L-乳酸生产与应用进展

L—乳酸生产与应用进展王金华1,2，赵锦芳1,2，周彬1,雷滟敏1

(1.湖北工业大学生物工程学院，湖北武汉430068；

2.发酵工程省部共建教育部重点实验室，湖北武汉430068)摘要：本文介绍了L一乳酸的理化性质及生产方法，并着重阐述概括了微生物发酵途径生产L一乳酸的菌种，菌种改造，原料，发酵工艺，及分离纯化手段。概括了1—乳酸的广泛应用和市场前景，这些都为进一步进行L一乳酸的开发应用提供参考。关键词：L一乳酸；高光学纯度；米根霉；细菌；发酵；聚乳酸TheprogressionofproduceanduseL-lacticacidWangJinhua1，2,ZhaoJinfang1,2,ZhouBin1，LeiYanmin1(1.Collegeofbioengineering,HubeiUniversityofTechnology,Wuhan,Hubei430068,China；2.TheKeyLaboratoryofFermentation,MinistryofEducation,HubeiUniversityofTechnology,Wuhan,Hubei430068,China)Abstract:L-lacticacid’sphysico-chemicalproperty,widespreadeappicationandprospectivemarketwereintroduced.Severaldifferentproductionmethodswerecontrasted.Thematerial,strains,strain’sreforming,fermentationtechnology,separationandpurificationmethodsofproducingL-lacticacidbymicroorganismfermentationwereilluminatedandsummarized.Referenceswereprovidedforfurtherreseachandapplication.Keywords:L-lacticacid；highopticalrotation；Rhizopusoryzae；bacterium；fermentation；PLA乳酸又名丙醇酸或a-羟基丙酸(2-hydroxypropanoicacid),分子式为。日3。曰0曰。00氏是一种天然存在的有机酸，广泛存在于人体，动植物，微生物中，因含有不对称C原子，而具有光学异构现象。分为L一型，D一型，外消旋体的DL一型［1-2］。易溶于水，乙醇和甘油，微溶于乙醚，但不溶于氯仿，苯，汽油，二硫化碳等。外消旋体为无色糖浆状液体或晶体，无臭，有酸味，有吸湿性，光学性不活泼，在极冷条件下也不凝固，相对密度为1.4392(20-40°C)。熔点18°C，沸点122C。有防止腐败发酵的作用，不侵犯健全的组织，但对病变组织敏感。自从1780年Scheele发现乳酸以来，乳酸及其衍生物，广泛的应用于食品医药、饲料、化工等领域。由于人体只能吸收L一乳酸，过多地食用D一乳酸或DL一乳酸可导致人体代谢功能的紊乱，因此世界卫生组织(WHO)限制成人每天摄入D一乳酸不得超过100mg/kg.而对L一乳酸则不加限制。L一乳酸是世界公认的三大有机酸之一，其最具应用潜力的是生产聚乳酸(PLA)OPLA除具有和聚苯乙烯相似的光泽度及加工性能外，还可以生物降解，可替代化工合成包装材料，消除白色污染，由于PLA具有良好的生物相容性，可广泛应用于医用材料，如药物缓释材料、组织工作材料、手术缝合线、骨折固定等，被认为是最具发展前途的生物可降解材料，其市场潜力巨大，发展前景十分诱人［3］1.L一乳酸的生产1.1化学合成法化学合成法包括乳腈法和丙烯腈法两种。乳腈法是将乙醛和冷却的氢氰酸连续送入反应器生产乳腈，再用泵将所得乳腈加入水解釜中，注入硫酸和水，使乳月青水解得到粗乳酸，将粗乳酸送入酯化釜，加入乙醇酯化生成乳酸酯，经精馏，再送入分解浓缩罐内热分解得精乳酸。美国的斯特林化学公司和日本的武藏野化学公司之前均采用化学合成法。丙烯青法是将丙烯青和硫酸送入反应器中，生成粗乳酸和硫酸氢铵的馄合物，再把混合物送入酯化反应器中与甲醇反应生成乳酸甲酯，把硫酸氢铵分出后，粗酯送入蒸馏塔，塔底获精酯，将精酯送入第二蒸馏塔，加热分解，塔底得稀乳酸，经真空浓缩得产品。化学合成法中采用较多的是乳青法。该法可连续生产，生产成本低，能耗低，但由于该法所用的原料为乙醛和剧毒的氢氰酸，致使生产的乳酸食用较难为人们所接受，因此，应用受到一定的限制［4］1.2酶法［5］1.2.1氯丙酸酶法转化日本东京大学的本崎等［6］，研究了用酶法催化合成乳酸，分别从恶臭甲单孢菌和假单孢菌的细胞中提取纯化了L—2一卤代酸脱卤酶和DL—2一卤代酸脱卤酶，作用于底物DL—2一氯丙酸，制得L一乳酸或D一乳酸。L—2一卤代酸脱卤酶催化L—2一卤代酸脱卤；而DL—2一卤代酸脱卤酶既可催化L—2一卤代酸脱卤，又可催化D—2一卤代酸脱卤，在催化时可发生构型转变。1.2.2丙酮酸酶法转化Hummel等人［7］从D一乳酸脱氢酶活力最高的混乱乳杆菌DSM20196菌体中得到了D一乳酸脱氢酶，以无旋光性的丙酮酸为底物制得到D一乳酸。