沉淀反应本科

免疫学及免疫学检验REVIEWQUESTION

Thespecificityofthereactionofantigenwithantibodyisusuallyhighlydependentupon

1)molecularweightoftheantigen2)chargeoftheantibody3)immunoglobulinisotype4)conformationofthereactants免疫学及免疫学检验沉淀反应（precipitationreaction)毛旭虎医学检验系临床微生物学及免疫学教研室二OO六年二月免疫学及免疫学检验可溶性抗原+相应抗体

肉眼可见的沉淀免疫学及免疫学检验1897年Kraus就发现细菌培养液（毒素）与相应抗血清混合出现沉淀1905年Bechhold把抗体放在明胶中，将抗原加于其中，发现沉淀反应可在凝胶中进行1946年Oudin报告了试管免疫扩散技术1965年Mancini提出单向免疫扩散技术，使定性免疫试验向定量化发展免疫浊度法的出现，使沉淀反应达到快速、微量、自动化的新阶段。免疫学及免疫学检验根据沉淀反应的介质和检测方法的不同,沉淀反应可分为:液相内的沉淀反应凝胶内的沉淀反应免疫学及免疫学检验第一节液体内沉淀试验根据沉淀现象的不同，液体内沉淀又可分为三类：絮状沉淀环状沉淀免疫浊度沉淀免疫学及免疫学检验一、絮状沉淀试验絮状沉淀试验是一项经典实验技术。曾用于测定梅毒抗体的Kahn试验是絮状沉淀的代表试验，现今已被更简便而敏感的USR或RPR方法替代。免疫学及免疫学检验(一)原理抗原溶液与相应抗体溶液混合，在电解质存在的条件下，抗原与抗体结合出现可见的絮状沉淀。絮状沉淀易受抗原与抗体比例的影响，由此可作为最适比测定的基本方法。免疫学及免疫学检验(二)操作步骤1.抗原稀释法(1)将可溶性抗原作一系列倍比稀释。(2)各管加入一定浓度的适量抗血清。(3)振摇使抗原、抗体充分混匀，置37℃孵育。(4)产生沉淀量随抗原量而不同，以出现沉淀物最多的管为最适比例管。免疫学及免疫学检验免疫学及免疫学检验2.抗体稀释法

本法采用抗原量恒定与不同倍比稀释度的抗体反应，出现沉淀物最多的管为抗体最适比例管。3.方阵滴定法

抗原和抗体同时稀释，亦称棋盘(checkerboard)滴定法，是前二法的结合，可一次完成抗原和抗体的滴定并找出抗原、抗体的最适比。免疫学及免疫学检验(三)方法评价

絮状沉淀试验方法简单，设备要求低，敏感度较低，受抗原抗体比例影响非常明显，目前多用以测定抗原抗体反应的最适比。免疫学及免疫学检验二、环状沉淀试验环状沉淀(ringprecipitation)试验是由Ascoli于1902年建立的一种经典的血清学定性试验。用非常简便的技术了解待测血清内是否存在某种抗原或抗体。免疫学及免疫学检验(一)原理把抗原溶液小心地加于已含抗体溶液的细试管液面上。当对应的抗原与抗体相遇，在界面处形成清晰的乳白色沉淀环。免疫学及免疫学检验(二)操作步骤1.用毛细滴管吸取抗血清加于沉淀管(内径约1.5~2mm)底部，避免产生气泡。2.将抗原溶液沿管壁缓缓叠加于抗血清液面上，形成清晰的交界面。3.置沉淀管于室温下使其反应，1~5min内在两界面间呈现乳白色沉淀环为阳性。30min仍无沉淀环出现则为阴性。

免疫学及免疫学检验(三)方法评价

该试验是经典的血清学反应之一，简便、快速、实用。故用于鉴定血迹和诊断炭疽(Ascoli试验)。只能定性，不能定量、敏感性较低(3~20mg/L)，对含有多个抗原抗体对的反应系统缺乏分辨力。方法难以推广。

