植物体细胞杂交的选择和鉴定-高二下学期生物人教版选择性必修三

植物体细胞杂交的选择和鉴定2020版《课程标准》确实有一条目“概述植物体细胞杂交是将不同植物体细胞在一定条件下融合成杂合细胞，继而培育成新植物体的技术”。2019版高中生物学选择性必修三介绍了植物体细胞杂交的过程及成果：那么，植物体细胞杂交过程如何选择和鉴定？植物体细胞杂交包括原生质体融合和体细胞杂种选择系统。1.原生质体融合方法原生质体融合方法有化学融合法和电融合法。化学融合法根据所用化学试剂的不同，分为硝酸钠融合法、高pH-高浓度钙离子融合法和PEG融合法。其中，PEG融合法由于融合效率高、无种特异性等优点得到广泛应用。电融合法效率高、对原生质体伤害小、融合细胞数易于控制。PEG融合法的机理：PEG分子具有轻微负极性，可与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成氢键。当PEG分子链足够长时，他在相邻原生质体表面之间，起分子桥作用引发原生质体黏连。PEG还具有改变膜物理化学性质及增加类脂膜流动性的作用，从而促进细胞融合。PEG融合法的方法：用原生质体培养基调整双亲原生质体的密度，按1:1比例混合；将原生质体混合液移入培养皿中，用滴管缓慢滴加含PEG的混合液；加原生质体培养基离心去上清液，将沉淀物用原生质体培养基重复洗涤两次后进行培养。2.体细胞杂种选择系统原生质体融合处理后，混合液中含有未融合原生质体、同核体、异核体等。必须建立一些有效选择体系，从各类型细胞中筛选出杂种细胞，使其在适宜培养基和培养条件下生长、分裂、分化和再生。还需要对杂种植株进一步鉴定，因为在细胞分裂和分化过程中，杂种细胞的染色体常发生复杂变化。（1）杂种细胞选择体细胞杂种选择系统由互补选择法和机械选择法。互补选择法又根据双亲互补性状的不同可以分为营养代谢互补选择法、抗性突变体互补选择法和叶绿素缺失突变体互补选择法。互补选择法：营养代谢互补选择法原理：杂种细胞具有杂种优势，对培养基适应能力较强。未融合细胞或自体融合的细胞表现的生活力较弱，分化慢，难以再生植株。抗性突变体互补选择法原理：杂种细胞的选择是以其对某种逆境具有抗性（必须为显性）基础上进行的。选择培养基为施加某种逆境条件的培养基。例如，在大豆和水稻融合细胞筛选时，利用水稻原生质体耐高温（37℃）的特性，将水稻与大豆原生质体融合细胞培养在适合大豆原生质体生长的培养基，但培养温度为37℃。叶绿素缺失突变体原理：杂种细胞的选择是基于融合细胞具有正常叶绿素并在特定培养基上生长的基础上进行的。选择培养基为适合白化和杂种细胞增殖的培养基。白化亲本原生质体和杂种原生质体能形成愈伤组织。机械选择法：利用融合细胞所具有的可见标记，在倒置显微镜下，用微管将融合细胞吸取出来进行选择的方法。常用的可见标记是叶肉细胞的绿色。（2）杂种植株鉴定杂种细胞筛选仅为体细胞杂种真实性的间接证据，需要对所获得的杂种植株作进一步鉴定。因为体细胞杂种在融合及杂种植株再生过程中常常发生遗传变异，表现在细胞分裂和染色体的数目的不稳定性及杂种植株的不育性。杂种植株鉴定的方法有形态学鉴定、细胞学鉴定、同功酶鉴定和DNA分子标记鉴定。其中，鉴定杂种植株最有效的方法DNA分子标记鉴定。DNA分子标记鉴定是在DNA水平上对亲本和杂种植株遗传差异进行鉴定的一种技术。DNA分子标记鉴定技术能准确鉴定出生物个体间核苷酸序列间的差异，甚至是单个核苷酸的变异，成为鉴定杂种植株最有效的方法。已发展出十几种DNA标记技术，如RFLP、RAPD、AFLP等，它们各具特色，为不同的研究目标提供了丰富的技术手段。RAPD技术1990年发明并发展起来的，RAPD是建立在PCR基础之上的一种可对整个序列的基因组进行分析的分子技术。其以DNA为模板，以单个人工合成的核苷酸序列为引物，进行PCR扩增。扩增产物经琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、亚甲基蓝染色后，在紫外透视仪上检测。它的应用是基于这样的一个推理：对于不同的模板DNA，用同一引物扩增既可能得到相同的带谱（模板基因组间可能具有同源性），也可能得到不同的带谱。仅在某一特定模板中出现的条带就可作为该模板的分子标记。事实上，不同基因组DNA总是具有一定差异的，所以用RAPD就可以进行分子标记研究。理论上讲，在一定的扩增条件下，扩增的条带数取决于基因组的复杂性。对特定的引物，复杂性越高的基因组所产生的扩增条带数也越多。例、甲植物细胞核基因具有耐盐碱效应，乙植物细胞质基因具有高产效应。某研究小组用甲、乙两种植物细胞进行体细胞杂交相关研究。基本过程包括获取原生质体、诱导原生质体融合、筛选融合细胞、杂种植株再生和鉴定，最终获得高产耐盐碱再生植株。回答下列问题：（1）根据研究目标，在甲、乙两种植物细胞进行体细胞杂交前，应检验两种植物的原生质体是否具备

