不同生化检测系统实现结果可比性的方法

不同生化检测系统实现结果可比性的方法第一页，共七十六页，2022年，8月28日新乡市第一人民医院检验科齐振普不同生化检测系统实现结果可比性的方法第二页，共七十六页，2022年，8月28日问题的提出第三页，共七十六页，2022年，8月28日问题1目前，很多实验室都有两台或多台生化分析仪，经常有不同仪器检测同一项目结果不一致的情况。怎样才能使两台仪器之间的结果具有可比性呢？第四页，共七十六页，2022年，8月28日问题2即使只有一台生化分析仪，但参加EQA结果不成功，地区间不同实验室结果可比性差。如何改进EQA成绩，提高地区间不同实验室之间结果的可比性呢？第五页，共七十六页，2022年，8月28日问题3病人抱怨在不同医院检验结果不一致，不知道该相信谁。医师不知道该如何依据检验结果对患者诊断和治疗。卫生部要求不同实验室之间结果“互认”，降低医疗成本。第六页，共七十六页，2022年，8月28日怎样解决这些问题呢？第七页，共七十六页，2022年，8月28日实现同一检测项目在不同检测系统中的检测结果具有可比性，是临床诊断疾病的基本要求，也是卫生部提倡“结果互认”的基础，更是实验室管理的重要目标。解决“可比性”的关键在于检测系统的量值溯源。钥匙第八页，共七十六页，2022年，8月28日检测系统：是指完成一个检测项目所需要的仪器、试剂、校准品、检验程序等的组合。第九页，共七十六页，2022年，8月28日仪器试剂校准品实验程序第十页，共七十六页，2022年，8月28日固定检测系统（封闭检测系统）：由公司选定的仪器、试剂、校准品、检验程序等组成固定的组合，用户实验室不能更改。这样的检测系统经过公司与参考系统校准比对，可以保证结果的可比性和量值溯源性。第十一页，共七十六页，2022年，8月28日自建检测系统（开放检测系统）：实验室自行选择的仪器、试剂、校准品、检验程序的组合，其中的每一要件都可以更改。如果自建的检测系统经过比对、校准验证和偏倚评估，证明其有效性。则成为有效的检测系统，其检测结果具有可比性和量值溯源性。第十二页，共七十六页，2022年，8月28日如果自建的检测系统未经过比对、校准验证和偏倚评估，其检测结果的可比性和量值溯源性未知，则称为“自攒检测系统”。第十三页，共七十六页，2022年，8月28日选择检测系统的原则：①选择性能优良的仪器和质量好的试剂；②以性能和质量为主要标准，价格为次要标准；③仪器制造商和试剂生产商的美誉度；④培训和售后服务；⑤考虑发展因素；⑥检测系统经过评价确定后，不可随意更换任一要素，特别是试剂和程序。除非有特殊原因，如原使用的试剂停产等。特别不能因为经济利益的原因，随意更换试剂。⑦如果确实需要更换试剂，必须重新评价新检测系统的性能指标，证明是有效的检测系统，方可在实际工作中应用。第十四页，共七十六页，2022年，8月28日实验方法的分级第十五页，共七十六页，2022年，8月28日检验方法学包括：(1)经详尽研究尚未发现不准确度或不确定性原因的决定性方法；(2)经详尽研究证实不准确度与不精密度可以忽略的参考方法；(3)可满足临床或其他目的需要的日常使用的常规方法。第十六页，共七十六页，2022年，8月28日决定性方法（definitivemethod）是指准确度最高，系统误差最小，经过详细的研究，没有发现产生误差的原因或在某些方面不够明确的方法。用于发展及评价参考方法和一级标准品。

第十七页，共七十六页，2022年，8月28日参考方法（referencemethod）是指准确度与精密度已经充分证实的分析方法，干扰因素少，系统误差与重复测定的随机误差相比可以忽略不计，有适当的灵敏度、特异性及较宽的分析范围。这类方法在条件许可的实验室中应经常使用。用于评价常规方法和试剂盒，鉴定二级标准品。

第十八页，共七十六页，2022年，8月28日常规方法（routinemethod）指性能指标符合临床或其他目的的需要，有足够的精密度、准确度、特异性和适当的分析范围，而且经济实用。这类方法经有关学术组织认可后可称为推荐方法（recommendedmethod），推荐方法应具有足够的实验证据。