免疫学及免疫学检验三、免疫浊度试验经典的免疫沉淀试验是抗原和相应抗体在反应终点时判定结果，方法存在耗时、敏感度低(10~100mg/L)和不能自动化等缺点。70年代以来，根据抗原和抗体所在液相内快速结合并产生浊度的原理，建立了免疫比浊法。临床常用3种微量免疫技术，即透射比浊法(transmissionturbidimetry)、散射比浊法(nephelometry)和免疫胶乳比浊法(immunolatexturbidimetry)，借助多种自动化分析仪器来完成。免疫学及免疫学检验(一)透射比浊法1.原理抗原抗体在一定缓冲液中形成免疫复合物(IC)，当光线透过反应溶液时，由于溶液内复合物粒子对光线的反射和吸收，引起透射光减少，免疫复合物量越多，透射光越少，即光线吸收越多，可用吸光度表示。吸光度和复合物的量成正比，当抗体量固定时，与待检抗原量成正比。用抗原标准品建立标准曲线，可测出待检抗原含量。免疫学及免疫学检验2.操作步骤(1)用稀释缓冲液将待检样品和标准品按规定稀释，取一定量加至测定管中。(2)加最适工作浓度(用方阵法预先滴定)的抗体，孵育一定时间，测定吸光度(A)值。(3)以不同浓度抗原含量为横轴，吸光度为纵轴，绘标准曲线。从标准曲线可得待检抗原量。免疫学及免疫学检验3.方法评价

敏感度高于单相琼脂扩散试验5~10倍，批内、批间重复性较好，变异系数<10%，操作简便快速，1h可报告结果。免疫学及免疫学检验(二)散射比浊法散射光系指一定波长的光沿水平轴照射，碰到小颗粒的免疫复合物，光线被折射，发生偏转，这种偏转的角度可因光线波长和颗粒大小不同而有所区别。散射浊度法是在入射光的一定角度检测粒子发出的散射光，散射光的强度与复合物的含量呈正比，即待测抗原越多，形成复合物越多，散射光强度越强。又可分为速率散射比浊法(ratenephelome-try)和终点散射比浊法(endpointnephelometry)。免疫学及免疫学检验1.速率散射比浊法(1)原理：是一种抗原抗体结合动态测定法。所谓速率是抗原抗体结合反应过程中，在单位时间内两者结合的速度。速率法是测定最大反应速率，即在抗原抗体反应达最高峰时，通常为数十秒钟，测定其复合物形成的量。峰值的高低在抗体过量情况下与抗原的量成正比。峰值出现的时间与抗体的浓度及其亲和力直接相关。不同抗原含量其速率峰值不同，通过微电脑处理，求出抗原含量。免疫学及免疫学检验(2)操作步骤：1)用稀释液将待检抗原稀释成一定浓度。2)将稀释待检抗原和不同浓度抗原标准品加至试管内，再加入一定量抗体，立即比浊，记录速率单位(RU)。3)以抗原标准品含量为横坐标，RU值为纵坐标，于普通坐标纸上绘制标准曲线。根据待测抗原RU值，查出相应抗原含量。免疫学及免疫学检验(3)方法评价：

检测不必等到抗原抗体反应达到平衡，大大节约反应时间，每小时可检测数十份标本；敏感度高，最小检出量达μg/L水平。免疫学及免疫学检验2.终点散射比浊法(1)原理：让抗原抗体作用一定时间，使其反应达到平衡后，测定其复合物的量。复合物的浊度不再受时间的影响，但反应复合物聚合产生絮状沉淀之前(大约反应数十分钟)进行浊度测定。免疫学及免疫学检验(2)操作步骤1)用稀释液稀释待检抗原和抗原标准品。2)取一定量稀释待检抗原液和不同浓度抗原标准品溶液加至试管中，加抗体充分混匀，孵育一定时间，比浊。3)以抗原标准品量为横坐标，浊度值为纵坐标，绘制标准曲线。根据待检抗原的浊度值，查出抗原含量。免疫学及免疫学检验(3)方法评价：

敏感度达mg/L水平，可自动化，但反应时间较长免疫学及免疫学检验(三)免疫胶乳比浊法1.原理选择一种大小适中，均匀一致的胶乳颗粒，吸附抗体后，当遇到相应抗原时，则发生凝集，单个胶乳颗粒在入射光波长之内，光线可透过，当两个胶乳凝集时，则使透过光减少。这种减少的程度与胶乳凝集成正比，与抗原量成正比。免疫学及免疫学检验2.操作步骤1)用稀释液将待测抗原和抗原标准品稀释。2)将抗体致敏胶乳溶液和待测抗原、不同浓度的抗原标准品反应一段时间，测吸光度值。3)以抗原标准品量为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线，查出待测抗原量。免疫学及免疫学检验3.方法评价

敏感度高，试剂稳定，因反应液中无PEG沉淀剂的影响，个体IC对结果影响也小，所以结果稳定、可靠，特异性好；不需特殊仪器设备，一般分光光度计、自动化生化分析仪或散射比浊仪均可使用。