的能力。为了便于观察细胞融合的状况，通常用不同颜色的原生质体进行融合，若甲植物原生质体采用幼苗的根为外植体，则乙植物可用幼苗的

为外植体。（2）植物细胞壁的主要成分为

和果胶。在获取原生质体时，常采用相应的酶进行去壁处理。在原生质体融合前，需要对原生质体进行处理，分别是甲原生质体和乙原生质体的

失活。对处理后的原生质体在显微镜下用

计数确定原生质体密度。两种原生质体1︰1混合后，通过添加适宜浓度的PEG进行融合；一定时间后，加入过量的培养基进行稀释，稀释的目的是

。（3）将融合原生质体。悬浮液和液态的琼脂糖混合，在凝固前倒入培养皿，融合原生质体分散固定在平板上，并独立生长、分裂，形成愈伤组织。同一块愈伤组织所有细胞源于

。下列各项中能说明这些愈伤组织只能来自于杂种细胞的理由是哪几项？

（A.甲乙原生质体经处理失活，无法正常生长、分裂

B.同种融合的原生质体因甲或乙原生质体失活而不能生长、分裂

C.培养基含有抑制物质，只有杂种细胞才能正常生长、分裂

D.杂种细胞由于结构和功能完整可以生长、分裂）（4）愈伤组织经

可形成胚状体或芽。胚状体能长出

，直接发育形成再生植株。（5）用PCR技术鉴定再生植株。已知甲植物细胞核具有特异性DNA序列a，乙植物细胞质具有特异性DNA序列b；M1、M2为序列a的特异性引物，N1、N2为序列b的特异性引物。完善实验思路：Ⅰ.提取纯化再生植株的总DNA，作为PCR扩增的

。Ⅱ.将DNA提取物加入PCR反应体系，

为特异性引物，扩增序列a；用同样的方法扩增序列b。Ⅲ.得到的2个PCR扩增产物

后。若每个PCR扩增产物在凝胶中均出现了预期的

个条带，则可初步确定再生植株来自于杂种细胞。答案：（1）再生植株

叶片（2）纤维素

细胞质、细胞核

血细胞计数板

终止原生质体融合（3）一个融合原生质体

ABD

（4）再分化

根和芽（5）模板

M1、M2

电泳

1解析：该试题考查植物体细胞杂交和基因工程过程。（1）根据研究目标需要得到再生植株，因此在甲、乙两种植物细胞进行体细胞杂交前，应检验两种植物的原生质体是否具备再生植株的能力。为了便于观察细胞融合的状况，通常用不同颜色的原生质体进行融合，若甲植物原生质体采用幼苗的根为外植体，则乙植物可用幼苗的叶片为外植体。（2）植物细胞壁的主要成分为纤维素和果胶。根据题意，即植物细胞核基因具有耐盐碱效应，乙植物细胞质基因具有高产效应，故在原生质体融合前，需要对原生质体进行处理，分别是甲原生质体和乙原生质体的细胞质、细胞核失活。对处理后的原生质体在显微镜下用血细胞计数板计数确定原生质体密度。两种原生质体1︰1混合后，通过添加适宜浓度的PEG进行融合；一定时间后，原生质体融合完成，加入过量的培养基进行稀释，稀释的目的降低PEG的浓度，从而终止原生质体融合，也可以通过降低培养基的浓度促进原生质体产生细胞壁，从而使融合细胞分裂。当然，也可以通过离心去融合液，分离得到沉淀物原生质体，再进行培养。（3）通过一定的方法将融合原生质体分散固定在平板上，并独立生长、分裂，形成愈伤组织。同一块愈伤组织所有细胞源于一个融合原生质体。这些愈伤组织只能来自于杂种细胞的理由可能是甲乙原生质体经处理失活，无法正常生长、分裂；同种融合的原生质体因甲或乙原生质体失活而不能生长、分裂；杂种细胞由于结构和功能完整可以生长、分裂。（4）根据植物的组织培养技术，由愈伤组织再分化形成完整植株一般有两种途径，即愈伤组织经再分化可形成胚状体（胚的发生途径）或芽（器官发生途径）。胚状体能长出根和芽，直接发育形成再生植株或芽在另一培养基上长出根。（5）最后还需要对杂种植株进行鉴定，因为在细胞分裂分化过程中，杂种细胞遗传物质会发生复杂的变化。杂种植株的鉴定方法有多种，如形态学鉴定、细胞学鉴定、同功酶鉴定和DNA分子标记鉴定。1990年发明的RAP技术就是建立在PCR基础之上的一种可对整个序列的基因组进行分析的分子技术。用PCR技术鉴定再生植株的方法是，提取纯化再生植株的总DNA，作为PCR扩增的模板；将DNA提取物加入PCR反应体系，M1、M2为特异性引物，扩增序列a，用同样的方法扩增序列b；得到的2个PCR扩增产物电泳后。若每个PCR扩增产