1.3微生物发酵法由于化学合成法所使用的原料有乙醛和剧毒物质氢氰酸，因而合成法生产乳酸大大受到限制，在食品工业中使用也不被民众接受，此外其生产成本也较高。酶法生产乳酸虽然可以专一性旋光乳酸，但工艺比较复杂，应用到工业上还有待于进一步研究。微生物发酵法生产乳酸，可通过菌种选育和培养条件的选择而得到具有专一性的L一乳酸，D一乳酸或DL一乳酸，完全可以满足聚乳酸的生产需求。微生物发酵法生产乳酸因其原料来源广泛，生产成本也较低，产品光学纯度高和安全可靠性好等优点而成为目前国内外生产乳酸的主要方法。1.3.1乳酸发酵机理不同菌种有不同的乳酸发酵机理，同型发酵一般是通过糖酵解途径，异型发酵有6—磷酸葡萄糖途径和双歧途径2种。乳酸发酵可分为以下4个类型［8］。1.3.1.1同型乳酸发酵葡萄糖经EMP途径降解为丙酮酸，丙酮酸在乳酸脱氢酶的催化下还原为乳酸。1mol葡萄糖可以生成2mol乳酸，理论转换率为100%,如图1。但由于发酵过程中微生物有其他生理活动存在，实际转化率一般在80%以上者，即视为同型乳酸发酵，总反应式为：C6H12O6+2ADP+2Pi-2CH3CH2COOH+2ATP图1L一乳酸同型发酵途径1.3.1.2异型乳酸发酵微生物经HMP途径分解葡萄糖为5—磷酸核酮酸，再经差向异构酶作用变成5—磷酸木酮糖，然后经磷酸酮解酶催化裂解反应，生成3—磷酸甘油醛和乙酰磷酸。乙酰磷酸进一步还原为乙醇，同时放出磷酸，3一磷酸甘油醛经EMP途径后半部分转化为乳酸。异型乳酸发酵产物除乳酸外还有乙醇、CO2和ATP,葡萄糖的转化率只有50%，如图2。异型乳酸发酵总反直式为：CHO+ADP+Pi-CHCHCOOH+CHCHOH+CO+ATP6126 3 2 3 2 2―t磷酸酮解酶ri乙酰磷酸n乙醇葡萄糖―*■6—磷酸葡萄糖一*5—磷酸木酮糖|~3一磷酸甘油醛——乳酸 丙酮酸图2L一乳酸异型发酵途径1.3.1.3双歧发酵两歧双岐杆菌发酵葡萄糖产生乳酸，乳酸的转化率为50%。此途径中有两种酮解酶参与反应，即6一磷酸果糖磷酸酮解酶和5一磷酸木酮糖磷酸酮解酶。双歧发酵总反应式为：2C6H12O6-2^WSOH+3CH3OOH

图3L一乳酸双歧发酵途径1.3.1.4混合酸发酵是同型乳酸发酵在特殊情况下(如葡萄糖浓度受到限制、pH值升高或温度降低)发生的一种乳酸发酵机制，经由与同型乳酸发酵相同的EMP途径，但丙酮酸的代谢途径发生了改变，除生成乳酸外，还生成甲酸等副产物。1.3.2乳酸发酵菌株从各文献报道来看，产L一乳酸的菌种很多，但产酸能力强，具有生产价值的目前主要是霉菌中的根霉菌属及细菌中的乳杆菌属(Lactobacillus)、链球菌属(Streptococcus)，及芽孢杆菌属(Bacillus)等。由于大肠杆菌易于进行分子生物学的操作，可通过代谢工程途径构建基因工程菌，繁殖速度快，营养要求粗放，能利用各种各样的糖(包括木糖)，培养周期短，培养代谢易于控制，易于进行工业化大规模生产等优点，近年来也被广泛用于乳酸发酵研究。表1列出了一些主要的产L一乳酸的微生物菌株。表1产L—乳酸微生物菌株[9]菌种发酵温度。c根霉菌属(Rhizopus)黑根霉(Rhizopusnigricans)30小麦曲根霉(Rhizopusfrifici)30华根霉(Rhizopuschinensis)30甘薯根霉(Rhizopuspatato)30米根霉(Rhizopus oryzae)30结节根霉(Rhizopusnodosus)日本根霉(Rhizopusjaponicus)30少根根霉(Rhizopus arrhizus)30美丽根霉(Rhizopus elegens)乳杆菌属(Lactobacillus)干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)28〜32嗜热乳杆菌(Lactobacillusthermophilum)50~60清酒乳杆(Lactobacillussake)嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)35~38嗜淀粉乳杆菌(Lactobacillusamylophilus)唾液乳杆菌(Lactobacillussalivarias)35~40植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)28~32戊糖乳杆菌(Lactobacilluspentosus)30~32木糖乳杆菌(Lactobacillusbifidus)30~40链球菌属(Streptococcus)嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)40~45乳脂链球菌(Streptococcuscremoris)唾液链球茵(Streptococcussalivarius)芽孢杆菌属(Bacillus)凝结芽孢杆菌(Bacillus soagulans)50~60嗜热脂肪牙孢杆菌(Bacillusstearathemophilus)55~601.3.3根霉发酵1884年Eijkmann指出，根霉所产生的酸可能为乳酸，在1901年被Chrzaszz所确证，1911年，斋藤确认根霉所产乳酸为L一乳酸。