第十九页，共七十六页，2022年，8月28日项目决定性方法参考方法 常规方法钙ID-MS 原子吸收分光光度法 邻甲酚肽络合法氯电量滴定法、 电流滴定法 电量分析法中子活化法 硝酸汞滴定法镁 ID-MS 原子吸收分光光度法 甲基麝香草酚兰比色法磷 ID-MS—— ——钾 ID-MS、 火焰光度法 火焰光度法中子活化法钠 重量分析法、 火焰光度法 火焰光度法 中子活化法白蛋白—— 免疫化学法 溴甲酚绿法总蛋白—— 双缩脲法 双缩脲法肌酐 ID-MS、 离子交换层析法 苦味酸法 离子交换层析法尿素 ID-MS 尿素酶法 尿素酶法尿酸 ID-MS 尿酸酶法（紫外法） 尿酸酶法胆红素 —— 重氮反应法 重氮反应法葡萄糖 ID-MS 己糖激酶法 葡萄糖氧化酶法胆固醇 ID-MS Abell-Kendall法， 胆固醇氧化酶法 胆固醇氧化酶法甘油三酯ID-MS 酶法 酶法AST —— 酶偶联法 酶偶联法ALT —— 酶偶联法 酶偶联法GGT —— 连续监测产物生成法 连续监测产物生成法CK —— 酶偶联法 酶偶联法第二十页，共七十六页，2022年，8月28日生化参考方法（卫生部临检中心）分析项目分析原理参考方法名称葡萄糖（Glu）ID-LC/MS/MS血清葡萄糖同位素稀释液相色谱串联质谱法尿素（Urea）ID-GC/MS血清尿素同位素稀释气相色谱质谱法尿酸（UA）ID-LC/MS/MS血清尿酸同位素稀释液相色谱串联质谱法肌酐（Crea）ID-LC/MS/MS血清肌酐同位素稀释液相色谱串联质谱法丙氨酸氨基转移酶（ALT）IFCC-Spectrophotometry丙氨酸氨基转移酶活性浓度（37℃）参考测定方法天冬氨酸氨基转移酶（AST）IFCC-Spectrophotometry天冬氨酸氨基转移酶活性浓度（37℃）参考测定方法转肽酶（GGT）IFCC-Spectrophotometryr-谷氨酰转移酶活性浓度（37℃）参考测定方法乳酸脱氢酶（LDH）IFCC-Spectrophotometry乳酸脱氢酶活性浓度（37℃）参考测定方法肌酸激酶（CK）IFCC-Spectrophotometry肌酸激酶活性浓度（37℃）参考测定方法淀粉酶（AMY）IFCC-Spectrophotometry淀粉酶活性浓度（37℃）参考测定方法钠（Na）ICP/MS血清钠电感耦合等离子体质谱法镁（Mg）ICP/MS血清镁电感耦合等离子体质谱法糖化血红蛋白A1cIFCC-LC/MS/MS糖化血红蛋白液相色谱串联质谱IFCC法高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）Ultracentrifugation-HPLC高密度脂蛋白及其亚类胆固醇超速离心-高效液相色谱法低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）Ultracentrifugation-HPLC低密度脂蛋白及其亚类胆固醇超速离心-高效液相色谱法胆固醇（TC）ID-LC/MS/MS血清总胆固醇同位素稀释液相色谱串联质谱法胆固醇（TC）ID-GC/MS血清总胆固醇同位素稀释气相色谱质谱法甘油三酯（TG）ID-LC/MS/MS血清甘油三酯同位素稀释液相色谱串联质谱法甘油三酯（TG）ID-GC/MS血清甘油三酯同位素稀释气相色谱串联质谱法皮质醇（Co）ID-LC/MS/MS血清皮质醇同位素稀释液相色谱串联质谱法睾酮（T）ID-LC/MS/MS血清睾酮同位素稀释液相色谱串联质谱法孕酮（P）ID-GC/MS血清孕酮同位素稀释气相色谱质谱法第二十一页，共七十六页，2022年，8月28日血液参考方法（卫生部临检中心）检测项目检测原理参考方法名称白细胞计数（WBC）单通道电阻抗法白细胞计数参考方法红细胞计数（RBC）单通道电阻抗法红细胞计数参考方法血红蛋白测定（HGB）HiCN分光光度法血红蛋白测定参考方法红细胞比容测定（Hct）微量毛细管离心法红细胞比容测定参考方法血小板计数（PLT）流式细胞术法血小板计数参考方法第二十二页，共七十六页，2022年，8月28日标准品的分级（3级）第二十三页，共七十六页，2022年，8月28日一级标准品（原级参考物质）是一种稳定而均一的物质，它的数值已由决定性方法确定，或由高度准确的方法确定，所含杂质也已经定量，且有证书；用于校正决定性方法，评价及校正参考方法以及为二级标准品定值。第二十四页，共七十六页，2022年，8月28日二级标准品（次级参考物质）这类标准品可由实验室自已配制或为商品，它的示值必须用一级标准品和参考方法确定；主要用于常规方法的评价或为控制物定值和常规测定的结果计算。第二十五页，共七十六页，2022年，8月28日日常校准品用二级标准品和常规方法测定得到校准品，用于常规测定中的标准。第二十六页，共七十六页，2022年，8月28日生化标准物质（国家标准）1.GBW09174冰冻人血清中葡萄糖、肌酐、尿酸、尿素标准物质2.GBW09175冰冻人血清中葡萄糖、肌酐、尿酸、尿素标准物质

