人外周血淋巴细胞彗星试验检测水体遗传毒性的

人外周血淋巴细胞彗星试验检测水体遗传毒性的研究摘要：应用人外周血淋巴细胞彗星试验对无锡充山水厂、中桥水厂，常州西石桥水厂进出水及金坛市拟用水源地长荡湖湖心水样的遗传毒性进行了研究。结果表明各水样的有机浓集物均可对人外周血淋巴细胞DNA产生不同程度的损伤，存在一定的遗传毒性。试验结果与各水样水质污染状况基本一致。同时，季节变化以及常规水处理过程对水样的遗传毒性有影响。研究表明彗星试验可有效地用于检测水体有机浓集物遗传毒性。关键词：饮用水，遗传毒性，人外周血淋巴细胞，彗星试验GenotoxicityevaluationofwaterinhumanperipheralbloodlymphocytesusingthecometassayAbstract:Thegenotoxicpotentialsoforganicpollutantsinsourceandtapwatersamplesofthreewaterworks（i.e.,Chongshan,ZhongqiaoandXishiqiao）andwatersampleofChangdangLakewereevaluatedwiththecometassay.TheresultsshowedthatDNAdamagesinhumanperipheralbloodlymphocyteswereinducedafterexposuretotheorganicextractsfromallwatersamplesandthegenetichazardexisted.Theconcordancebetweentheresultsofthecometassayandthepollutionconditionsofthewatersourceswasdisplayedwell.Moreover,theresultsindicatedthealternateseasonsandthewatertreatmentprocesscouldaffectthequalityofwater.Theresultsofthisstudydemonstratethatthecometassaycanbesuccessfullyappliedtothegenotoxicitymonitoringprogramofthewater.Keywords:drinkingwater，genotoxicity，humanperipheralbloodlymphocyte，cometassay饮用水与人体健康直接相关。自从70年代初美国环保局首次在水中发现氯的衍生物以来，水中有机物对人体健康的影响已日益引起人们关注。据1995年的数据，全世界已在水中测出有机化合物2221种，其中许多具有致癌、致畸和致突变作用。国内也有相关的报道，研究发现黄浦江水中有机物达700种，而用GC／MS法测得第二松花江吉林江段水中有机物317种，其中不乏致癌、致突变物[1]。因此，有研究认为，对人体健康和人口素质的影响而言，水源中是否含有遗传毒性的物质，应该是估价水源水质的主要指标[2]。由于此类有机物大都呈现低剂量长期暴露的特点，常规的理化分析不足以对水质状况作全面的评价，所以建立一种有效的测试方法评价水中有机物的遗传毒性是环境监测工作中的一项重要任务。对于水体有机物污染的遗传毒性评估，一般都采用体外短期生物测试系统进行，如Ames试验、微核试验、V79细胞致突变试验等。近年来，彗星试验由于其快速、敏感、可靠等诸多优点正越来越多地在这方面得到广泛的应用[3]。本文采用人外周血淋巴细胞彗星试验，对无锡充山水厂、中桥水厂，常州西石桥水厂进出水及金坛市拟用水源地长荡湖湖心水样的遗传毒性进行了研究。1材料和方法1.1试验材料健康人外周肝素抗凝全血，采自南京市中心血库。1.2水样的采集与处理于2003年4月采集无锡充山水厂、中桥水厂进出水，2003年7月和12月分别采集常州西石桥水厂进出水及长荡湖湖心水样。其中，无锡充山水厂、中桥水厂水源地位于太湖梅梁湾，常州西石桥水厂水源地为长江，长荡湖为常州金坛市拟用水源地。各采样点采样量均为20L。水样静置24hr，过滤去除悬浮颗粒，通过XAD-2树脂吸附柱富集，控制流速在30-40mL/min，N2排除水分，以甲醇、丙酮、二氯甲烷洗脱，洗脱液用氮吹仪在50℃条件下浓缩，吹干，再用二甲基亚砜（DMSO）溶解，定容至2.0mL，避光保存于-18℃冰箱中备用。