根霉菌属中米根霉是L一乳酸发酵的代表性菌种，好氧菌根霉乳酸发酵是经EMP途径生成丙酮酸，然后一部分丙酮酸进入TCA循环，另一部分丙酮酸在乳酸脱氢酶、丙酮酸脱羧酶和丙酮酸羧化酶的催化下分别生成乳酸、乙醇、苹果酸和富马酸，该发酵属于混合酸发酵类型。根霉营养要求简单，能够分泌多种淀粉酶而直接利用更廉价的原料，菌丝体比细菌大，易于分离，有利于制得高质量的乳酸产品。尤其是根霉属发酵可得到光学纯度很高的L一乳酸，因此在国内进行着大量的研究。国内外对于米根霉的选育工作都有大量的报道。Yu等［10］对米根霉直接发酵农产品生产L一乳酸进行了研究，以碳酸钙为中和剂，每千克粗淀粉原料可生成350g以上的L一乳酸.并申请了美国专利。江苏省微生物研究所曹本昌等［11］人选育出了一株产L一乳酸的根霉菌株JSM1-R73，并对该菌株的性能及产酸条件进行了研究，用500L的发酵罐进行了扩大实验。当葡萄糖浓度为10%时产酸70g/L；13%时产酸101g/L以上，该茵可以玉米粉作为培养基，当玉米粉浓度为12%时产酸70g/L以上；20%时产酸105g/L，其L—乳酸的纯度在88%以上，最高可达到99%。山西省微生物研究所蒋明珠等［12］人从56种根霉菌株中筛选出10种产乳酸较高的菌株，其中根霉R—47产L—乳酸最高，产酸稳定，在摇瓶培养条件下，初始葡萄糖浓度为15%，30°C，48h，L—产乳酸达118.4g/L，对糖的转化率达78.9%。天津工业微生物研究所杨子培等［13］人用米根霉TL—527—9菌株以玉米淀粉深层发酵生产L—乳酸。在3m3发酵罐中，当玉米淀粉浓度为130g/L时，平均产酸量94.1g/L，对糖的转化率为79.55%，其中L—乳酸的纯度含量可达98%以上，该研究具有较高的工业应用价值。1.3.4细菌发酵在乳酸发酵工艺上除了可采用根霉生产L一乳酸外，目前国内外都展开了对细菌发酵生产L一乳酸的研究。原因在于虽然根霉发酵产乳酸存在对营养要求简单，可以直接利用大量廉价原料以及能够得到光学纯度很高的L一乳酸等优点，但也存在产酸，对糖利用率都较低，发酵需要通氧，能耗大，时间长，副产物多等缺点，而细菌厌氧发酵虽然存在营养要求高，原料成本高等缺点，但有产酸量大，发酵时间短，无需通氧，能耗低，对糖的转化率较高，理论上可达100%等优点而同样受到研究人员的青睐，。Zhang等［14］研究了食淀粉乳杆菌NRRLB4542直接从淀粉发酵生产L一乳酸的条件，淀粉的起始浓度为120g/L，从液化淀粉出发，可在20h生产出浓度为96.2g/L的乳酸。Hujanen等［15］对干酪乳杆菌NRRLB—441产L一乳酸进行优化，在葡萄糖浓度为160g/L时，乳酸浓度最高可达到118.6g/L，他们采用廉价的大麦芽提取物加少量酵母膏(4g/L)取代单独使用酵母膏(22g/L)，较大的节省了生产成本。最近几年来芽孢杆菌发酵生产乳酸受到人们的关注。Danner等［16］采用嗜热脂肪芽孢杆菌菌株FA6和IFA9,以葡萄糖为碳源，分批培养发酵生产L一乳酸，糖的转化率分别为84.0%和98.7%。Poyat等［17］报道：筛选得到能在52°C生长的一株凝结芽孢杆菌TB04，能在培养基不灭菌的条件下发酵生产乳酸，经发酵条件的优化，乳酸的最终浓度55g/L，糖的转化率为92%。路福平等［18］发表了芽孢乳酸菌凝结芽孢杆菌TQ33的筛选及产酸条件的研究结果，其最适生长温度45C—50C，厌氧条件下，以葡萄糖为碳源发酵L一乳酸，72h产酸量最高达到67.8g/L，其中L一乳酸含量占96%以上。1.3.5发酵中和剂新兴的发酵工艺如提取与发酵相偶联的原位分离ISPR技术等，发酵的同时提取乳酸，减轻产物抑制，又不产生废弃副产物，但对设备要求较高，工艺复杂，设备投资大，因此对成熟低成本的传统发酵工艺进行改进后仍可在现阶段继续用于生产。传统乳酸发酵常用中和剂消除终产物乳酸的抑制，如碳酸钙，氢氧化钙，氨水，氢氧化钠等。其中碳酸钙成本低，简单易用，应用广泛，但最终会产生硫酸钙对环境不利；氢氧化钙则难于添加且不利于局部pH控制，最终也产生硫酸钙因此应用不多；氨水不产生副产物，容易控制，但发酵存在糖酸转化率偏低，发酵残糖偏高等缺点；应用氢氧化钠则成本偏高，菌体活性较差。1.3.6L一乳酸提取工艺［19］L一乳酸发酵液的成分复杂，除L一乳酸外，还包括菌体、残糖、蛋白质、色素、胶体、有机杂酸、无机盐等，所以L一乳酸的提取比较复杂。常用的方法有如下几种。1.3.6.1钙盐法乳酸钙结晶一酸解工艺是传统的分离方法。其流程见图4,“°碱化处理i化/菌体滤渣发酵液 过滤( 右、滤液一浓缩一结晶一离心洗晶一复溶I, zCaSO4滤渣酸解脱色一过滤，