3.GBW09176冰冻人血清中葡萄糖、肌酐、尿酸、尿素标准物质4.GBW09177冰冻人血清丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、γ-谷氨酰基氨基转移酶、乳酸脱氢酶、肌酸激酶、α-淀粉酶活性浓度标准物质5.GBW09178血清总胆固醇、总甘油、高密度脂蛋白胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇标准物质6.GBW09179血清总胆固醇、总甘油、高密度脂蛋白胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇标准物质7.GBW09180血清总胆固醇、总甘油、高密度脂蛋白胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇标准物质8.GBW09181人血红蛋白溶液中糖化血红蛋白标准物质9.GBW09182人血红蛋白溶液中糖化血红蛋白标准物质10.GBW09183人血红蛋白溶液中糖化血红蛋白标准物质第二十七页，共七十六页，2022年，8月28日血液标准物质（国家标准）检测项目标准物质名称证书编号HGB氰化高铁血红蛋白国家一级标物质GBW09153WBC、RBC、HBG、PLT血细胞分析国家一级标准物质GBW09172HCT红细胞比容国家一级标准物质GBW09173第二十八页，共七十六页，2022年，8月28日免疫和核酸标准物质（国家标准）标准物质名称标准物质编号浓度乙型肝炎表面抗原（HBsAg）血清（冻干）标准物质GBW0916428.0±3.2IU/ml乙型肝炎表面抗原（HBsAg）血清（液体）标准物质GBW(E)0900380.23±0.08IU/ml乙型肝炎表面抗原（HBsAg）血清（液体）标准物质GBW(E)0900390.74±0.23IU/ml乙型肝炎表面抗原（HBsAg）血清（液体）标准物质GBW(E)0900401.31±0.42IU/ml乙型肝炎表面抗原（HBsAg）血清（液体）标准物质GBW(E)0900412.55±0.80IU/ml乙型肝炎表面抗原（HBsAg）血清（液体）标准物质GBW(E)0900424.6±1.3IU/ml丙型肝炎病毒（HCV）抗体血清（冻干）标准物质GBW091608.00±0.20NCU/ml丙型肝炎病毒（HCV）抗体血清（液体）标准物质GBW(E)0900440.86±0.09NCU/ml丙型肝炎病毒（HCV）抗体血清（液体）标准物质GBW(E)0900452.10±0.29NCU/ml丙型肝炎病毒（HCV）抗体血清（液体）标准物质GBW(E)0900464.35±0.72NCU/ml丙型肝炎病毒（HCV）抗体血清（液体）标准物质GBW(E)0900478.4±1.1NCU/ml第二十九页，共七十六页，2022年，8月28日临床实验室使用常规方法和日常校准品，涉及到分析仪器、试剂、分析参数和校准品。如果常规方法的检测结果经一系列合理实验的验证，其量值能够溯源到高级标准物质，说明检验结果有溯源性。最高级标准为国际或国家标准，如无国际或国家标准，常规测量结果通常应该溯源到厂家标准。