1.3人外周血淋巴细胞的分离与染毒将新鲜肝素抗凝血按血量1/3加入3％的新配明胶溶液于离心管内混匀，立即垂直置于37℃恒温水浴，自然沉降约30min。吸取淡黄色淋巴细胞层0.2mL于事先装有0.8mLPBS缓冲液的微量离心管中，3000rpm离心3min，弃去上清，加入0.9mLPBS及0.1mL水样浓集物，37℃避光染毒1hr。每个水样设三个剂量（即相当于原水样20mL、100mL、500mL/管）。染毒后3000rpm离心3min，弃上清，沉积细胞置4℃冰箱中备用。同时作DMSO溶剂对照。用苔盼蓝染色观察细胞存活率。1.4彗星试验彗星试验方法参照Singh报道[4]。铺好胶层的玻片在冷细胞裂解液裂解1hr后，在碱性电泳液（pH＝13.0）静置，解旋30min。调节电压为25V，电流为100mA，电泳1hr。以上各步骤应在红光或黄光下进行，以免产生额外的DNA损伤。电泳后，经中性缓冲液中和，在24hr内，每张玻片以50µL溴乙锭（EB）染色，荧光显微镜下观察，进行显微摄影。3.2.3结果评价及统计分析采用彗星图像分析软件CometAssaySoftwareProject(CASP)，以彗尾DNA含量（TailDNA%，TD），彗尾长（TailLength，TL）以及Olive尾矩（OliveTailMoment，OTM，即彗尾DNA含量×彗星头尾部密度重心间距离）等三个评价参数对DNA损伤进行定量分析。每玻片至少分析50个细胞。根据数据的分布特征和方差，以Mann–WhitneyU检验比较各剂量组与溶剂对照间的损伤差异。考虑到高剂量的染毒可能造成DNA的严重损伤，而使大量的DNA游离断片在电泳过程中丢失而引起可测DNA损伤的降低[5]，而剂量过低可能使组间差异难以充分表现，所以本文以100mL/管这一剂量对各水样间的遗传毒性进行多重比较。由于OTM同时反映了彗尾中DNA含量和彗尾形状特征，所以组间的多重比较以OTM为指标，采用Krushal–WallisH检验法，显著性水平设为0.05。2结果与分析 典型彗星图像如图1、2所示。无锡充山水厂、中桥水厂进出水，常州西石桥水厂进出水及长荡湖湖心水样有机浓集物对人外周血淋巴细胞DNA损伤的结果分别见表1和表2。苔盼蓝染色法的结果表明，各水样不同剂量组染毒前后细胞存活率均>90％，所以引起DNA损伤的主要为遗传毒性，而非细胞毒性。从表1中可以看出，与溶剂对照相比，除充山水厂和中桥水厂出水的低剂量组（20mL/管）在TD这一指标上无统计差异外，其它各水样浓集物均有极显著差异(P<0.01)，且随着剂量的加大，受损的程度也加重。以OTM为评价指标，在100mL/管这一剂量进行比较发现各水样间无统计学差异（P>0.05）。图1DMSO溶剂对照组人外周血淋巴彗图1DMSO溶剂对照组人外周血淋巴彗星图像（×400）Fig.1Cometfigureofhumanperipheralbloodlymphocytestreatedwithsolventcontrol(DMSO)（×400）图2充山水厂出水有机浓集物500mL/管剂量组人外周血淋巴彗星图像（×400）Fig.2Cometfigureofhumanperipheralbloodlymphocytestreatedwiththeorganicextracts(500mL/tube)fromtapwaterofChongshanWaterwork（×400）表1无锡充山水厂、中桥水厂进出水（2003.4）有机浓集物对人淋巴细胞DNA的损伤Table1DNAdamagesinhumanperipheralbloodlymphocytesexposedtoorganicextractsfromsourceandtapwaterofChongshan,Zhongqiaowaterworks(2003.4)水样染毒剂量（ml/L）TailDNAA（％）Taillenngth（μm）OliveTaailMooment充山水厂进水208.65±0.662**11.51±0..76**1.34±0.112**10014.63±1..10**18.35±1..33**3.19±0.440**50028.23±1..68**35.43±2..70**8.32±1.112**充山水厂出水207.93±0.66810.31±0..87**1.25±0.114**10013.60±0..81