脱色"浓缩一离子交换”浓缩图4乳酸钙结晶一酸解工艺流程图该工艺虽具有易于控制、工艺成熟的优点，但其流程长，硫酸及活性炭的用量大，副产物量大，劳动强度高，不能有效分离残糖，且产品收取率低。也有浓缩液不结晶而直接用硫酸酸解乳酸钙提取乳酸的工艺。1.3.6.2萃取法萃取法是使用不溶或微溶于水的有机溶剂，通过物理或化学萃取方式从粗乳酸中提取乳酸，然后再反萃取，把乳酸从萃取相中分离出来。萃取法不用石灰或石灰石和硫酸，所以不产生CaSO4废渣，有利于环境保护，操作简便，占地面积少，对设备腐蚀性小，无细菌污染和操作过程可自动化等优点。应用萃取法的关键是寻找高效、无毒、水溶性小、经济可行的萃取剂。用于乳酸萃取效果较好的载体为一种水不溶性的长链叔胺，并将载体溶于油醇后去萃取乳酸，于是载体与乳酸形成乳酸胺络合物，后被有机相萃取分离，再经反萃取，即可获得纯净的稀乳酸液，浓缩蒸发后即为成品L一乳酸。近年来，国内外开发出许多新的萃取技术，如双水相萃取、膜萃取和超临界萃取等。1.3.6.3酯化法经钙盐法提取的乳酸不能满足一些对乳酸有耐热性要求的工业用途如用于聚合物工业、焙烤食品以及其他一些附加值高的乳酸产品。将钙盐法提取后的乳酸产品在高温条件下进一步同乙醇或甲醇反应，产生乳酸乙酯或甲酯，再蒸馏分离出乳酸酯，然后水解乳酸酯、提纯回收乳酸，水解时释放出的醇则可重复利用。稀乳酸经浓缩蒸发就可制成高纯度、耐热性好的乳酸，日本武藏野公司已成功将该法运用于L一乳酸的工业生产中，该方法缺点是能耗较高，装备的投资也较大。1.3.6.4吸附法离子交换树脂、活性炭和聚乙烯毗啶都被用作吸附剂，不过活性炭吸附容量小，选择性差，重复性差，而离子交换树脂选择性高、交换容量大、操作简单、易于自动控制。吸附法的缺点在于不具备高度专一性，且脱附困难。1.3.6.5分子蒸馅法分子蒸馏属于高真空蒸馏技术，它克服了常规蒸馏分离效率低、操作温度高、受热时间长导致有效成分的聚合、分解等缺点，特别适合于高沸点、热敏性及易氧化物质的分离。通过分子蒸馏提纯L一乳酸，可以达到蛋白质、重金属离子清除、脱臭、脱色、提纯等目的，得到的乳酸也具有较好的耐热性。1.3.6.6电渗析法电渗析技术不仅可以用于偶联发酵，也可单独用于发酵液分离提纯乳酸。电渗析法是在离子交换技术与膜技术基础上发展起来的一种新的分离提纯技术。欧美率先将该技术运用于L一乳酸等有机酸的提取，在L一乳酸的提取过程中使用单极电渗析的目的是分离电解质和非电解质；浓缩乳酸盐，用双极电渗析的目的是最终将乳酸盐变成高纯度的乳酸，并回收碱回用到发酵罐中调pH值。该技术的最大优点是分离提纯效果好、回收率高、产品质量好，其缺点是能耗高，可以说是极具前景的方法。目前采用该技术的最大困难是日本和美国垄断了离子交换膜，特别是双极膜的生产技术，将装备的售价提得较高。1.3.7L一乳酸的检测方法目前，利用酶膜生物传感器进行L一乳酸的检测［19］是比较适用、方便的方法之一。其基本原理是固定化酶能特异性的作用于L一乳酸：L—乳酸+O2+H2O固定化L一乳酸氧化酶a丙酮酸+H2O2先用标准溶液标定，然后测定经过离心、稀释的发酵液（使终浓度W0.5mg/mL，pH6〜8）,由定量进样针吸取25aL,并注入反应池，含有样品的底物在样品池中迅速按照一定比例混合均匀，底物透过酶膜圈的外层与固定化酶层接触并反应，放出的h2o2,透过酶膜圈的内层与白金一银电极接触，并产生电流信号，该电流信号与底物浓度在一定范围内成线性比例关系，因此可以计算出L乳酸的含量。发酵法生产L一乳酸的原料乳酸作为廉价大宗化工原料，生产成本决定了其应用范围，选用廉价原料降低生产成本是每个乳酸生产企业必然考虑的问题。当前国际上研究的废弃产物原料主要包括乳清、糖蜜、淀粉质原料、纤维素类原料等。除米根霉发酵过程中营养要求相对简单以外，乳酸细菌由于其相对苛刻的营养需求，在生产过程中往往需要添加各种不同营养元素，其中包括有机氮源、微量元素等来促进乳酸细菌的生长。通常情况下乳酸细菌发酵过程中添加酵母膏、蛋白胨、玉米浆等复合营养以及Mg2+、Mn2+、Fe2+等一些有利于乳酸细菌生长的金属离子或者磷元素等都可以有效地促进产酸。廉价原料生产L一乳酸的研究利用废弃以及廉价的原料来生产L一乳酸，既降低了L一乳酸的生产成本，同时又解决了废弃物的处理及污染问题，一举多得，很多学者和研究机构都对此进行了大量研究。乳清是乳品加工业的副产品，每生产1kg干酪就副产9kg乳清，其中含有丰富的蛋白质、碳水化合物、无机盐、维生素等营养物质，这些营养成分能很好地促进许多微生物的生长，也使其在微生物发酵方面得到广泛研究。糖蜜是制糖工业的副产品，100t的甘蔗可以生产出3〜4t糖蜜，同样的甜菜则可以产生4〜6t糖蜜。糖蜜中的主要成分是蔗糖，还含有一些葡萄糖、果糖以及其它能溶于水的有机物和无机物，因为其中含有丰富的糖分和营养使其在作为发酵原料方面得到广泛研究。淀粉质原料及纤维质原料可经糖化后供发酵，米根霉能直接利用淀粉质原料，这对于利用废弃物或者廉价原料来说是优良的菌株。淀粉及纤维素质原料是目前用量最大的发酵原料，包括玉米，玉米芯，甜高粱，糙米，红薯，土豆等，这其中又由于玉米光合效率高，产量大，种植面积广，种植收获运输储藏成本都相对低廉，而成为全世界最大的发酵原料。其他废弃物如：酿酒厂废弃酵母，厨房餐饮垃圾，浓醪酒糟，麸皮，甘蔗渣，秸秆等也能用于乳酸发酵，并有相关研究。对菌种的改造菌种是发酵的根本，通过理化诱变，代谢工程控制，原生质体融合及基因工程改造等对菌种进行改良似乎是发酵工业的必经之路。L一乳酸高产菌株应具有以下生化特征：①较高的乳酸脱氢酶活性，弱化的丙酮酸脱氢酶系；②能耐高浓度的乳酸盐，不具有以乳酸为惟一碳源而生长的能力，不能利用丙酮酸作为碳氮源生长。