第十一章真核生物的基因表达调控

第十一章真核生物的基因表达调控1.真核基因表达调控的特点2.DNA染色体水平的调控3.真核基因转录水平的调控4.翻译水平的调节因素及其调节

真核生物基因表达的调控是当前分子生物学中最活跃的研究领域之一。人们已经能够利用许多过去不曾具备的先进仪器设备等手段来研究许多分子生物学方面的重大问题，使我们能从分子水平上认识许多复杂的基因表达过程。11.1真核基因表达调控的特点

真核基因表达调控的许多基本原理与原核生物基因(以下称原核基因)相同。主要表现在：①与原核基因的调控一样，真核基因表达调控也有转录水平调控和转录后的调控，并且也以转录水平调控为最重要；②在真核结构基因的上游和下游(甚至内部)也存在着许多特异的调控成分，并依靠特异蛋白因子与这些调控成分的结合与否调控基因的转录。

真核生物和原核生物在基因表达调控上的区别是由两者生活方式的不同所决定的。在真核基因表达调控中至少有4个方面与原核基因表达调控不同：①原核细胞的染色质是裸露的DNA，而真核细胞染色质则是由DNA与组蛋白紧密结合形成的核小体。在原核细胞中染色质结构对基因的表达没有明显的调控作用，而在真核细胞中这种作用十分明显；②在原核基因转录的调控中，既有激活物参与的正调控，也有阻遏物参与的负调控，二者同等重要。真核细胞中虽然也有正调控成分和负调控成分，但主要是正调控，且一个真核基因通常有多个调控序列，必须有多个激活物同时特异地结合上去才能调节基因转录。③原核基因的转录和翻译通常是相互偶联的，即在转录尚未完成之前翻译便已开始。真核基因的转录与翻译在时空上是分开的，从而使真核基因的表达有多种调控机制，其中许多机制是原核细胞所没有的；④真核生物大都为多细胞生物，在个体发育过程中发生细胞分化后，不同细胞的功能不同，基因表达的情况也就不一样，某些基因仅特异地在某种细胞中表达，称为细胞特异性或组织特异性表达，因而具有调控这种特异性表达的机制。11.2DNA染色体水平的调控

每个真核细胞所携带的基因数量及总基因组中蕴藏的遗传信息量都大大高于原核生物。。基因组DNA中基因之间存在许多重复序列、基因内部有大量不编码蛋白质的序列、真核生物的DNA常与蛋白质(包括组蛋白和非组蛋白)结合形成十分复杂的染色质结构、染色质构象的变化、染色质中蛋白质的变化以及染色质对DNA酶敏感程度的不同等，都直接影响着真核基因的表达调控。

真核细胞基因表达调控在DNA和染色体水平上主要有以下几个方面：染色质的结构、DNA在染色体上的位置、基因拷贝数的变化、基因重组、基因扩增、基因丢失、基因重排、DNA修饰等。11.2.1染色质的结构

在间期细胞中以核小体为基本单位的染色质是真核基因组DNA的主要存在方式。DNA盘绕组蛋自核心形成核小体，妨碍了与转录因子及RNA聚合酶的靠近和结合。使基因的活性受到抑制。

但这种作用可以通过改变染色质结构来调节。染色质结构的一系列重要变化可以暴露顺式作用元件及其邻近区域，使转录因子结合并起始转录。DNA（2nm）核小体(10nm）一级结构螺旋管（30nm，6个核小体）二级结构超螺旋管（0.4µm）三级结构染色单体（2µm）四级结构

细胞内的染色质分为活性的和非活性的染色质，绝大多数细胞在特定阶段只有不到10％的基因具有转录活性，多数基因处于非活性状态。活性染色质区域结构疏松，便于结合转录因子并有利于RNA聚合酶沿模板的滑动。在转录起始区及某些特殊区域，核小体构象的变化更为明显。

DNaseI、II和微球菌核酸酶等非特异性内切酶可用于检测核小体构象的变化。染色质能被DNaseI降解为酸溶性小片段，但由于核小体结构的保护，其对酶的攻击仍具有一定的耐受性，敏感区仅相当于染色质全长的1/10。当用极低浓度的DNaseI处理染色质时，切割首先发生在少数特异性位点，其敏感性超出其他区域100倍以上，称为超敏感位点(hypersemitiveske)。