**15.36±0..90**2.19±0.117**50022.23±1..61**26.01±2..04**5.41±0.6691**中桥水厂进水208.58±0.448**10.25±0..55**1.27±0.111**10013.21±1..07**19.54±1..24**2.76±0.331**50028.47±3..15**25.26±2..86**5.56±0.770**中桥水厂出水207.62±0.88510.79±1..20**1.45±0.226**10012.63±1..535***13.95±1..20**2.06±0.330**50018.05±1..03**17.74±1..13**3.24±0.332**溶剂对照06.65±0.3397.81±0.4400.86±0.006注：1.数据均以mmean±SS.E.M表示;2.**:P<<0.01。从表2中可以看出，与溶剂对照相比，除7月西石桥进水和12月长荡湖湖心水样的低剂量组（20mL/管）在TD这一指标上无统计差异外，其它各水样浓集物均有显著或极显著差异(P<0.05，P<0.01)，且随着剂量的加大，受损的程度也加重。同时，多重比较的结果表明，7月份对人血淋巴细胞DNA损伤程度大小顺序为长荡湖湖心水样、西石桥水厂出水>西石桥水厂进水，12月份长荡湖湖心水样>西石桥水厂进水>西石桥水厂出水（P<0.05）。同时，比较两次不同时间的水样可知，季节变化变化对水质影响显著，其中7月份西石桥水厂进水对人血淋巴细胞DNA损伤程度极显著（P<0.01）小于12月份进水，长荡湖湖心水样7月份显著（P<0.05）小于12月份，而西石桥水厂出水水质7月份大于12月份，但无统计学差异。表2常州西石桥水厂进出水、长荡湖湖心水样（2003.7，2003.12）有机浓集物对人淋巴细胞DNA的损伤Table2DNAdamagesinhumanperipheralbloodlymphocytesexposedtoorganicextractsfromsourceandtapwaterofXishiqiaowaterwork,andwatersampleofChangdangLake(2003.7,2003.12)水样染毒剂量（mL/管）TailDNAA（％）Taillenngth（μm）OliveTaailMooment７月份西石桥水厂进水207.08±0.44311.39±0..58**1.29±0.110**10011.48±0..63**13.89±0..71**1.89±0.114**a50015.90±1..48**18.42±1..83**3.01±0.553**西石桥水厂出水209.84±0.669**11.40±0..71**1.49±0.113**10015.88±0..99**19.53±1..18**2.83±0.221**b50030.81±4..50**31.85±6..38**6.62±1.449**长荡湖湖心水样208.66±0.992*10.14±1..16**1.25±0.115**10016.16±1..19**18.77±1..36**2.93±0.228**b50031.79±2..84**30.56±2..54**7.51±0.998**12月份西石桥水厂进水209.57±0.330**18.33±0..57**1.78±0.007**10012.19±0..63**22.06±1..04**2.80±0.226**b50015.38±0..98**30.33±1..80**4.59±0.448**西石桥水厂出水207.86±0.334*12.25±0..52**1.31±0.008**1009.70±0.555**14.68±0..81**1.95±0.331**a50016.57±0..79**29.95±1..57**4.26±0.336**长荡湖湖心水样207.21±0.55412.32±0..77**1.50±0.116**10016.79±0..65**25.25±0..96**3.92±0.226**c50032.26±1..10**46.47±1..89**10.17±0..60**溶剂对照06.65±0.3397.81±0.4400.86±0.006注：1.数据均以mmean±SS.E.M表示；*：P<0.055，**:P<0.012.