HCG检测溯源问题

人绒毛膜促性腺激素检测溯源问题刘奉亭青岛兰信医学检验所，青岛266100摘要目的：探讨HCG检测的溯源性及实验间检验结果互相认可中存在的问题。方法：结合国际国内HCG检测现状，对有关HCG检测的影响因素及国际标准物质方面的问题进行综述。结果：HCG分子及其裂解产物种类繁多，抗原性相似又不完全相同，不同厂家试剂使用的抗体组合不同，对HCG类分子的识别不同。一些试剂的标签不正确或不清楚，一些实验人员对HCG检验的分子种类不清楚，国内HCG收费项目不全，是导致有意无意错报检验项目的原因。目前发布的HCG国际标准物质含有杂质，并且对于无活性的a亚基和B亚基赋值错误。这些都给HCG检测结果的实验室间互相认可带来困难。结论：HCG检测的溯源及检验结果的实验室间互相认可尚存在许多问题。要解决这些问题，需要新的、以摩尔浓度赋值的HCG国际标准的发布，各试剂厂商以新的国际标准物质作为抗原来制备抗体，并用新的抗体制备的HCG检测试剂溯源到新的国际标准。另外，还要进一步普及有关HCG类分子及其裂解产物的知识宣传。血清人绒毛膜促性腺激素（HCG）的测定对于妊娠的确认和监测，异位妊娠及其治疗的监测，产前筛查，先兆流产、滋养层疾病、非滋养层肿瘤、生殖细胞瘤、膀胱癌、睾丸癌、肺癌等的诊断和治疗效果的监测具有十分重要的意义if。人绒毛膜促性腺激素（HCG）与促黄体生成激素（LH）、促卵泡激素（FSH）及促甲状腺激素（TSH）都是由一个a亚基和一个B亚基所组成⑻9］。这些激素都拥有共同的a亚基，它们的区别在B亚基［1。］。HCG的B亚基与FSH、TSH不同，但与LH的B亚基类似，LH的B亚基含有121个氨基酸，而HCG的B亚基含有145个氨基酸，在LH的B亚基的C末端延伸了24个氨基酸［11］。早期，人们采用生物学方法进行妊娠实验，将尿液注入幼鼠等动物，通过观察动物的反应而判断是否怀孕。1960年Wide和Gemzell建立了首个妊娠实验的免疫学方法一一红细胞凝集法［12］。由于当时使用的是抗HCG血清，测定HCG时会受到LH、FSH和TSH等激素的干扰。1972年Vaitukaitis等使用抗HCGB亚基血清，建立了B-HCG的放射免疫测定法［13］。由于HCGB亚基与其它激素B亚基的区别，该测定方法与生理浓度的LH、FSH和TSH没有显著的交叉反应，可更为准确地反映标本中的HCG含量。随着免疫检测方法学的不断改进，目前大多数医学检验机构基本都使用（电）化学发光法对HCG进行全自动的检测。HCG及其衍生物有很多种，来源与生理学功能各不相同。有常规HCGW16］、高度糖基化的HCGW16］、硫酸化的HCG［17,18］、游离a亚基［19,20］、高度糖基化的游离a亚基［19,20］、游离B亚基［21］、高度糖基化的游离B亚基［22-26］。在激素的产生、分泌、代谢等过程中，HCG分子会发生断裂、解离等多种变化，从而在血、尿中以多种分子形式存在。目前已经发现有15种形式的HCGw（图1）。所有的HCG类检测试剂的定标品都使用可溯源至WHO的HCG标准。最早的WHO国际标准品（1938年和1964年）是HCG的粗制品。1978年这些国际标准品被高度纯化的HCG制品一第一批国际参考制品所取代。这一标准品于1986作为第三批国际标准品、1999年作为第四批国际标准品发布。当今，所有的HCG类检测试剂的定标品都可溯源至第三批或第四批国际标准品。由于这些标准品是从商品的孕妇尿液的粗提取物纯化而来磔?］。而这些尿液都是在没有温度控制的条件下收集和储存的，存在着HCG分子的解离和断裂，纯度也存在一定的问题。HCG测试方法使用的抗体也是针对这些尿液粗提取物纯化的HCG及其亚基的［30］抗体。为解决HCG国际标准品不纯等问题，2003-2005年WHO的IFCC工作组从人尿中纯化了完整HCG、缺刻HCG、HCGB亚基、缺刻HCGB亚基、HCGa亚基、HCG6核心部分等6种形式的HCG,制备了6种国际参考物质（InternationalReferenceReagents）⑶1，分装、冻干并以mol/L定值初。这些新制备的国际参考物质比第三批、第四批HCG国际标准品的纯度有了很大的提高。2009年，Sturgeons等调查了使用不同的测定方法对这6种参考物质的测定结果,发现不同HCG测定方法在识别不同形式的HCG时有非常大的差异.他们调查的16种测试方法中，4种仅识别HCG,6种识别HCG及游离B亚基，6种识别HCG、HCGB和6核心部分。他们认为这些差异是导致测定HCG时，不同方法间差异的主要原因。Cao和Rej［34］将完整的HCG和游离B-HCG单一或组合加入到的无HCG血清基质中，制备出了含完整HCG、含hCGB和含完整HCG+hCGB的三种标本，连夜用冰块降温的方式分发到各个实验室。各实验室的检测结果（表1）表