3.1物理诱变物理诱变剂包括紫外线、x射线、Y射线、快中子、激光和超声波等。近年又有如微波、红外射线、激光、高能电子流和离子注人等新手段。较常用的是紫外和离子注入。3.1.1紫外线诱变DNA分子强烈吸收紫外线，可引起DNA链的断裂，DNA分子内部和分子间交联、核酸与蛋白质交联、嘧啶水合作用以及形成嘧啶二聚体等突变。乐晓洁等［20］人利用紫外线诱变方法，对出发菌株干酪乳杆菌YBQ1-1进行诱变处理，筛选得到了一株正向突变株YBQH2—14,其L—乳酸产量达到93g/L，对糖的转化率达77.5%。比出发菌株产酸提高48.5%。福州大学杨虹［21］利用淀粉一酸性培养基富集培养，并结合高锰酸钾一漠花钾平板检出方法从土壤筛选出产乳酸81g/L的根霉R—2菌株，以其为出发菌株经紫外线诱变，从琥珀酸平板上获得R—2—91，以葡萄糖为碳源的情况下产酸103g/L，对糖的转化率为68.9%。3.1.2电离辐射诱变可用于微生物诱发突变的电离辐射有X射线、Y射线和快中子等。射线具有穿透力，能产生几万伏至几百万伏的电磁辐射能量。快中子是由中子穿过物质的原子时，把原子核中的质子撞击出来而产生的，由于快中子能产生较大的电离密度，能有效地导致基因突变和染色体畸变。比较理想的射线源有60Co和】37Cs。浙江工业大学吴石金等［22］通过60Co、射线和紫外线诱变处理米根霉，得到L—乳酸高产突变株Rhi3—2，最高产量88g/L。3.1.3离子束诱变离子束生物工程是20世纪80年代中期兴起于我国的边缘交叉学科，它主要是研究低能离子即能量在100keV以下的离子与生物体的相互作用。离子束注人生物体，可同时向生物体某个局部输入能量、物质和电荷。这种物理、化学和生物学的联合作用将强烈地影响生物细胞的生理和生化性能，其诱发突变率明显高于物理诱变或化学诱变的单独作用。刘勇军等［23］采用新的物理诱变源一N+离子注入，对出发菌株乳酸细菌LB1进行诱变改良，获得一株L—乳酸产量比出发菌株高2倍的突变株LB1—1。中科院等离子研究所古绍彬等［24］以葡萄糖为碳源对PW352菌株特性进行了研究，并在此基础上采用离子束诱变的方法，对米根霉PW352进行改良，获得高产L—乳酸菌株RE3303,产酸能力达131〜136。最高可达140g/L，糖的转化率为86%〜90%，产酸PW352提75%。3.2化学诱变化学诱变剂包括碱基类似物、烷化剂、脱氨剂、移码诱变剂、羟化剂和金属盐类等。化学诱变所用诱变剂量小，突变频率高，且具有较强的专一性，突变遗传性状稳定，可以缩短育种进程。目前经常采用的化学诱变剂主要是亚硝酸、硫酸二乙酯DES和亚硝基胍NTG。徐子钧等［25］以代谢调空发酵理论依据，利用紫外线，亚硝基胍，DES等理化因.子对乳酸菌进行复合诱变，再用高浓乳酸钙平板、纯乳酸平板、琥珀酸平板筛选得到一株高产L一乳酸的正向突变株M7，平均发酵产量为90g/L，比原菌株产量提30%，对糖的转化率为88.9%。郑艳等［26］以初筛得到的一株干酪乳杆菌鼠李糖亚种突变株R2为出发菌株，经紫外线、硫酸二乙酯，复合诱变处理，筛选出产乳酸较高的突变株ZY，L一乳酸产量达9.57g/200m1。L一乳酸含量达93.9%，糖的转化率达96.3%。3.3基因工程技术基因工程是指将一种或多种生物体(供体)的基因在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体(受体)内，使之按照人们的意愿遗传并表达出新的性状。随着DNA重组技术的发展，在乳酸菌的选育中利用该技术构建乳酸菌株也不乏实例。Hakki&Akkaya等［27］报道了米根霉的基因工程菌构建的研究结果。作者采用乳酸乳球菌的乳酸脱氢酶基因的DNA序列设计了引物，采用反转录一聚合酶链式反应(RT—PCR)扩增了米根霉乳酸脱氢酶基因的片段，编码接近为72%，以此为基础进行米根霉基因工程菌生产乳酸的开发研究。ChristopherD.Skory［28］从米根霉中分离克隆出编码NAD+依赖型的L一乳酸脱氢酶(L—LactateDehydrogenase，L—LDH)的两个基因ldhA和ldhB，这两个基因不包含内含子，并且有超过90%的核苷酸序列是相似的。这是第一次对菌类的乳酸脱氢酶进行详细描述。ChristopherD.Skory通过对各种LDH序列进行比较后发现ldhA和ldhB不同于以前分离的真核生物和原核生物的Ldh基因。在对乳酸发酵过程中的蛋白质测序中发现，ldh编码一个36kDa的蛋白质，它能将丙酮酸盐转变为乳酸盐。当以葡萄糖为碳源时ldhA最多，依次是木酮糖和海藻糖。但是在这些碳源培养基中却没有发现ldhB的转录产物。当米根霉生长在丙三醇、乙醇和乳酸盐上时发现有ldhB转录的蛋白质。ChristopherD.Skory于是假设ldhB编码了第二种NAD+依赖型的乳酸脱氢酶，这种乳酸脱氢酶能将L一乳酸转变成丙酮酸盐，而且只有在不发酵培养基中才会产生°ChristopherD.Skory将ldhA和ldhB这两个基因成功的导人大肠杆菌(Escherichiacoli，ldhApf1)突变体中，这些大肠杆菌在厌氧条件下生长，并且能够产生乳酸。KariKyla—Nikkila等［29］在研究瑞士乳杆菌(LactobacillushelveticusCNRZ32)和植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)中的乳酸脱氢酶ldhD和ldhL时发现，如果让瑞士乳杆菌中ldhD基因沉默不表达，那么L一乳酸产量会增加一倍；如果在植物乳杆菌中增加ldhL基因的拷贝数，会导致L一乳酸脱氢酶的大量增多，但是对乳酸产量却几乎没有影响°Ferain等［30］进一步研究发现，在植物乳杆菌中阻止ldhD基因的表达并不能有效的影响乳酸的总产量。Davidson等［31］