第三十页，共七十六页，2022年，8月28日实验室认可的两个国际标准ISO/IEC17025（检测和校准实验室能力认可准则）和ISO/15189（医学实验室—质量和能力的专用要求）都对检验结果的溯源性和可比性提出了明确要求，强调方法学比对试验是实现准确度溯源和患者标本检验结果可比性的重要途径第三十一页，共七十六页，2022年，8月28日美国临床和实验室标准协会（CLSI）EP9-A2文件提供了不同检测系统比对试验的方法。在进行比对试验之前，首先应对自建系统作精密度评价。EP5-A2文件提供了精密度评价方法。第三十二页，共七十六页，2022年，8月28日精密度和准确度第三十三页，共七十六页，2022年，8月28日1.精密度试验第三十四页，共七十六页，2022年，8月28日精密度实验一般选择2个标本，1个为正常或在医学决定水平附近，另1个为异常值。以本实验室研制的改良血清蛋白方法（中华检验医学杂志，2005，11：1197-1200）的精密度评价为例，实验用1份正常值混合血清和1份高值混合血清。第三十五页，共七十六页，2022年，8月28日⑴精密度初步试验正常值和高值混合血清各重复测定20次，计算均值，标准差（s），变异系数（CV%）。结果如下。正常值混合血清：x=71.0g/L，s=1.30g/L，

CV=1.81%。高值混合血清：x=96.5g/L，s=1.36g/L，

CV=1.42%。第三十六页，共七十六页，2022年，8月28日⑵精密度正式试验①测定：取上述2个混合血清，每日测定2次（2次间隔>2h），每次测定均作双份，连续20天。每次测定均同时做质控。②离群点检查：如每次双份测定的差值超过初步精密度测定时±标准差的5.5倍（是99.99%的上限值），这对数据为“离群点”，弃去并重新补做。第三十七页，共七十六页，2022年，8月28日③统计分析：所得数据按文献[1]计算均值，标准差（s），变异系数（CV%）。包括批内CV，批间CV，日间CV和总CV（表1，2）。④结果判断：按照国内或国际上权威机构公布的精密度指标判断精密度试验结果的可接受性。如果自建系统的精密度不可接受，则要查找原因，必要时更换检测系统。第三十八页，共七十六页，2022年，8月28日表1精密度试验计算表（正常值混合血清）第三十九页，共七十六页，2022年，8月28日

正常值混合血清：日平均均值=70.1 S日间(B)=2.32，CV日间

=B/日平均均值×100%=3.32% S批间(A)=(E/2n)1/2=1.65，CV批间=A/日平均均值×100%=2.35% S批内(F)=((C+D)/4n)1/2=1.39 CV批内=F/日平均均值×100%=1.99% S总(G)=(B2+A2+F2)1/2=3.17 CV总=G/日平均均值×100%=4.52%

总CV4.52%，低于IFCC规定的CV≤5%的标准。第四十页，共七十六页，2022年，8月28日表2精密度试验计算表（高值混合血清）第四十一页，共七十六页，2022年，8月28日

高值混合血清：

日平均均值=91.1S日间(B)=1.57，CV日间=B/日平均均值×100%=1.72%S批间(A)=(E/2n)1/2=0.87，CV批间=A/日平均均值×100%=0.96%S批内(F)=((C+D)/4n)1/2=1.12，CV批内=F/日平均均值×100%=1.23%S总(G）=（B2+A2+F2）1/2=2.12 CV总=G/日平均均值×100%=2.33%总CV2.33%，低于IFCC规定的CV≤5%的标准。

第四十二页，共七十六页，2022年，8月28日精密度好，准确度如何？是B还是C？第四十三页，共七十六页，2022年，8月28日2.与参考方法或目标系统比对，实现自建检测系统的量值溯源第四十四页，共七十六页，2022年，8月28日溯源性ISO15189：医学实验室-质量和能力的专用要求

