比色与吸光光度法

比色与吸光光度法教学指导：吸光光度法简介吸光光度法基本原理可见分光光度法及其仪器吸光光度法应用1/13/20232比色与吸光光度法吸光光度法（AbsorptionPhotometry）：基于物质对光的选择性而建立的分析方法。包括比色法、紫外可见分光光度法、红外分光光度法。广泛用于无机物和有机物的定性和定量分析。目视比色法→光电比色第一节吸光光度法简介1/13/20233比色与吸光光度法分光光度法特点：灵敏度高：试样中1%-0.001%微量成分准确度较高：相对误差2%-5%（1%-2%）。；几乎所有的无机离子有许多有机化合物；操作简便、快速、仪器价格适中、用途广。1/13/20234比色与吸光光度法第一节吸光光度法简介一、光的基本性质1、光的波粒二象性波动性：光以波的形式传播，可用波长、频率来表示。波长：两个相邻波峰或波谷间的距离（nm）频率：单位时间里通过一固定点处波的数目（s-1）=c/

光速c=3×1010cm/s1/13/20235比色与吸光光度法第一节吸光光度法简介粒子性：光由光子组成，具有能量。△E=h=hc/

h为普朗克常数6.63×10-341/13/20236比色与吸光光度法2、光谱分区能量小200nm400nm780nm大波长光谱区域紫外光区可见光区红外分析方法紫外分光光度法可见分光光度法50um红外分光光度法紫、蓝、青、绿、黄、橙、红1/13/20237比色与吸光光度法二、物质对光的吸收1、物质对光选择性吸收的实质一束光通过某物质时该物质的分子、原子或离子与光子发生碰撞，光子的能量转移至分子、原子或离子上，使这些粒子发生能级变化，由基态跃迁至较高能态，这个过程即为吸收。光是否被物质吸收，取决于光子的能量物质的结构只有当能级差△E与光子能量h相当时物质吸收光。1/13/20238比色与吸光光度法2、物质的颜色与光吸收的关系复合光与单色光单色光：具有单一波长的光。复合光：由不同波长的单色光按一定比例组成的光如白光。1/13/20239比色与吸光光度法溶液颜色与光吸收的关系溶液对光的吸收：若溶液透明、均匀，人眼看到的溶液颜色是由透射光的波长决定的。当入色光为白光（复合光），溶液吸收的光与透射的光互补。互补色：组成白光的两种光。光的互补：蓝黄1/13/202310比色与吸光光度法互补色示意图

蓝450-480

紫400-450

红650-750青蓝480-490

青490-500

绿500-580

黄580-600

橙600-650白光1/13/202311比色与吸光光度法溶液对光的作用示意图1/13/202312比色与吸光光度法溶液颜色与吸收光颜色和波段的关系溶液的颜色

吸收光颜色波段（nm）黄绿黄橙红紫红紫蓝青蓝青紫蓝青蓝青绿黄绿黄橙红400~450450~480480~490490~500500~560560~580580~600600~650650~7601/13/202313比色与吸光光度法721型分光光度计1/13/202314比色与吸光光度法3、吸收曲线（吸收光谱）吸收曲线：吸光度随波长变化的曲线。吸收曲线的特点：不同的物质因其分析结构不同而具有不同的吸收曲线；同一物质，浓度不同，其吸收曲线的形状和λmax的位置不变，但在同一波长下吸光度随浓度的增大而增大。吸收曲线是吸光度法选择测量波长的依据。1/13/202315比色与吸光光度法吸光度A吸收曲线图4005006001/13/202316比色与吸光光度法1/13/202317比色与吸光光度法1.朗伯—比耳定律布格(Bouguer)和朗伯(Lambert)先后于1729年和1760年阐明了光的吸收程度和吸收层厚度的关系。A∝b

