基因工程的基本操作顺序

1、基因工程至少需要哪三种工具？2、这三种工具分别起什么作用？温故知新：1.2基因工程的基本操作程序

基因工程的基本操作程序主要包括哪几个步骤？1、目的基因的获取2、基因表达载体的构建3、将目的基因导入受体细胞4、目的基因的检测与鉴定问题1一：目的基因的获取

如苏云金芽孢杆菌的抗虫基因，还有植物的抗病（抗病毒、抗细菌）基因、种子贮藏蛋白的基因，以及人的胰岛素基因、干扰素基因等。

1.目的基因主要是指___________________编码蛋白质的基因什么是目的基因？2、也可以是具有调控作用的因子获取目的基因的常用方法有哪些?1、从基因文库获取目的基因2、利用PCR技术扩增目的基因3、人工合成目的基因已知序列未知序列(一)从基因文库中获取目的基因将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库1.基因文库概念2.基因文库类型基因组文库部分基因文库（包含一种生物的所有基因）（包含一种生物的一部分基因）基因组文库与部分基因文库的关系怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因呢?

根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物mRNA、基因的表达产物蛋白质等特性来获取目的基因。(一)从基因文库中获取目的基因3.基因组文库的构建提取某种生物的全部DNA用适当的限制酶一定大小的DNA片段将DNA片段与载体连接导入受体菌中储存基因组文库4.cDNA文库的构建提取某种生物的某器官或特定发育时期的mRNA单链DNA双链cDNA片段重组载体与载体连接cDNA文库反（逆）转录酶DNA聚合酶导入受体菌中储存反转录法：以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。cDNA合成过过程是：：第一步，，反转录录酶以RNA为为模板合合成一条条与RNA互补的DNA单单链，形形成RNA-DNA杂杂交分子子。第二步，，核酸酶酶H使RNA-DNA杂交分分子中的的RNA链降解，使使之变成成单链的的DNA。第三步，，以单链链DNA为模板板，在DNA聚聚合酶的的作用下下合成另另一条互互补的DNA链链，形成成双链DNA分分子。问题2为什么用用生物发发育某个个时期的的mRNA反转转录得的的DNA只有这这种生物物的部分分基因？？某个时期期的发育育是基因选择择性表达达的结果两种基因因文库的的主要区区别如下下表（课课本P10）文库类型cDNA文库基因组文库文库大小小大基因中启动子无有基因中内含子无有基因多少部分基因全部基因物种间的基因交流可以部分基因可以总结1、概念念：PCR全称称为________________，，是一项项在生物____复制制_____________的核核酸合成成技术3、条件件：2、原理理：__________多聚酶链链式反应应体外特定DNA片段DNA复制(二)利利用PCR技术扩增目的的基因模板（目的基基因）原料(脱氧核核苷酸)引物（一小段段单链DNA））DNA聚聚合酶（（耐高温温）温度控制制4、操作作前提：：一段已知知目的基基因的核核苷酸序序列，以以便合成成引物。。6、结果果。5、扩增增形式：：指数形式式（2n）在短时间间内大量量扩增目目的基因因7、过程程：a、变性性（90℃℃-95℃）：：双链DNA模模板在热热作用下，_____断裂裂，形成成___________b、复性性（55℃℃-60℃）：：系统温温度降低低，引物物与DNA模模板结合合，形成成局部________。c、延伸伸（70℃℃-75℃）：：在Taq酶的的作用下下，从引物开始始进行碱碱基互补补配对，，合成与与模板互补补的________。氢键单链DNA双链DNA链(二)利利用PCR技术术扩增目目的基因因动画演演示细胞内复复制.VS.PCR扩扩增DNA母母链4种脱氧氧核苷酸酸TaqDNA聚合酶酶引物（2个snDNA）温度控制制1）模板板：2）原料料：3）酶：：DNA母母链4种脱氧氧核苷酸酸解旋酶DNA聚聚合酶引物酶DNA连连接酶DNA增增殖4）特点点:半保留复复制边解旋边边复制(不用DNA连连接酶)半保留复复制全解旋再再复制（三）通通过DNA合成成仪直接接合成目目的基因因DNA合成仪推测推测合成前提：基因比较较小、核核苷酸序序列已知知蛋白质的的氨基酸酸顺序mRNA核苷酸酸序列基因DNA的核核苷酸序序列目的基因问题43、如果果不知道道目的基基因的核核苷酸序序列，可可采用_________________获取目的基因因的三种方法法应用1、如果知道道目的基因两两端的核苷酸酸序列，而且且基因比较大大，可采用____________2、如果知道道目的基因的的序列，而且且基因比较小小，可采用________________PCR技术扩扩增化学方法人工工合成从基因文库获获取的方法二：基因表达达载体的构建建——基因工工程的核心1目的：使目的基因在在受体细胞中中稳定存在，并且可以遗传给下一代代，同时使目的的基因能够表达和发挥作用。