发现只有在乳酸乳球菌(LactococcusLactis)中，当ldhL基因作为las操纵子的一部分时，整个操纵子的拷贝数会增加，并且会使得乳酸产量也有部分增加。Dong等［32］报道了基因工程菌E.coliRR1的构建研究结果。从干酪乳杆菌中提取的L一乳酸脱氢酶被转入到缺少D一乳酸脱氢酶和磷酸转乙酰酶的受体菌株中，这个重新整合的菌体只产生L一乳酸，而不产生D一乳酸。湖北工业大学周胜德等等人通过基因工程的方法先后构建了分别产D一乳酸和L一乳酸的大肠杆菌。在大肠杆菌株中利用基因敲除的方法删除了focA-pflB、adhE,frdBC基因，又通过基因突变的方法使ackA基因失活，从而构建了一株产纯D一乳酸的菌株SZ63(focA-pflBfrdBCadhEackA)［33］。同年他们在该变异菌株SZ63的基础上将乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)中的L一乳酸脱氢酶的编码片段和终止子转入大肠杆菌中ldhA基因的启动子的下游，替代了大肠杆菌原有的D一乳酸脱氧酶基因，成功构建了产L一乳酸的SZ79等多株菌株，并通过进一步的选育，培育出了一株L一乳酸的高产菌株SZ85。该菌株在只含葡萄糖及无机盐的培养基中对糖的总转化率达到94%，产物中L一乳酸的含量达到99%，但L(+)一乳酸的光学纯度超过了99%。同条件下，以木糖作为发酵原料时，产量虽低于以葡萄糖为原料时的发酵产量，L(+)一乳酸产率也较高(总糖转化率为82%)，光学纯度也达到了99%［34］发酵产L一乳酸的工艺进展乳酸发酵时由于不断生成产物(乳酸)而使发酵液的酸度上升，导致形成对菌体生长和乳酸的形成产生抑制作用，传统发酵方式通常是加入碳酸钙等中和剂进行中和，但这不仅增加分离提取的困难，而且影响产品质量，并且造成了严重的污染。为了提高乳酸产率，改进分离过程，降低能耗和成本，减少环境污染，近年来围绕乳酸生产的各个单元过程展开了许多研究，发展了一些有代表性的新工艺。4.1连续发酵4.1连续发酵"■I使用维持一定细胞浓度的恒浊器以及保持一定基质浓度的恒化器可以进行乳酸的连续发酵。Bawmanes化学有限公司采用连续发酵乳酸的工艺，在2L连续发酵装置上，每天置换1.5倍体积培养液，实现连续操作了64天。林建平等［35］对转盘反应器固定化米根霉连续发酵产L一乳酸进行了研究。结果表明：此方法进行乳酸发酵具有发酵速度快，得率高以及既能用于连续发酵又能用于间歇发酵等优点。4.2细胞固定化发酵采用固定化乳酸菌技术可以提高细胞浓度和产率。在固定化细胞颗粒或生物颗粒中，细胞被限制在特定的载体中而保留了较高的生物活性，产酸效率更高。制备固定化细胞的方法有：吸附法、共价结合法、交联法以及包埋法等4大类。吸附法以弱键连接，极易从支持物上脱离。而共价交联法由于细胞膜参与载体的共价连接，可能给细胞带来损坏，因此，这两种方法在食品产品中应用不多。而包埋法固定细胞具有很多优点，如：方法简便、条件温和、稳定性好、机械强度较好等。因此食品的生产中最常用的是包埋法。包埋法常用载体主要有聚丙烯酰胺、琼脂、

明胶、k一卡拉胶、海藻酸钠、聚氨酯等。以海藻酸钠为固定化材料具有固化、成形方便，对微生物毒性小，固定化细胞密度高等优点；以聚氨酯为固定化材料具有重量轻，相对用量少，固定化过程无需其他固定剂等优点，在多种细胞的固定化上得到了广泛的应用。Hang等早在1989年就采用海藻酸钙固定化米根霉孢子生产L一乳酸，最高产酸62g/L。Day等［36］将干酪乳杆菌的一个亚种进行细胞固定化，发酵糖蜜生产乳酸，也取得较好的效果。Dong等［32］采用聚氨酯泡沫法固定化米根霉发酵生产L一乳酸，速率比游离菌体提高了3倍。固定化方法简单易行所制得的细胞稳定性强，容易扩大生产。4.3原位分离发酵4.3原位分离发酵酵"Ml随着发酵的进行，乳酸的不断产生，发酵液的酸度逐渐升高，使得乳酸菌的生长和产酸受到抑制。为提高乳酸产率就需要保持高细胞浓度的同时及时从发酵液中移走典型的反馈抑制性产物乳酸。细胞循环发酵的思路，就是利用一定装置让成熟的发酵液流向后处理单元便于产物分离的同时，使菌体返回生物反应器内继续使用，并适时排除衰老的细胞，也称原位分离（insituproductremoval即ISPR）技术。总之，ISPR技术克服了传统发酵工艺中的产物抑制、生产成本高和使用中和剂产生副产物污染环境等缺点，是今后乳酸发酵工业的发展方向，减少生产环节，压缩生产成本是除提高产量和得率外改进发酵工业的又一主要目的，如今已发展了原料糖化与发酵同步进行的SSF技术，又出现了发酵与提取相耦合的多种ISPR技术，都大大的提高了生产效率，降低了生产成本，减少了生产环节和废弃物。