“通过一条具有规定不确定度的不间断的比较链，使测量结果或测量标准的值能够与规定的参考标准，通常是与国家标准或国际标准联系起来的特性”。第四十五页，共七十六页，2022年，8月28日自建系统与目标系统比对与量值溯源链第四十六页，共七十六页，2022年，8月28日

比较方法。应是参考方法或推荐方法，如果该项目没有参考方法或推荐方法，也可用公认的常规方法。但须具备：①比试验方法有更好的精密度。②干扰影响已知。③与试验方法使用相同的计量单位。目标系统。性能良好的固定检测系统或室内质控（IQC）和长期室间质评（EQA）成绩合格的检测系统，可作为比对的目标系统。

⑴比较方法和目标系统第四十七页，共七十六页，2022年，8月28日⑵实验标本每天收集不同浓度的新鲜血清8份，连续收集5天以上，浓度范围尽可能覆盖该项目的测量范围，且参考值范围以外的标本尽可能在50%以上。各浓度标本数量的按排可参阅表3。第四十八页，共七十六页，2022年，8月28日表3方法比较中分析物浓度水平第四十九页，共七十六页，2022年，8月28日⑶实验方法每天用两种方法分别测定8个标本，每个标本测定2次。第1次按1→8，第2次按8→1的顺序，共测定5天，各获得80个数据。第五十页，共七十六页，2022年，8月28日举例：NCCLS(EP9-A2)文件2.3方法比较步骤(以淀粉酶测定为例)样品大小至少为40个标本,每个标本用2种方法分别作双份测定,因此样本应有足够的量,如临床标本的量太少可将2份含量相近的标本混合。每天测定8个标本,双份测定时第一次按顺序1,2..7,8,第二次8,7..2,1,共测5天,将数据整理成表4。第五十一页，共七十六页，2022年，8月28日表4

淀粉酶测定试验方法(Y)与BM试剂(X)比较(U/L)

试验方法 比较方法试验方法比较方法样品 结果1 结果2结果1结果2 结果1-2结果1-2

1 1792 179516721676 3 42 1755 175115611562 4 13 1598 1595148014833 3..38

3536

39

401 139

72

75

79

78 3 140

54

52

58

55 2 3第五十二页，共七十六页，2022年，8月28日⑷离群值检查方法内离群值的检查：计算每个标本重复测定值间的绝对差值、每个标本测定值的均值，以平均绝对差值的4倍为限，超出限值即为离群点。（表5）方法间离群值的检查：计算两方法间成对结果的绝对差值及其平均值，以平均绝对差值的4倍为限，超出限值即为离群点。（表6）第五十三页，共七十六页，2022年，8月28日表5方法内复测结果离群值检查Xi1=1672

Xi2=1676 Yi1=1792

Yi2=1795DXi=︱xi1-xi2︱=︱1672-1676︱=4,X1=(Xi1+Xi2)/2=1674DYi=︱Yi1-Yi2︱=︱1792-1795︱=3,Y1=(Yi1+Yi2)/2=1793.5DXi’=DXi/Xi=4/1674=0.00239DYi’=

DYi/Yi=3/1793.5=0.00167同样:I Xi1Xi2Yi1Yi2DXiDYiDXi’DYi’1 167216761792 1795430.00239 0.001672 15611562 1755 1751140.00511 0.002283 14801483 1598 1595330.00202 0.00202..38 394035 36 110.0253 0.028239 7978 72 75 130.0127 0.038240 5655 54 52 120.0180 0.0377第五十四页，共七十六页，2022年，8月28日DX=2.75,

控制限值=4×DX=4×2.75=11进位制=11DY=2.875,

控制限值=4×DY=4×2.875=11.5进位制=12DX’=0.00698

控制限值=4×DX’=0.0288DY’=0.0105

控制限值=4×DY’=0.0420

本例方法内未发现离群点。第五十五页，共七十六页，2022年，8月28日表6方法间离群点检查Xi1=1672 Xi2=1676 Yi1=1792 Yi2=1795Ei1=︱Yi1-Xi1︱=︱1792-1672︱=120Ei2=︱Yi2-Xi2︱=︱1795-1676︱=119Ei1’=Ei1/Xi1=120/1672=0.0718Ei2’=Ei2/Xi2=119/1676=0.0710同样：I Ei1Ei2 Ei1’ Ei2’1 120119 0.0718 0.07102 185*189* 0.1180 0.12103 118112 0.0797 0.0755.3844 0.1030 0.10003973 0.0886 0.03854023 0.0357 0.0545第五十六页，共七十六页，2022年，8月28日