DNaseI超敏感位点(100~200bp)的存在是活性染色质的重要特征，具有组织特异性，并同基因的表达密切相关。每个活跃表达的基因都有一个或几个超敏感位点。大部分位于5′端启动子区域，少数位于转录单位下游，为RNA聚合酶、转录因子或其他调节蛋白提供结合位点。

在启动子区域，核小体的存在能抑制转录起始，以至于组蛋白长期被认为是一个转录抑制因子。由于结合了组蛋白，真核细胞的染色质从整体上被限制在非活性状态，只有解除了对转录模板的抑制它才能得到表达。染色质是否处于活化状态是决定RNA聚合酶能否行使功能的关键。

原核基因:细菌细胞中仅需要改变激活蛋白和抑制蛋白的比例，便能随时调节基因的转录状态。真核生物:以往基因表达调控的研究侧重于对顺式作用元件与反式作用因子及其之间的相互作用，但近年来许多证据表明，染色质和核小体构型的改变在转录调节中也扮演重要的角色。

占先模型(pre-emptivemodel)可以解释转录时染色质结构的变化。该模型认为基因能否转录取决于特定位置上组蛋白和转录因子之间的不可逆竞争性结合。

要阻止核小体形成，则必须保持转录因子同DNA的持续结合。尽管该模型揭示了转录因子结合对核小体结构的影响，但这种简单的占先原则并不能很好的反映体内的实际情况。

动态模型(dynamicmodel)则较好地解决了上述问题，并不断被新的实验结果所证实。该模型认为转录因子与组蛋白处于动态竞争之中，基因转录前染色质必须经历结构上的改变，即转换核小体中的全部或部分成分并重新组装，这个耗能的基因活化过程称为染色质重构(chromatinremodeling)。

细胞内的多种蛋白质因子都能参与染色质的重构，通过改变核小体中DNA-蛋白质的相互作用重建核小体构型，影响转录的起始或延伸。它们分别组成不同的重构复合体，一般都包含多个与蛋白质或DNA相互作用的亚基。11.2.2组蛋白的修饰

各种核心组蛋白都可能被乙酰化，其中H3和H4上分布着乙酰化的主要位点。组蛋白的乙酰化与基因表达水平密切相关，是一个动态过程，高乙酰化是活性染色质的标志之一，而低乙酰化常伴随着转录沉默而失活,X染色体中H4组蛋白则完全不被乙酰化。此外DNA复制过程也伴随有组蛋白的乙酰化。

组蛋白H1能通过维持染色质的高级结构从而对转录进行抑制。磷酸化后的组蛋白H1与DNA的亲和力下降，造成染色质结构疏松，直接影响其活性。11.2.3DNA甲基化与转录抑制

动物基因组DNA中约有2％～7％的胞嘧啶是被甲基化修饰的，形成5-甲基胞嘧啶(mC)，几乎所有的mC与其3′的鸟嘌呤以5′mCpG3′的形式存在，可占全部CpG的50％～

70％。当两条链上的胞嘧啶都被甲基化时称完全甲基化。复制刚完成时，子链上的C呈非甲基化状态，称为半甲基化，随着子链中的C被甲基化为mC，半甲基化位点逐渐形成全甲基化状态。CpG在DNA中的含量差异较大，在某些基因上游的转录调控区及其附近，存在着CG岛(CG-richisland)，长达1~2kb。DNA的甲基化是一个动态修饰过程.3种酶共同控制着甲基化程度:甲基化酶催化甲基与胞嘧淀的共价结合,(构建性甲基化酶和维持性甲基化酶)去甲基化酶则负责去除甲基.

构建性甲基化酶可对非甲基化的CpG位点进行甲基化修饰；维持性甲基化酶可在甲基化的DNA模板链指导下，使其互补链中对应位置上的CpG发生甲基化，从而使其子代细胞中具备亲代的甲基化状态。

甲基化的生物学效应依赖于各mCpG结合蛋白，其中MeCPl和MeCP2是介导甲基化对转录抑制作用主要的结合蛋白，缺乏这些蛋白时不能有效阻遏基因的活化。

基因组印记(genomicimprinting)是DNA甲基化影响基因表达的例证。哺乳动物某些等位基因性状的表达将由于基因的来源不同而呈现差异，甚至只表达单一亲系来源(父源或母源)的基因版本，犹如基因被打上了亲代的印记。