明，各种免疫学检验方法对完整HCG的识别尚可，对HCGB的识别存在很大差异，有一些试剂无法识别HCGB而导致测试结果接近于零。在对HCG+HCGB的测定Nickedhyp&rglyoosylatedhCGNickedregularHCGhCGFreeG-subunttmissingfiCTFOOOOOO0047/48NN47/4FNN47/48N47748NNickedhyperglycosylatedhCGmi骷府UCTPHypenglyecsytatedhGGfreeIS1450000Nickedhyp&rglyoosylatedhCGNickedregularHCGhCGFreeG-subunttmissingfiCTFOOOOOO0047/48NN47/4FNN47/48N47748NNickedhyperglycosylatedhCGmi骷府UCTPHypenglyecsytatedhGGfreeINickedhCGfreeB145^7/48NNickedhyperglycosylatedhCGfree值1450000000047/48NNNtckedhCGfreeG-sutiunilnrtissingfiCTP92RegularhCG145H/penglycosylaledhCGNichedregularhCG145NickedhyperglycosylatedhCGfreeilmissingfLCTF92l^-subunitcorefragment92Freeu-subunitO-glycosylatedfre&i^subunit47/4BNN0o47/40NNNOO图1、妊娠及恶性疾病患者血清和尿中的15种HCG形式的结构图数字为氨基酸编号，O代表与O联接的寡糖，N代表与N联接的寡糖，OO和NN代表大的即高度糖基化寡糖。a是a亚基，0是0亚基。0CTP是常规的或超糖基化的B亚基的C末端片段（93-145氨基酸残基）。时，总BHCG测定的结果略高于完整HCG的测定结果。这可能是由于HCG试剂对HCGB识别不好，也可能是总BHCG试剂中的多种抗体对其中HCG的重复识别造成的。表1、多家实验室采用不同方法对三种HCG标本测定的结果标本实验室数试剂家数检测项目E03E04E05总BHCG33.3-53.9<1-49.640-8323512完整HCG34-53.31-5035-77.2617注：E03含完整HCG约45IU/L,E04含hCGB约30IU/L,E05含完整HCG约40IU/L,hCGB约20IU/L。现行的HCG国际标准物质最初是为生物学方法而非免疫学方法制订的，对于第三和第四批HCG及其亚基国际标准物质（IS）来说，70HCG约相当于650IU。对于没有活性的a和B亚基，则人为给定单位，国际参考物质中每相当于一个国际单位M（表2）。这使得HCG及其亚基的单位并不等当。同样的抗原抗体结合，反映在活性单位上，最大差别可达24倍（345/14）。另外，多种形式的HCG不同程度地与各种HCG抗体结合，都会给HCG的测定带来一定的影响。表2.第三批HCG及其亚基国际标准各种单位的比较缩写分子量Rg/IUIU/nmolHCG375000.11345HCGB23500123.5HCGa14000114目前，关于HCG类的测定的收费项目山东省只有HCG和特异B-HCG两项即,特异B-HCG的收费远远高于HCG。市面上测定HCG的试剂主要有HCG、HCG+HCGB、总B-HCG、游离B-HCG等，并没有什么特异B-HCG。由于厂家标签的不清楚和概念混淆，加上一些HCG检测种类没有收费标准，目前许多医院都把模棱两可的HCG检测项目按照特异B-HCG来报告。这就使得各医疗检测机构测定的特异B-HCG不具有可比性。抗原抗体的结合应该以结合位点（mol）来计量，人为给定不等当的IU单位必将给测定结果带来巨大的影响。由于生产厂商使用的抗体组成的特异性的差异及标准物质人为给定单位等原因，使用不同厂家试剂进行测定的结果会出现非常大的差异。例如采用罗氏公司HCG+B试剂和强生公司的总B-HCG试剂所进行的检测，山东省内一般都报作特异B-HCG,其参考值在妊娠初期有着非常大的差别［36,37］（表3）。如果在进行妊娠监测或在一些疾病的治疗效果监测时分别使用了这两种不同的试剂，将可能会导致非常严重的错误结论。表3.强生总BHCG、罗氏HCG+B参考值比较强生罗氏孕周平均值范围中位数范围（5-95%）4505844700-132800111040-44805515173660-1340008050270-2870067267122600-135000297003700-8490078794344800-148600588009700-120000810348652600-1918007950031100-184000910378357400-1960009150061200-152000108825051000-1894007100022000-143000综上所述，HCG测定的溯源及检验结果的实验室间互相认可还存在许多问题。HCG与LH、FSH、TSH等具有相同的a亚基，与LH具有类似的B亚基；HCG具有众多的变异体。HCG及其变异体具有广泛而不同的功能,对于HCG及其变异体的测定具有众多的临床应用。现行的HCG国际标准品存在部分裂解和杂质，且在无活性亚基的赋值方面存在问题。由于厂家标签不清楚、检验人员知识不足、收费项目名称等原因错报HCG类检验项目的事情经常发生。由于抗体特异性等问题，不同厂家的试剂测定HCG类物质的结果差异很大。如果新的HCG国际参考物质作为以摩尔浓度定标的国际标准品发布以后，各试剂厂商以此标准品免疫动物制备相应的HCG抗体，并以此抗体生产相应的HCG检测试剂，同时使试剂的标准品溯源至新的国际标准品以后，将会在某种程度上降低不同厂家试剂间的差异。当然，要进一步改善HCG检测的不同实验室间互相认可，还要普及HCG类物质方面知识的宣传。参考文献1、Ulf-HkanStenmanl,AilaTiitinen,HenrikAlfthanlandLeenaValmul.Theclassification,functionsandclinicaluseofdifferentisoformsofHCG.HumanReproductionUpdate,Vol.12,No.6pp.769-784,2006。