色体特征类似肿瘤细胞。常用的有人宫颈癌细胞(Hela)、人喉上皮癌细胞(Hep-2)。1/19/202311（常作为确证检测的第一步）常用于病毒分离的细胞1/19/202312鸡胚接种鸡胚是用于分离粘病毒科、疱疹病毒、痘类病毒的较为理想的材料。鸡胚对多种病毒敏感。一般采用孵化9～14天的鸡胚，根据病毒种类不同，将病毒标本接种于鸡胚的不同部位，最常用的鸡胚接种部位有：羊膜腔、尿囊腔、绒毛尿囊膜和卵黄囊等。动物接种动物对病毒的敏感性是不同的，选择合适动物十分重要。小鼠、乳鼠、家兔、豚鼠、猴等常用于分离病毒。1/19/202313细胞培养的结果观察细胞病变效应(CPE)：细胞肿大，变圆堆积成葡萄状，细胞溶解出现空斑，细胞融合形成多核巨细胞，胞浆内或核内出现嗜酸性或嗜碱性包涵体等；不出现细胞病变现象。（红细胞吸附）细胞培养液pH的变化。1/19/202314基于细胞培养的检测手段Transformation

lossofcontactinhibition1/19/202315CPE:Measles(风疹病毒)onhumanlungcarcinoma(A549)FieldsVriology(2007)5thedition,Knipe,DM&Howley,PM,eds,WoltersKluwer/LippincottWilliams&Wilkins,PhiladelphiaFig.2.51/19/202316CPE:vaccinia(痘病毒)UninfectedInfectedFieldsVriology(2007)5thedition,Knipe,DM&Howley,PM,eds,WoltersKluwer/LippincottWilliams&Wilkins,PhiladelphiaFig.2.51/19/202317RSV(呼吸道合胞病毒)-syncytia1/19/202318CPE:inclusionbodiesNegribodiesNegribodiesneuronImmunohistochemicalstainingofintra-cytoplasmicviralinclusionsintheneuronofahumanrabiespatient.(FieldsVriology(2007)5thedition,Knipe,DM&Howley,PM,eds,WoltersKluwer/LippincottWilliams&Wilkins,PhiladelphiaFig.39.9)1/19/202319红细胞吸附抑制试验正粘病毒，副粘病毒感染的宿主细胞，病毒增殖后产生细胞病变，但在细胞表面含有病毒某些抗原成分(血凝素)，能吸附鸡、豚鼠或猴红细胞。可作为初步鉴定。如果在培养瓶中加入相应的血凝素抗血清后，不出现红细胞吸附现象，是为红细胞吸附抑制试验阳性，可作为病毒鉴定的依据。1/19/202320红细胞吸附addredbloodcells1/19/202321Hemadsorptionoferythrocytestocellsinfectedwithinfluenzaviruses,mumpsvirus,parainfluenzaviruses,ortogaviruses.Thesevirusesexpressahemagglutininontheirsurfaces,whichbinderythrocytesofselectedanimalspecies.(FromMedicalMicrobiology,5thed.,Murray,Rosenthal&Pfaller,MosbyInc.,2005,Fig.51-5.)Hemadsorption1/19/202322Plaqueformation1/19/202323PlaqueFieldsVriology(2007)5thedition,Knipe,DM&Howley,PM,eds,WoltersKluwer/LippincottWilliams&Wilkins,PhiladelphiaFig.2.51/19/202324Plaqueformation1/19/2023251:1001:101:101:101:101:1010-210-310-410-510-610-7virusserialdilutionplate1mlplaques100101(1000)(100,000)(10,000)Titer=1x107pfu/mlPlaqueassay:method1/19/202326PlaqueassayTiter=1.2x108pfu/ml1/19/202327免疫荧光1/19/202328免疫荧光可以直接用来检测采集的标本中是否含有病毒抗原、细胞培养的病毒，或者用来检测血清中是否存在特异性抗体。细胞蛋白表达检测1/19/20232900h4h6h4h8h10h12h14h16h18h20h22h24h1/19/202330=infected=uninfectedEndpointtitrationFivereplicatewellsofcellsareinfectedwithonemlofeachoffourdifferentvirusdilutions,incubated,andscoredforinfectionbylookingforCPE.Inthisexample,thefinaltiteris106.3TCID50perml.(TCID=tissuecultureinfectivedose)10-510-610-710-85replicatesamplings12345dilution1/19/202331Endpointtitration1/19/202332106.35