基因组印记是一个可逆的过程，带有亲代基因组印记的子代个体，其自身产生的配子会因为重新修饰而消除原有印记并产生新的印记。

异染色质化能在更大范围内调节真核基因的表达，致使连锁在一起的大量基因同时丧失转录活性，从而起到遗传平衡的作用。

人和多数哺乳动物雌性体细胞中的两条X染色体，在胚胎早期(如l～16d的人胚)均为常染色质状态，随后其中一条X染色体将随机出现异染色质化而失活，只允许另一条染色体上的基因活动。

异染色质化的组蛋白N-末端区域的乙酰化水平很低。11.2.4核基质与基因活化

在真核细胞的细胞核内，除核被膜、核纤丝、核仁和染色质之外，还存在着一个以蛋白质为主的网状系统，即核基质(核骨架)。主要有非组蛋白和高分子量RNA组成。

核基质纤维直径3～30nm，主要成分包括DNA拓扑异构酶Ⅱ、核基质蛋白以及多种DNA结合蛋白，并含有少量RNA。11.3真核基因转录水平的调节控制

在基因表达调控的众多过程中，转录水平的调控最为重要，而转录调控又以转录的起始为关键性的环节。11.3.1真核与原核生物转录调控的区别

真核生物的转录调节与原核生物相比，有相似之处，但也有明显差异。主要区别为：

①原核生物功能相关的基因常组织在一起构成操纵子，作为基因表达和调节的单元；真核生物基因不组成操纵子，每个基因都有其自身的基本启动子和调节元件，单独进行转录；②原核生物的调节元件种类较少，主要包括上游的启动区域调控元件和激活蛋白(activator)以及阻遏蛋白(repressor)的结合位点；真核生物的调节元件种类很多，包括上游调节元件，如组成型元件、可诱导元件、应答元件、增强子和沉默子以及反式作用因子如激活因子、阻遏因子等。③无论是原核还是真核生物，其转录都受反式调节因子(转录激活因子或抑制因子)的调节。这类调节可在两个水平上进行：一是通过调节因子的生物合成(即对其种类和数量的调节)，其过程缓慢而持续，主要涉及到细胞的分化等；二是通过对它们进行构象转变或共价修饰(即对其活性的调节)。④真核生物具有染色质结构，基因活化首先需要改变染色质的状态，使转录因子能够接触并作用于启动子，称此过程为染色质改型(chromatinremodeling)。染色质水平的调节主要涉及真核生物发育与细胞分化等调节。

图11-1显示了原核与真核生物转录起始位点上游区的结构。图11-2给出了真核生物基因的一般结构。1.3.2真核生物转录调控的顺式作用元件

(1)顺反子的概念(2)启动子(promoter)(3)增强子对转录的影响(4)绝缘子(insulator)(5)Britten-Davidson模型(1)顺反子的概念(2)启动子(promoter)

(3)增强子对转录的影响

增强子是指能使基因转录频率明显增加的DNA序列。增强子主要存在于真核生物基因组中。最早发现的SV40增强子位于转录起点上游约200bp处的超敏感位点，含有两个正向重复的72bp序列。作为基因表达的重要顺式调控元件，它能极大促进启动子的转录活性。其作用有几个明显特点：①增强转录效应十分明显，一般能使基因转录频率增加10～200倍，有的可以增加上千倍；②能以很远距离(数千个核苷酸以外)对启动子产生影响；③其功能与序列的取向无关，不论增强子以什么方向排列，甚至在基因的下游，均表现出增强效应；④大多为重复序列，一般长约50bp，适合与某些蛋白因子结合。其内部常含有一个核心序列：(G)TGGA/TA/TA/T(G)；⑤其增强效应有严密的组织和细胞特异性，说明只有特定的蛋白质(转录因子)参与才能发挥其功能；⑥没有基因专一性，可在不同的基因组合上表现增强效应；⑦许多增强子还受外部信号的调控，如金属硫蛋白的基因启动区上游所带的增强子，就可以对环境中的锌、镉浓度做出反应；⑧没有生物种属的特异性，其作用受到细胞发育和分化的影响。重组实验证明，如果把SV40增强子上的两个72bp重复序列同时去除。基因表达的水平会明显降低。但其中一个重复序列去除时，则基因正常转录。如果将人β血红蛋白基因克隆到带有72bp重复序列的DNA上，这个基因在体内的表达水平提高200倍以上，即使72bp序列位于该基因转录起始位点上游3kb或下游2.5kb处，仍不例外。