4.3.1吸附发酵运用适当载体选择性吸附产物乳酸，就可以减少产物抑制，常用的有活性炭、离子交换树脂等。用固定化细胞发酵乳酸，将活性炭加入到柱型流化床生物反应器中，可以适时吸附分离乳酸，降低发酵液酸度。国内也开展了乳酸吸附发酵的相关研究。国产树脂D354具有选择性好、吸附容量大的特点，其分离效果与PVP树脂相同。Moldes等［37］将SSF技术与离子交换树脂吸附发酵液中乳酸相耦合，系统运作20h，乳酸产率达1.18g/L・h。4.3.2溶剂萃取发酵溶剂萃取发酵是在发酵过程中利用有机溶剂连续移走发酵产物以消除产物抑制的耦合发酵技术。它具有节省能源，溶剂选择性高等优点。有机溶剂载体主要有4种：如溶剂化载体、阴离子活性载体、阳离子活性载体以及整合型载体。用于乳酸萃取效果较好的载体有：HostarexA327（叔胺）、Alamine336（三辛胺和三葵胺的混合物）、AmbediteLA-2（仲胺）、Cyanex923（氧化三辛基磷和氧化三庚基磷的混合物）等。将这些载体溶于煤油、乙酸丁酯或油醇，于是胺载体与乳酸形成（1，1）、（2,1）、或（3,1）的乳酸一胺复合物，这些复合物在煤油中的溶解度很小。还可加入异葵醇或磷酸三丁酯等改良剂。Cyanex923则不需加改良剂。载体和乳酸形成特定的载体一乳酸复合物后，被有机相萃取，再用水、稀盐酸、稀硫酸或氢氧化钠溶液反萃取，即可获得纯净的稀乳酸液，经真空浓缩后即成为成品乳酸。目前国外较大型的乳酸厂家均采用有机溶剂萃取方式提取乳酸。近年来也有新的萃取发酵方法出现。Chen等［38］使用微孔中空纤维膜（MHF）溶剂萃取法，连续原位萃取乳酸。发酵菌种用德氏乳杆菌NRRLB445,乳酸发酵原料用纤维素等，硫酸水解预处理。加纤维素酶同时糖化萃取发酵(SSEF)，这种工艺实际是两个工艺的组合：发酵液的SSF和流经MHF的萃取工艺。文献［39］报道，利用双液相萃取法进行乳酸发酵，将聚乙二醇(PEG)水溶液和羟基醚纤维素(HEC)水溶液加入发酵液中使乳酸和菌体分离，HEC对细胞的生长无影响。该工艺与间歇发酵相比，乳酸产量提高15%。4.3.3电渗析发酵电渗析发酵(EDF)是在离子交换技术与膜技术基础上发展起来的一种新的分离提纯与发酵相耦合的技术，用电场使离子选择性通过交换膜，以减少产物抑制。与离子交换不同的是，电渗析依靠电场的推动力，并且将具有选择性透过的离子交换膜代替离子交换树脂。电渗析发酵可以在不引入酸的条件下，将有机酸盐转化为有机酸，减轻了产物抑制作用，并回收利用碱溶液，缩减了现行的碳酸钙中和发酵，发酵液浓缩、乳酸钙结晶和乳酸钙酸解等道工序，能够降低生产过程能耗，减少环境污染，有利于提高L一乳酸的生产效益。但乳酸菌常附着到阴离子膜上，使电渗析效率下降，细胞固定化技术可以解决这个问题。EDF发酵系统主要由发酵罐、电渗析装置、pH控制装置、直流电源、微孔过滤装置、浓缩液贮存罐、循环泵等组成。发酵液?日值由pH控制装置控制，电渗析装置原理如图5。C一C一阳离子交换膜；D一不锈钢阴极;A一阴离子交换膜；B一双极膜；E一钛涂钉阳极；L—一乳酸根离子；NaL一乳酸钠；HL一乳酸图5双极膜电渗析原理示意图4.3.4膜法发酵膜法发酵使发酵和分离过程相耦合，细胞循环使用，乳酸从发酵罐中连续移走，使发酵过程的细胞浓度保持较高的水平。细胞循环可以使用不同类型的膜，如渗析(依靠扩散排阻)、微滤和超滤(依靠分子排阻)等。Danner等［40］设计了超滤膜生物反应器(MR)耦联一单极电渗析箱(ED)，构成MBR—ED单元操作系统，对能利用乙糖和戊糖的嗜热脂肪芽孢杆菌BS119进行连续发酵生产乳酸的研究。结果MBR—ED单元操作系统使乳酸浓度达到115g/L。在运行1052h后并未测出有微生物的污染。文献［41］报道了，用细胞再循环反应器进行连续的膜分离，形成的乳酸被连续排除，使培养基中的乳酸质量分数保持在12%。基本解决了产物抑制的问题。L-乳酸的广泛应用与市场前景［42、43］5.1在食品行业中的应用由于L一乳酸对人体无毒无副作用，而且易吸收，可直接参与体内代谢，酸性柔和且稳定，有助于食品的风味，因此L一乳酸及其衍生物，作为酸味剂、风味剂、乳化剂、杀菌剂、保鲜剂，pH调节剂、啤酒、糕点等广泛的应用于食品工业，占L一乳酸用量的一半以上。乳酸被美国FDA确认为安全(GRAS)优良的防腐剂和腌渍剂。可以用于清凉饮料、糖果、糕点的生产。乳酸水溶液可以延长禽肉和鱼肉的货架期。乳酸酯可作为乳化剂用于烘烤食品中，如用于面包生产，使面包质地松软、细腻，还可以延长其货架期。乳化剂生产需要热稳定性乳酸，只有合成热稳定的乳酸才可以满足要求，在啤酒生产中，使用磷酸等有机酸调节pH，已全部改用乳酸。含乳酸的饮料因有益健康而在全世界都大有市场。5.2医药行业的应用L一乳酸可直接配置成药物或制成乳酸盐使用，由于乳酸对人和畜无害，而且有很强的杀菌作用，因而，乳酸可直接用作室内外环境、饮食、手术室、病房、实验室、车间等场所的消毒剂。L一乳酸、L一乳酸钠与葡萄糖、氨基酸等复合配置成输液，可治疗酸中毒及高钾血症。