TCID50perml病毒中和实验(特异性抗体检测)1/19/2023331/19/202334Hemagglutination(血凝检测)RBC1/19/202335Titer=32HAunits/mlHemagglutinationtest1:81:21:21:21:21:28163264128256virusserialdilutiontopviewmixwithredbloodcellssideview1/19/202336Hemagglutinationassay.Sevendifferentsamplesofinfluenzavirus,numbered1through7attheleft,wereseriallydilutedasindicatedatthetop,mixedwithchickenredbloodcells(RBC),andincubatedonicefor1to2hours.Wellsinthebottomrowcontainnovirus.AgglutinatedRBCscoatwellsevenly,incontrasttononagglutinatedcells,whichformadistinctbuttonatthebottomofthewell.TheHAtiter,shownattheright,isthelastdilutionthatshowscompletehemagglutinationactivity.(FromFieldsVriology(2007)5thedition,Knipe,DM&Howley,PM,eds,WoltersKluwer/LippincottWilliams&Wilkins,PhiladelphiaFig.2.9)Hemagglutinationassay:influenzavirus1/19/202337血凝抑制实验1/19/2023381/19/202339核酸类型鉴别及序列测定利用5—溴-2-脱氧尿苷(BUDR)抑制DNA复制的特性，在细胞培养液中加入该物质，可抑制DNA病毒的复制和增殖，抑制细胞病变的出现，但对RNA病毒无抑制作用，以此判断病毒核酸类型。对病毒核酸特异序列或全序列的碱基排列测定或DNA杂交、DNA-RNA杂交来鉴定病毒。1/19/202340耐酸试验肠道病毒对酸有耐受力，而鼻病毒在酸性环境下易被灭活。乙醚敏感试验病毒外围如有类脂包膜，则易被乙醚破坏，而失去感染性，不能感染细胞。可作为病毒是否具有类脂包膜的依据，也可用氯仿或去胆酸钠代替乙醚进行试验。1/19/2023412、电镜观察病毒的很多特征如大小、形态、结构等必须借助电子显微镜进行检查。对于目前尚难培养而形态又非常典型的病毒，可直接从感染组织或分泌液，或者接种病料的鸡胚和细胞培养收获的材料作电子显微镜检查，直接观察病毒粒子。1/19/202342鸡痘病毒（超薄切片）1/19/202343Adenovirus电镜负染1/19/202344腺病毒HumanRotavirus电镜负染1/19/202345轮状病毒Paramyxovirus(Parainfluenza)电镜负染1/19/202346副流感病毒1/19/202347免疫电镜1/19/202348通过测定病毒的特异标志成分，如特殊形态、特异的抗原成分及病毒的核酸，早期确认病毒的感染，是病毒学诊断的重大发展。——分子诊断3、快速诊断1/19/202349免疫检测核酸检测检测机体免疫反应检测病毒抗原检测病毒核酸检测特异性抗体检测病毒组成1/19/202350方法学A间接法Ab1Ab2B夹心法Ab2Ab1C捕获法D竞争法抗原标记物抗体支持介质免疫检测ELISA1/19/2023511/19/2023521/19/2023531/19/202354A、纳米微球胶体金彩色乳胶微球纳米磁性微球纳米荧光微球B、酶免纸条免疫检测进展－化学发光1/19/202355

所谓化学发光(CL),就是化学反应的能量把体系中共存的某种分子从基态激发到激发态从而产生发光的现象。化学发光反应能级图时间发光信号辉光坪区速率法测量原位进样积分法测量闪光尖峰闪光与辉光及其测量方式的差别酶促发光化学发光1/19/202356免疫检测进展－时间分辨荧光1/19/202357Antibodydetection:westernblot1/19/202358病毒感染检测：病毒感染的检测方法:（针对病原体，针对特异性免疫反应）细胞培养鉴定病毒直接观察检测病毒抗原检测病毒核酸中和检测IgM检测IgG4倍以上升高细胞因子检测1/19/202359特异性检测病毒特异性检测抗病毒免疫012345678910111213WeekResponseClinicalillnessALTIgMIgGHAVinstoolInfectionViremiaEVENTSINHEPATITISAVIRUSINFECTION核酸检测模板扩增－PCR、NASBA、TMA、HDA、SDA探针扩增－RCA、Expar信号扩增－Invader、杂交1/19/202361RealtimePCR1/19/2023625’3’5’3’SGExcitationSGSGSGSGEmissionSYBR-GreenI

PCR-probe1/19/2023635’3’5’3’SGSGSGSGSGExcitationEmission1/19/202364RQExcitationXRQQRExcitationEmissionMolecularBeacon1/19/2023651/19/202366Taqman1/19/202367Scorpionprimers5’3’5’3’5’3’5’3’3’RQ5’RQRQ3’5’QRRREmissionExcitationQRAmplifluorProbe1/19/202368Isothermal-NASBA1/19/202369Isothermal-TMA1/19/2023701/19/2023国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心福建省医学分子病毒学研究中心71Amplification1/19/2023国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心福建省医学分子病毒学研究中心72Detection(TMA)AE：吖啶酯InhighpHIsothermal-RCA1/19/202373Isothermal-HDA1/19/202374Isothermal-SDA1/19/202375Isothermal-Expar1/19/2023761/19/202377012345678910111213WeekResponseClinicalillnessALTIgMIgGHAVinstoolInfectionViremiaEVENTSINHEPATITISAVIRUSINFECTION病毒感染的特异性预防

主动免疫–疫苗被动免疫–免疫球蛋白1/19/202379HEV疫苗可预防的28种疾病Smallpox天花Rabies狂犬Cholera霍乱Typhoidfever伤寒Diphteria白喉Pert