402E=1/80∑∑Eij=1/80×3359=41.99

I=1j=1E的控制限值=4×E=4×41.99=167.96进位=168

402E’=1/80∑∑E’ij=1/80×4.831=0.0604

I=1j=1E’的控制限值=4×E’=0.2416本例方法间出现2个离群点第五十七页，共七十六页，2022年，8月28日⑸实验数据的可接受性判断两种方法的相关性分析：①计算回归方程

y（自建）=a+bx（比对）②计算相关系数（r）和决定系数（r2）。

第五十八页，共七十六页，2022年，8月28日③相关系数r≥0.975或决定系数r2≥0.95，说明实验数据范围合适，直线回归统计的斜率和截距可靠。④相关系数r<0.975或决定系数r2<0.95，说明自建系统方法精密度差或实验数据范围不合适，直线回归统计的斜率和截距不可靠，需改进方法的精密度或扩大浓度范围。第五十九页，共七十六页，2022年，8月28日⑹临床可接受性判断①计算方法间的系统误差：将各个项目的医学决定水平浓度（Xc）代入回归方程，计算Y与X之间的系统误差（SE）。

SE=∣Y－X∣②

计算相对偏差（SE%）=（SE/Xc）×100%第六十页，共七十六页，2022年，8月28日③以方法学比较评估的SE%≤1/2美国临床医学检验部门修正法案（CLIA’88）能力比对检验的分析质量要求允许总误差（TEa）为临床可接受水平，判断自建系统与目标系统检验结果的可比性。淀粉酶测定的最大允许误差（TEa）=靶值±30%（附录）。SE%≤15%即为临床可接受。第六十一页，共七十六页，2022年，8月28日④自建系统与比对方法或目标系统的检验结果有可比性，即认为自建检测系统为有效的检测系统。其检测结果具有量值溯源性。第六十二页，共七十六页，2022年，8月28日⑤如果自建系统与目标系统检验结果不具可比性，则应依据NCCLSEP15-A文件[7]对自建系统进行校准验证和溯源性确认。第六十三页，共七十六页，2022年，8月28日3.自建系统的校准验证和溯源性确认第六十四页，共七十六页，2022年，8月28日采用新鲜血清赋值传递的方法，是实现自建系统与目标系统检测结果一致性的有效途径。用目标系统先给新鲜血清定值，再赋值给商品校准物（日常校准品），解决了自建系统的校准溯源性问题。由于商品血清校准物存在“基质效应”，新鲜血清不存在基质效应但不易储存，二者结合应用可克服缺陷，优势互补。第六十五页，共七十六页，2022年，8月28日⑴自建检测系统的校准第六十六页，共七十六页，2022年，8月28日⑵校准验证和溯源性确认①选取由低到高系列浓度患者新鲜血清5～6份，浓度覆盖整个测量范围；②分别在自建系统和目标系统上重复测定2次，求平均值；③进行相关与回归分析，若回归线性相关系数（r）≥0.975，斜率（b）与1差异无统计学意义，截距（a）与0差异无统计学意义，说明相关性良好。④将医学决定水平值代入回归方程，计算各点校准验证值。若校准验证的相对偏差（SE%）≤1/4CLIA’88允许总误差（TEa），说明校准成功，结果具有溯源性。否则重新校准。第六十七页，共七十六页，2022年，8月28日4.用室内质控（IQC）和室间质评（EQA）相结合的方法验证自建系统的量值溯源性第六十八页，共七十六页，2022年，8月28日⑴

室内质控（IQC）主要控制测定的随机误差（精密度）是A还是B或C?第六十九页，共七十六页，2022年，8月28日室内质控（IQC）①质控物：选取与人血清基质相同的质控品，要求性能稳定、有效期1年以上且瓶间变异小。②确定靶值与标准差：当实测标准差（s）≤1/4CLIA’88TEa（附录1，2）时，以实测标准差为质控图的标准差。当实测标准差（s）>1/3CLIA’88TEa时，测定随机