2、李贵容，王弓力.hCG在异位妊娠诊断和治疗中的价值［J］实用妇科与产科杂志，1989,（5）3、叶国玲，廖世秀，赵晓岚等.妊娠中期联合检测母血清AFP、B—HCG和uE_3筛查胎儿异常的可能性［J］西安医科大学学报（中文版），1995,（4）4、吴国振，钟园园，吴花葵.507例先兆流产B—HCGRIA检测结果分析[J]现代诊断与治疗，1995,(4)5、MoraJ,GasconN,TaberneroJM,etalDifferenthCGassaystomeasureectopichCGsecretioninbladdercarcinomapatients.BrJCancer.1996Oct;74(7):1081-4.6、RaghavanD,PeckhamMJ,HeydermanE,PrognosticfactorsinclinicalstageInon-seminomatousgerm-celltumoursofthetestis.BrJCancer.1982Feb;45(2):167-73.BurtRW,RatcliffeJG,StackBH,etalSerumbiochemicalmarkersinlungcancer.BrJCancer.1978May;37(5):714-717.8、Morgan,F,Canfield,RC,NatureoftheSubunitsofHumanChorionicGonadotropin.Endocrinology,1971,88(4):1045-1053,9、HertzR,OdellWDandRossGT,Diagnosticimplicationsofprimaryamenorrhea.AnnInternMed.1966,65(4):800-820.10、PierceJG,BahlOP,CornellJS,etalBiologicallyactivehormonespreparedbyrecombinationofthealphachainofhumanchorionicgonadotropinandthehormone-specificchainofbovinethyrotropinorofbovineluteinizinghormone.JBiolChem.1971,246(7):2321-2324.11、PierceJG,ParsonsTF(1981)Glycoproteinhormones:structureandfunction.AnnuRevBiochem50:465-495.WideL,GemzellCAAnimmunologicalpregnancytest.ActaEndocrinol(Copenh)1960,35:261-267VaitukaitisJL,BraunsteinGDandRossGTAradioimmunoassaywhichspecificallymeasureshumanchorionicgonadotropininthepresenceofhumanluteinizinghormone.AmericanJournalofObstetricsandGynecology,1972,113:751-758.14、HoshinaM,BoimeI,MochizukiM.CytologicallocalizationofhPL,hCG,andmRNAinchorionictissueusinginsituhybridization.ActaObstetGynaecolJaponica.1984;36:397-404.15、HandschuhK,GuibourdencheJ,TsatsarisV,etalHumanchorionicgonadotropinproducedbytheinvasivetrophoblastbutnotthevilloustrophoblastpromotescellinvasionandisdown-regulatedbyperoxisomeproliferator-activatedreceptor-a.Endocrinol.2007;148:5011-5019.doi:10.1210/en.2007-0286.KovalevskayaG,GenbacevO,FisherSJ,etalTrophoblastoriginofhCGisoforms:cytotrophoblastsaretheprimarysourceofchoriocarcinoma-likehCG.MolCellularEndocrinol.2002;194:147-155.17、ColeLA,LadnerDG.BackgroundhCGinNon-PregnantIndividuals:NeedforMoreSensitivePoint-of-CareandOver-the-CounterPregnancyTests.ClinBiochem.2009;42:168-175.18、ColeLA.In:Humanchorionicgonadotropin(hCG)ColeLA,editor.Elsevier,Oxford;2010.BackgroundhCG.19、BlitheDL,NisulaBC.Variationsintheoligosaccharidesonfreeandcombinedalpha-subunitsofhumanchoriogo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