有两种假说可以解释增强子的作用机理。

一是增强子能为转录因子提供进入启动子区的位点。

第二种假说认为，增强子能改变染色质的构象。(4)绝缘子(insulator)

绝缘子(insulator)是近年发现的一类特殊顺式作用元件，它不同于增强子，其功能是阻止激活或阻遏作用在染色质上的传递，使染色质的活性限定于结构域之内。如果将—个绝缘子置于增强子和启动子之间，它能阻止增强子对启动子的激活。

另一方面，如果一个绝缘子在活性基因和异染色质之间，则它可保护该基因免受异染色质化而失活。这些性质说明绝缘子可能影响染色质的组织结构。(5)Britten-Davidson模型

1969年，Britten和Davidson提出了真核生物单拷贝基因转录调控的模型。认为在整合基因的5′端连接着一段具有高度专一性的DNA序列，称为传感基因(Sensorgene)，当它和某种信号分子(如激素或激素蛋白复合物)相互作用时，激活了整合基因的表达，产生具有生物活性的RNA或蛋白质分子；当整合基因的表达产物和受体基因(receptorgene)相互作用时，就启动了结构基因的表达。

如果许多结构基因的邻近位置上同时具有相同的受体基因，则这些基因将受到某一种激活因子的控制而表达，这些基因就归属到一个组。如果有几个不同的受体基因与—个结构基因相邻接，它们能被不同的因子所激活，那么这个结构基因就会在不同的情况下表达。

如果一个传感基因可以控制几个整合基因，则一种信号分子就可以通过一个相应的传感基因激活几个组中的基因。因此，可以把一个传感基因所控制的全部基因归属为—套。如果一种整合基因重复出现在不同的套中，则同一组基因也可以分属于不同的套。11.3.3基因的基础转录及其调节

参与转录调控的蛋白因子有3类:基础转录因子(通用转录因子):广泛分布于各种细胞类型,与核心启动子结合;上游因子:与上游启动子序列结合,提高转录水平;可诱导因子:其识别序列称为应答元件.

基因的基础转录是指由核心启动子与通用转录因子结合后起始的转录过程。只含有通用转录因子和上游因子识别序列的启动子可在各种细胞类型中都发挥作用，由它所控制的基因呈组成型表达，用以合成细胞所必需的各种成分，又称为管家基因(house-keepinggene)。11.3.4反式作用因子的结构与功能反式作用因子：是指远离受影响的基因之外的基因所编码的产物，又称为转录因子。它有非特异性和特异性之分。

反式作用因子有三个结构域，即DNA结合结构域、转录激活结构域和二聚化结构域。许多转录因子含有介导蛋白质二聚化的位点，二聚体的形成对它们行使功能具有重要意义。(1)螺旋-转角-螺旋结构基序

(helix-turn-helix，HTH)

螺旋-转角-螺旋结构由两段α螺旋及连接它们的β转角结构组成，一般长约20个AA残基，由其中靠近C端的一段螺旋与DNA大沟中的碱基直接接触，该螺旋称为识别α螺旋，另一段螺旋没有特异性，与DNA骨架相接触(图11-4)。螺旋-转角-螺旋(helix-turn-helix)(2)锌指结构基序(zincfinger，ZF)

这类结构主要见于真核生物的调节因子。非洲爪蟾由RNA聚合酶III催化的5SrRNA基因转录的转录因子TFMA，是由344个AA组成的第一个被发现的锌指蛋白。锌指结构(zincfingermotif)(3)螺旋一突环一螺旋结构基序

(helix-loop-helix,HLH)

螺旋-突环-螺旋型DNA结合蛋白是近年来发现的一种新型DNA结合蛋白。由40~50个AA残基形成两个两性的α螺旋，中间由长约9～20个氨基酸残基间隔的可变连接区(突环)，通过兼性的螺旋疏水面相互作用形成二聚体。螺旋-环-螺旋

(4)亮氨酸拉链结构基序

(1eucinezipper，ZIP)

亮氨酸拉链最初是通过比较酵母转录激活因子GCN4、哺乳动物转录因子C/EBP(CAAT区及SV40增强子核心序列结合蛋白)以及癌基因产物Fos、Jun和Myc的AA序列时被发现的。亮氨酸拉链中α-螺旋的突出特点是每隔7个AA残基出现一个leu。亮氨酸拉链(leucinezipper)(5)调控蛋白对特异DNA序列的识别