L一乳酸钙吸收率大于其他补钙产品，是理想的钙强化剂；L一乳酸亚铁溶解性好，安全性高，吸收率高，是目前人体吸收率最好的铁质强化剂；L一乳酸锌对提高儿童智商、加速生长发育、促进食欲、增强机体免疫力和抗病能力，增强创伤组织的再生能力，以及维护性器官发育起着重要作用；L一乳酸钾可作为增香剂，抗氧化增效剂，在强化运动员的健康饮汁、果汁、减肥食品中都有无与伦比的效果。由聚乳酸制成的手术缝合线、生物植片、药物缓释剂等在临床上都被广泛应用。5.3在轻工、化工、化妆品行业的应用可作为纺织品的助染料剂，增加光泽，使触感柔软。在电子、航空和航天及半导体工业中作为精细金属清洁剂。在皮革工业中，可用40%乳酸除去鞣皮中石灰，使皮革柔细密，提高皮革质量。在卷烟工业中，可用乳酸除去烟草中杂质，清除辛辣味，改善口味，提高烟草档次以及在造纸、油漆、油墨、电镀等工业中都有广泛应用。在化妆品和清洁卫生用品方面，乳酸可作为滋润剂、皮肤增白剂、保湿剂抗菌剂、乳化剂、延长产品的保质期等，作为一种十分重要的羟基酸，在配制清洁霜、嫩肤霜、浴液时，用于PH值调节，对改善皮肤组织结构，消除皱纹，色斑、治疗皮肤干燥、痤疮等有显著疗效。5.4在农业上的应用由发酵获得的阻乳酸氨溶液，可直接作为青贮料添加剂，应用于农业饲料。另外L一乳酸还可以作为植物生长活力剂，水产用生菌剂等应用于农、渔业上，具有十分诱人的的开发前景。国外有的公司在尿素中添加乳酸等直接用于生产家畜饲料。5.5可生物降解材料聚乳酸生物工程材料聚L一乳酸是以L一乳酸为原料合成的高分子材料，无毒，具有良好的生物相溶性，可生物降解吸收，强度高，可塑性加工成型。它易被自然界中的各种微生物或动植物体内的酶分解代谢，最终形成二氧化碳和水，不污染环境，因而被认为是最有前途的可生物降解高分子材料。5.5.1可生物降解塑料为解决塑料废弃物对环境造成污染问题，可生物降解塑料已经在许多国家开始研究与应用。聚乳酸塑料可用作生产农用薄膜、食品包装袋、保鲜膜、餐盒、塑料容器等。此外聚乳酸有望在不久的将来代替聚氯乙烯PVC、聚丙烯PP、聚苯乙烯PS等各种不可降解的塑料，以消除“白色污染”所造成的环境危机。5.5.2可生物降解医用材料及药物人类对医用高分子材料的需求日益增大，特别是用于人体内的高分子材料要求较高，需具有良好的物理化学性能，还要求与人体组织有良好的相溶性，有相当的机械强度及耐久性，可经受各种消毒处理及良好的加工性能，无毒副作用等。聚乳酸材料具备了这样的条件，因此正在开发应用于生物医学领域如个人卫生用品及药物控制释放体系、医用外套、以及手术缝合线、骨科固定、组织修复等可避免需要二次手术拆除的医用材料。用特殊方法制成的聚乳酸微球是一种性能优良的新型功能材料，具有表面效应、体积效应、磁效应、生物相容性、功能基团等特性，在固定化酶、靶向药物、免疫分析、细胞分离、高级化妆品、环境友好型高效催化剂等方面，有广阔的应用前景，具有能控制制剂微粒粒径、控制药物释放速度、延长药物作用时间、减少药物不良反应、降低用药剂量等优点，还可用于特定组织和器官的药物靶向释放等。如采用乳化分散法制备利福平PLA微球，可缓慢地以接近恒速释药，释放速度与PLA平均分子量、微球载药量、微球粒径、附加剂等因素直接相关，可望发展成为疫苗控释体系，一次注射可完成全程免疫，有巨大的应用价值。再如酮洛芬PLA微球有助于减轻口服酮洛芬普通片产生的毒副作用，丙酸睾丸素PLA微球的体外释药可维持缓释达3个月。5.6乳酸衍生品乳酸乙酯/丁酯，乙烷基乳酸可用作绿色溶剂，具有高沸点、无毒、可降解等特点。5.7L-乳酸的市场前景展望L一乳酸的用途广、品质优、正逐步取代DL一乳酸乳酸。乳酸为世界上公认的3大有机酸之一。由于乳酸与深加工产品应用领域的开拓，已使它在全世界范围内供不应求，市场缺口迅速扩大。八十年代，全世界需L一乳酸仅4万吨，九十年代初突破10万吨，目前已增加到50万吨左右。市场需求稳步扩大。6.进一步开发建议综上所述，L一乳酸产业是目前国内外研究的热门课题，乳酸的发酵工艺已基本过关，乳酸的提取技术也有所突破。但存在的主要问题是：发酵产酸率低，生产成本偏高；分离、提取设备落后，产品质量不稳定。总体上乳酸生产技术与国外有一定的差距。这一定程度上阻碍了我国乳酸行业的发展。因此，建议今后应从以下方面还进一步深入研究。一个优良的生产菌株是提高产品产量、质量和经济效益的保障。因此，一方面应该继续进行野生型乳酸生产菌株的筛选开发工作；另一方面应该将传统的诱变育种技术和分子生物学基因工程等先进的生物学手段来改造乳酸生产菌株，定向的选育能够在低pH和高产物浓度中发酵高产L—乳酸的优良菌株。对用廉价的农林业废弃原料来生产L一乳酸提起足够的重视，要有效的降低乳酸生产所需的原料成本，减少一些可综合利用的废弃物排放到环境中所引起的污染问题。建立更加经济合理的乳酸分离提取工艺，提取工艺的差别对乳酸生产成本的减少起着十分重要的作用，这一步需要与发酵工艺和设备改进积极结合，尤其是在使用新型发酵工艺和设备的时候，建立与之相配套的分离纯化工艺，对于降低乳酸生产成本的作用是十分积极的。参考文献金其荣，张继民，徐勤.有机酸发酵工艺学[M].北京；中国轻工业出版社，2000.⑵赵连祥，赵征.乳酸菌及其发酵制品生产技术[M].天津科技出版社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