2组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因等启动子：位于基因的首端的一段特殊的的DNA片断断，RNA聚合酶酶识别和结合的的部位终止子：位于基因的尾端的一段特殊的的DNA片断断，能终止mRNA的转转录标记基因：鉴别受体细胞中是是否含有目的的基因，从而而将有目的基基因的细胞筛选出来3.基因表达达载体的构建建过程质粒DNA分子限制酶处理两个切口四个黏性末端端DNA连接酶酶重组DNA分分子（重组质质粒）同一种一个切口两个黏性末端端跟踪训练(2012年江苏无锡高高二检测)如图为基因表表达载体的模模式图，下列列有关基因工工程中载体的的说法错误的的是()A．基因工程程的核心步骤骤是基因表达达载体构建B．任何基因因表达载体的的构建都是一一样的，没有差差别C．图中启动动子位于基因因的首端，是是RNA聚合酶酶识别和结合合的部位D．抗生素抗抗性基因的作作用是作为标标记基因，用于于鉴别受体细细胞中是否导入了目的的基因B三、将目的基基因导入受体体细胞1转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。2常用的受体细胞：大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。3目的基因导入受体细胞的原理：借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。生物种类植物细胞动物细胞微生物细胞常用方法农杆菌转化法基因枪法花粉通道法显微注射法Ca2＋处理法受体细胞一般是体细胞受精卵一般原核细胞4、目的基因导导入受体细胞胞的方法为什么动物细细胞要用受精精卵做受体细细胞？全能性受限制制（1）农杆菌转化法法①农杆菌特点点：易感染双子叶植物和裸子植物物，对大大多数单子叶植物没有有感染能力。。②原理：Ti质粒上的T---DNA可以转移到受受体细胞，并并整合到受体体细胞染色体体的DNA上上。三、目的基因因导入受体细细胞构建基因表达达载体转入农杆菌植物细胞导入稳定维持和表表达③过程：（2）基因枪法：目的基因导入入单子叶植物物细胞①操作方法：：利用压缩气气体产生的动动力，将包包裹在金属粒粒表面的表达达载体DNA打入受体细细胞中，使目目的基因与其其整合并表达达的方法。②钨粉粒子和金金粉粒子，粒粒子的直径一一般在0.6～4um。。③适用：单子叶植物基因枪法（3）花粉管通道法法：将目的基因导导入植物细胞胞①操作方法：：在植物花受受粉后，花粉粉形成花粉管管还末愈合前前期，剪去柱柱头，然后，，滴入DNA（含的基因因）使目的基基因借助花粉粉管通道进入入受体细胞②特点:十分简简便经济。③例：转基因抗抗虫棉（我国国）（4）、将目目的基因导入入动物细胞方法：显微注射法目的基因表达达载体提纯取卵（受精卵）显微注射受精卵新新性状动动物（5）、将目目的基因导入入微生物细胞胞①微生物作受体体细胞原因：：繁殖快、多为为单细胞、遗遗传物质相对对少②常用菌：大大肠杆菌③常用法：Ca2+处理获得感受受态细胞（改变细胞壁壁的通透性））④过程：Ca2+处理大肠杆菌感受态细胞感受态细胞吸收DNA表达载体与感受态细胞混合从细胞器的功功能上分析，，若通过基因因工程生产人人的糖蛋白，，可以用大肠肠杆菌吗？【提示】不可以，糖蛋蛋白上的糖链链是在内质网网和高尔基体体上加工完成成的，而内质质网和高尔基基体存在于真真核细胞中，，大肠杆菌是是原核生物，，细胞中不含含有这两种细细胞器。问题3导入过程完成成后，全部受受体细胞都能能摄入入重组DNA分子吗？真正能摄入重重组DNA分分子的受体细细胞很少，且且有的会摄入入载体-载体体，目的基因因-目的基因因类型目的基因进入入受体细胞后后，是否都能能稳定维持和和表达？不一定，需要要检测问题4问题5练习采用基因工程程的方法培育育抗虫棉，下下列导入目的的基因的做法法正确的是()①将毒素蛋白白注射到棉受受精卵中②将将编码毒素蛋蛋白的DNA序列，注射射到棉受精卵卵中③将编码码毒素蛋白的的DNA序列列，与质粒重重组，导人细细菌，用该细细菌感染棉的的体细胞，再再进行组织培培养④将编码码毒素蛋白的的DNA序列列，与细菌质质粒重组，注注射到棉的子子房并进入受受精卵A、①②B、②③C、③④D、①④C——检查是否否成功分子水平个体水平：①检测转基因因生物染色体体的DNA上是否插入了了目的基因②检测目的基基因是否转录录出了mRNA③检测目的基基因是否翻译译成蛋白质抗虫鉴定、抗抗病鉴定、活活性鉴定等方法——方法——方法——DNA分子杂杂交分子杂交抗原抗体杂交交四、目的基因因的检测与鉴鉴定转基因生物的DNA探针15N15N14N14N（1）检测转转基因生物物染色体的的DNA上上是否插入入了目的基因基因探针：：放射性同位位素等标记记的含有目目的基因DNA片段段方法——DNA分子子杂交技术术变性变性变性方法——分子杂交技技术（2）检测测目的