特异性DNA序列表面(一般是与调节蛋白结合的面)的结构特点是DNA与蛋白质结合的分子基础之一。为能进行特异性结合，调控蛋白能够区分那些它将与之特异结合的DNA序列与非特异序列。

调控蛋白与DNA能在DNA的小沟处接触，但这里形成氢键的花式不易于将不同的碱基区分开。调控蛋白与DNA结合时主要依靠分子中的Gln，Asn，Glu，Lys，Arg等。在Gln和Asn与腺嘌呤的N6和N7位之间形成两个氢键，这是特异性的，其他基团之间无此情况；同样Asn可与鸟瞟呤的N7和O6形成两个氢键(图11-9)。TACG11.3.5转录因子的活性调节

(1)转录因子的激活结构域(2)k基因结合核因子(NF-kB)(1)转录因子的激活结构域

转录因子激活区的结构特点因转录因子而异，根据氨基酸组成的特点，主要包括3种类型：①酸性激活结构域，是含酸性AA的保守序列，形成带负电荷的螺旋区；②富含谷氨酰胺结构域(glutarnine-richdomain)最先在SPl中发现，N端有两个转录激活区，其中谷氨酰胺(Gln)残基含量达25％，主要结合GC框；③富含脯氨酸结构域(proline-richdomain)，如CTF家族(主要识别CCAAT框)的C端区域，脯氨酸残基达20％～30％，与转录的激活有关。(2)k基因结合核因子(NF-kB)

11.3.6RNA结合蛋白的结构与功能

真核细胞中转录产物合成后随即与细胞核内的蛋白质相结合，mRNA前体的加帽、接尾、剪接、核输出直至翻译和降解等过程，始终是以核糖核蛋白(ribonudeoprotein，RNP)颗粒的形式完成的。在蛋白质识别有规则双螺旋结构的DNA时，信号主要来自暴露在大沟中的碱基对，通过非共价键的特异组合直接读出。相比之下RNA不规则的高级结构使得识别过程更为复杂,不同的RNA结构，如螺旋、发夹、茎中的凸起或内环，甚至RNA整体构象本身，都可能被RNA结合蛋白专一巨识别，因而RNA结合结构域也就更为复杂多变。1、核糖核蛋白基元

2．富含精氨酸的基元

3．RGG框

4．K同源结构域5．锌指6．双链RNA结合结构域11.4翻译水平的调节因素及其调节翻译水平的调控是真核基因表达多级调节的一个重要环节。调节过程通常涉及mRNA和多种蛋白因子之间的相互作用，mRNA5′端和3′端所含有的非翻译区(untranslatedregion，UTR)是影响翻译过程的主要调节位点。11.4.15′UTR结构与翻译起始的调节

翻译起始的调节是在蛋白质合成水平控制基因表达的主要环节，5′UTR的结构与其调节过程密切相关。5′UTR通常不到100nt，但它的加帽修饰、特殊的二级结构形成和先导序列长度都对翻译过程产生重要影响。

几乎所有真核生物和病毒mRNA的5′端都具有以5′—5′磷酸二酯键相连的帽子结构，甲基转移酶的作用可使帽子结构发生程度不同的甲基化修饰，由此能区分出不同的帽子类型。

mRNA的翻译活性依赖于5′端的帽子结构。

然而脊髓灰质炎病毒等小RNA病毒的(+)链RNA没有5′帽子结构，它们起始翻译的机制不同于宿主细胞mRNA的滑动搜索过程。11.4.2蛋白质磷酸化对翻译效率的影响

翻译的每个阶段都有许多蛋白因子参与，其活性常与这些因子自身的磷酸化修饰密切相关。elF-4F等因子的磷酸化可提高蛋白质的生物合成速度，elF-2a等因子的磷酸化却又阻止翻译的起始过程。11.4.33′UTR结构与mRNA稳定性调控

1.多聚腺苷酸尾的调节作用2.3′UTR序列及结构对mRNA稳定性的调节1、多聚腺苷酸尾的调节作用

真核mRNA的稳定性相差悬殊，编码Fos等调节蛋白的mRNA半衰期只有10～30min，而鸡输卵管中卵清蛋白mRNA的半衰期可达24h。