免疫学及免疫学检验第二节凝胶内沉淀试验凝胶内沉淀试验(gelphaseprecipitation)主要是指琼脂糖扩散或称凝胶扩散(geldiffusion)。常用的凝胶有琼脂、琼脂糖、葡聚糖或聚丙稀酰胺凝胶等。根据实验目的与方法不同，可将固相内沉淀验分为3类：①双相琼脂扩散试验(doublegeldiffusiontest)，②单相琼脂扩散试验(singlegeldiffusiontest)，③凝胶免疫电泳(gelimmuno-electrophoresis)。这是一项凝胶内电泳加扩散技术，专门一章介绍。免疫学及免疫学检验一、单相琼脂扩散试验(一)原理将一定量的抗体混入琼脂凝胶中，使待测的抗原物质在凝胶中自由扩散，与抗体结合形成沉淀环，沉淀环的大小与抗原浓度呈正相关。免疫学及免疫学检验(二)操作步骤1.将抗体和0.9%琼脂糖50~56℃混合，即刻倾注成平板。2.待凝固后在琼脂板上打孔，孔中加入已稀释的抗原溶液和不同浓度的抗原标准品溶液。3.置37℃，让其向四周自由扩散，24~48h后可见其孔周围出现沉淀环。免疫学及免疫学检验单向免疫扩散试验示意图

免疫学及免疫学检验

免疫学及免疫学检验沉淀环的直径与待检标本内含量不是直线关系，有两种计算方法：(1)Mancini曲线：适用于大分子抗原，扩散时间>48h，使用普通坐标纸作图，扩散环直径平方和浓度呈线性关系。(2)Fehcy曲线：适用于较小分子抗原，扩散时间较短，使用半对数坐标纸作图，抗原量的对数和扩散圈直径之间呈线性关系。免疫学及免疫学检验

(三)方法评价

单向琼脂扩散试验是一种稳定、简便、毋需特殊设备，一般实验室均可使用的常规方法，试验的重复性和线性均好。敏感度为1.25mg/L。

免疫学及免疫学检验(四)影响因素1.抗原分子量抗原分子量大，扩散慢，沉淀环较小；抗原分子量小，扩散快，沉淀环相对较大。要求待检血清和抗原标准品在血清学上具有均一性，否则可能出现结果偏高或偏低。

免疫学及免疫学检验

2.抗体种类

实验证明兔抗血清优于马、羊抗血清，兔抗血清可测抗原0.1~1IU/ml，马抗血清为1~10IU/ml，羊为0.4~4IU/ml，为提高实验敏感度，应首选敏感度高的抗血清。免疫学及免疫学检验

3.抗体稀释度

抗体浓度大，沉淀环小，则敏感度低；抗体浓度小，沉淀环增大，不同浓度抗原间的差别较显著，敏感度高。但沉淀环过大，常造成边缘糊不清，致使测量误差也增大。因此要求在沉淀环清晰的基础上加大稀释度以提高敏感度。下图为抗体分别以1:25、1:50、1:75、1:100稀释，所形成的4条标准曲线。

免疫学及免疫学检验

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4.扩散时间

抗原达到扩散终点后，其沉淀环直径才与抗原含量呈一定关系。抗原含量越高，达到一定关系所用扩散时间越长。免疫学及免疫学检验5.扩散温度

在4~37℃范围内，提高温度加快扩散速度，缩短反应时间。但有的沉淀环仅在低温下形成，温度高反而消失。在同一次试验的孵育过程中，要防止温度急剧变化，以免出现双圈。6.琼脂板厚度

琼脂板厚度增加，沉淀环面积相应缩小。

免疫学及免疫学检验二、双相琼脂扩散试验(一)原理将可溶性抗原和抗体置于琼脂凝胶板的对应孔中，两者各自在凝胶中向四周自由扩散，当抗原与抗体相遇，在比例合适时形成可见的白色沉淀线。沉淀线的特征与抗原抗体的浓度、纯度和扩散速率等有关。免疫学及免疫学检验

(二)操作步骤1.融化琼脂，浇板每张载玻片约4ml。2.凝固，打孔孔径3mm，孔间距3~5mm，孔型有双孔型、三角孔型、双排孔型和梅花孔型。3.加样在相对孔内加抗原或抗体。4.孵育使抗原抗体自由扩散，在两孔之间抗原抗体相遇，在比例适时形成可见的沉淀线。沉淀线的数目、形态和位置与抗原和抗体的纯度、浓度和扩散速度有关。免疫学及免疫学检验(三)双相琼脂扩散试验的应用1.检测未知抗原或抗体