1852年比耳(Beer)又提出了光的吸收程度和吸收物浓度之间也具有类似的关系。A∝c

二者的结合称为朗伯—比耳定律。第二节吸光光度法基本原理1/13/202318比色与吸光光度法朗伯—比耳定律吸光度A：表征物质对光吸收程度的量。

A=lgIi/I0=-lgT=bcA--吸光度--摩尔吸光系数C--被测物浓度Ii--入射光强T--透过率

b--液层厚度（光程长度）

I0--透射光强1/13/202319比色与吸光光度法例：用1,10-二氮菲光度法测定铁，已知Fe2+浓度为，比色皿厚度2厘米，在=508nm测得配合物吸光度，求。（1.1×104-1-1）1/13/202320比色与吸光光度法朗伯—比耳定律适用条件：入射光为平行单色光，且垂直照射；吸光物质为均匀非散射体系；吸光质点之间无相互作用；辐射与物质之间的作用仅限于光吸收过程，无荧光和光化学现象；吸光度具有加和性（A总=A1+A2+…）。。1/13/202321比色与吸光光度法2、标准（工作）曲线标准（工作）曲线绘制方法：在、b固定的情况下，测定一系列不同浓度的标准溶液的吸光度，作A~c图，在相同条件下测定样品溶液的吸光度，从曲线上可查出被测样品的浓度。1/13/202322比色与吸光光度法工作曲线图浓度（c）吸光度1/13/202323比色与吸光光度法浓度c正偏离负偏离吸光度工作偏离图1/13/202324比色与吸光光度法偏离原因：非单色光引起的偏离：L—B定律要求入射光为单色光，但目前仪器提供的入射光是由波长范围较窄的光带组成的复合光。非平行入射光引起的偏离介质不均匀引起的偏离化学因素引起的偏离：高浓度时引起溶液中吸光粒子之间相互作用上升，使吸光能力发生变化；化学反应引起的偏离。

1/13/202325比色与吸光光度法第三节可见分光光度计光源吸收池检测器

单色器数据处理系统一、可见光分光光度法一、仪器结构框图1/13/202326比色与吸光光度法1、光源基本要求：在仪器工作的波长范围内，提供连续、有足够发射强度和良好稳定性的复合光，而且发射光的强度随波长的变化应尽可能小。常用光源：钨丝灯和卤钨灯，可使用的波长范围在360~2500nm。1/13/202327比色与吸光光度法2、单色器单色器作用：从光源发出的复合光中分出所需要的单色光。单色器组成：由入射狭缝、准光器（透镜或凹面反射镜使入射光成平行光）、色散元件、聚焦元件和出射狭缝等组成。单色器的核心部分是色散元件（如玻璃棱镜和光栅），起分光的作用。1/13/202328比色与吸光光度法

吸收池用于盛放分析试样；可见光区只能用玻璃吸收池；吸收池的光学面必须完全垂直于光束方向；吸收池要配对。因为吸收池材料本身吸光特征以及吸收池的光程长度的精度等对分析结果都有影响。3、吸收池1/13/202329比色与吸光光度法

检测器的功能：检测信号、测量单色光透过溶液后光强度变化。常用的检测器有光电池、光电管和光电倍增管等。4、检测器1/13/202330比色与吸光光度法型号

价格（万元）波长，nm分光器件数据处理指示产地7210.18360~800棱镜表头上海三分7220.28330~800光栅微机数显上海三分760CRT7.21190~900光栅PC打印扫描显象管上海三分751G0.91200~1000棱镜微机打印表头上海分析GDZ12.3200~800全息凹面光栅微机数显北京地质WFZ-122-10.7340~600光栅微机数显北京地质WFJ-80-10.3360~800棱镜PC打印扫描数显北京二分国产常用紫外可见分光光度计1/13/202331比色与吸光光度法721型分光光度计1/13/202332比色与吸光光度法722型分光光度计1/13/202333比色与吸光光度法1/13/202334比色与吸光光度法分光光度计的使用

预热20min。调节T=0。调节T=100%（A=0）。测定样品的吸光度A。1/13/202335比色与吸光光度法分光光度计的保养与维护安置在干燥、无污染的地方；仪器内的防潮硅胶应定期更换或再生；仪器停止工作时，必须切断电源，应按开关机顺序关闭主机和稳流稳压电源开关；比色皿使用完毕后，立即用蒸馏水或有机溶剂冲洗干净，并用柔软情节的纱布把水渍擦净；仪器经过搬动，请及时检查并纠正波长精度。1/13/202336比色与吸光光度法第四节吸光光度法应用吸光光度法主要应用于微量和痕量组分的测定，有时也用于某些高含量物质的分析。近年来用于多组分物质的分析、配合物的组成和稳定常数的测定等。1/13/202337比色与吸光光度法1邻二氮菲法测定微量铁

(邻二氮菲法主要用于测定铁)试样经溶解、分离干扰物质后，在试液中加入盐酸羟胺将铁全部还原为Fe2+，加入邻二氮菲显色剂，并加入HAc-NaAc缓冲溶液，pH约为，显色3~5min后，以试剂空白为参比溶液，于510nm波长处测定A值，在工作曲线上查得其含量，即可求得测定结果。

1/13/202338比色与吸光光度法2钢铁中锰的分析锰是钢铁中有益元素，在炼钢中是良好的脱氧剂和脱硫剂。它以金属固熔体MnS状态存在。试样用HNO3溶解，用H3PO4与Fe3+配合成无色的Fe(HPO4)2-，在催化剂AgNO3作用下，以(NH4)2S2O8为氧化剂，加热煮沸使Mn2+，氧化为紫红色的M