以100mmL/管进行组间间比较，相同同字母表示样样本间无差异异，显著性水水平为0.05；以100mL/管这一剂量组比较各水厂进出水可知，无锡充山水厂和中桥水厂进水对人淋巴细胞DNA的损伤程度均高于其出厂水，但无统计学差异（P>0.05）；常州西石桥水厂12月份进水对人淋巴细胞DNA的损伤程度高于出厂水（P<0.05），而7月份进水低于出厂水（P<0.05）。3讨论长江江苏段干流水质总体较好，水质符合地表水环境质量II类标准。无锡充山、中桥水厂都位于太湖北部梅梁湾,目前该水域的生态环境恶化已经成为太湖最主要的生态环境问题，水质类别为劣Ⅴ类。长荡湖为太湖流域第三大湖泊，目前水质基本满足Ⅲ类标准，水体营养状况为中营养，但近年来水质也在逐渐变差。人淋巴细胞彗星试验的结果与以上各水样的污染状况基本相符。目前，水厂一般采用絮凝、沉淀、沙滤、炭滤和氯消毒等常规处理工艺来生产自来水[6]。研究表明，氯化消毒可产生多种副产品，其中不乏具有致癌、促癌和致突变作用的物质，从而使出厂水的致突变性增高[7],[8]。马梅等[6]对不同原水及不同水处理工艺流程出水有机浓集物进行的致突变试验表明，加氯处理后可生成一些直接致突变性物质及某些经代谢转化后形成的致突变性物质，机械搅拌和絮凝不太可能改变致突变性的状况，而在此之后的煤砂池和炭滤池能够有效地去除加氯和絮凝过程中生成的致突变性物质。邱志群等[9]认为，当水源水致DNA损伤物质的本底值较高时，混凝沉淀对它的去除作用更为明显，从而使出水致突变性降低。由于无锡市两水厂以太湖梅梁湾（水质相对较差）为水源水，而常州西石桥水厂以长江（水质相对较好）为水源水，同时考虑到水质的季节变化（统计分析表明7月份进水的致突变性极显著地低于12月份进水，P<0.01），所以结果与以上报道是相符的。自1988年Singh提出碱性电泳法以来，各国对彗星试验的应用研究几乎呈指数式增长，在遗传毒性研究、临床应用、DNA修复研究、环境生物监测、人群监测等领域得到广泛应用[10]。人血淋巴细胞是彗星试验最常用的生物材料之一，应用也最为广泛，如人群流行病学调查，环境监测、临床应用（如疾病诊断、药效评估、病因与发病机理分析等）[11]。Rajaguru等曾将人血淋巴彗星试验应用于受污染地表水的检测，表明其在环境评价中有良好的应用前景[12]。本实验室曾利用其评价扬中市地表水的污染状况[13]。本文研究也证实了其用于检测水体有机浓集物遗传毒性的可行性。然而，由于彗星试验程序尚未标准化，限制了其在实践中的推广应用，所以有必要进一步加强彗星试验的方法学研究。4结论（1）无锡充山水厂、中桥水厂，常州西石桥水厂进出水及金坛市长荡湖湖心水样的有机浓集物均可对人外周血淋巴细胞DNA产生不同程度的损伤，存在一定的遗传毒性。试验结果与各水样水质污染状况基本一致。同时，季节变化以及常规水处理过程对水样的遗传毒性有影响。（2）彗星试验可有效地应用于水中有机物遗传毒性的检测，在环境监测中有良好的应用前景，但有必要对其进行标准化以利于实践中的推广应用。参考文献：[1]朱惠刚.水中有机致突变物综合评价指标探讨[J].上海环境科学，1995,14(10):44-49[2]冯霄,陆寿珍,陈中孚.SOS显色法检测黄浦江不同江段水中有机污染物的遗传毒性[J].复旦学报(自然科学版),1990,29(2)：198-202[3]RojasE，LopezMC，ValverdeM.Singlecellgelelectrophoresisassay:methodologyandapplications[J].JChromatogrB,1999,722:225–254[4]SinghNP,McCoyMT,TiceRR,etal.AsimpletechniqueforquantitationoflowlevelsofDNAdamageinindividualcells[J].ExpCellRes,1988,175:184-191[5]DevauxA,PesonenM,MonodG.Alkalinecometassayinrainbowtrouthepatocytes[J].ToxicolinVitro,1997,11:71~79[6]马梅，尚玮，王子健等.饮用水处理流程中有机提取物的毒性变化规律[J].环境科学,2001,22(l):49-52[7]马军.氯化消毒副产物的形成及对饮用水质的影响[J].中国给水排水,1996,12(6):36-37[8]黄君礼,李海波,毛宁.二氧化