高效液相色谱法及超临界流体色谱法

本周实验安排实验地点：生物楼502，528第十章高效液相色谱法及超临界流体色谱法10.1概述10.2高效液相色谱法的基本原理10.3高效液相色谱法的类型10.4高效液相色谱仪10.5超临界流体色谱法10.6实验技术210.1概述HPLChighvelocity,highresolutionandhighsensitivityHigh-PerformanceLiquidChromatographyHigh-Pressure

LiquidChromatographyHigh-Price

LiquidChromatography34510.2HPLC的基本原理GC的基本理论、基本概念适用于HPLC。液相色谱的vanDeemter方程6涡流扩散项纵向扩散项传质阻抗项板高H越小，分离效率越高。可以从色谱柱、流动相、及流速等方面综合考虑，提高HPLC的柱效的措施采用颗粒小而均匀的填料，填充均匀；采用表面多孔的填料，减小填料的孔隙深度；流动相采用小分子溶剂，减小粘度(

H2O、ACN、MeOH)；适当提高柱温，增大Dm；采用一定的流动相流速u(一般1mL/min)7柱外效应：柱前峰展宽＋柱后峰展宽柱前峰展宽＝进样及进样器到色谱柱连接管引起柱前后展宽＝检测器流通池和连接管引起10.3HPLC的类型I液液分配色谱法

Liquid

LiquidPartitionChromatography,LLPC固定相与流动相均为液体(互不相溶)；基本原理：组分在固定相和流动相上的不同分配而实现分离；固定相：早期涂渍固定液，容易流失，现较少采用；化学键合固定相：将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上。8（1）寿命长，固定液不易流失，柱稳定性高；（2）传质快，表面均一，无深凹陷，比一般液体固定相传质快；（4）选择性好，可键合不同基团改变其选择性；（5）耐受各种溶剂，有利于梯度洗脱；流动相类别流动相按极性分：极性(乙腈、甲醇、水)；弱极性(氯仿、乙酸乙酯)；非极性(己烷)；9正相色谱法反向色谱法采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。II液固吸附色谱法

LiquidSolidAbsorptionChromatography,LSAC10固定相：固体吸附剂（硅胶）基本原理：根据组分在固定相上的吸附作用的不同进行分离；样品分子(X)被流动相带入柱内，与流动相分子(S)在吸附剂的表面发生竞争性的吸附作用.吸附平衡常数K越大，保留值越大。LASC中，流动相：烷烃为底剂的二元或多元溶剂，己烷＋乙酸乙酯；己烷＋氯仿III离子交换色谱法IonExchangeChromatography,IECK越大，离子交换能力越强，固定相对被分析离子的保留越强；分析对象：离子(各种无机阴阳离子)：SO42+、NO3－、Cl－、Na＋、Mg＋等

有机酸碱、氨基酸11固定相：离子交换树脂(聚苯乙烯和二乙烯基的交联聚合物，硅胶键合离子交换剂)流动相：含有反离子的水溶液(柠檬酸根离子、CO3－、F－)基本原理：样品中离子与离子交换树脂的交换能力的不同进行分离；1213IV离子对色谱法

IonPairChromatography,IPC固定相：C18/C8上涂渍或在流动相中加入与溶质分子电荷相反的离子对试剂流动相：有机溶剂(甲醇/乙腈－水)加入离子对试剂离子对试剂：烷基铵类：(C4H9)4N+OH-

、C16H33(CH3)3N+OH-

(分析X－)

烷基磺酸类

：己烷磺酸钠C6H13SO3Na(分析X＋)基本原理：根据形成的离子对化合物在两相间分配不同而分离。14生成的离子对与固定相的亲和力越大，保留越强，出峰越后。分析对象：有机酸、有机碱等Column：IonPacNS1、NG1Eluent：2mMTBAOH,24%48%ACNin10minFlowrate：1.0mL/min Detection：Conductivity(suppressortype)Regenerator：10mNH2SO41.Methanesulfonicacid5.0μg/mL(ppm)2.1-Propanesulfonicacid8.63.1-Butanesulfonicacid8.74.1-Hexanesulfonicacid8.8 5.1-Heptanesulfonicacid8.9 6.1-Octanesulfonicacid8.9 7.1-Decanesulfonicacid9.10Retentiontime(min)12168µS0.0416234578.0反相离子对色谱分离有机酸V离子色谱法IonChromatography,IC固定相：离子交换树脂流动相：电解质溶液（高电导）分离原理：同IEC，离子交换后的洗脱液进入抑制柱后进行电导检测特点：抑制柱将样品离子转变成相应的酸、碱增加电导，将洗脱液变成低电导成分降低背景干扰。16分析对象：无机、有机阴阳离子、糖类、氨基酸等抑制器的作用废液BackGround：Na2CO3/NaHCO3

(700μS)NaF,NaCl,NaNO3Na2HPO4,Na2SO4～～RetentiontimeConductivityNaFNaClNaNO3Na2HPO4Na2SO4BackGround：Na2CO3/NaHCO3

(700μS)～～RetentiontimeConductivityHFHClHNO3H3PO4H2SO4RetentiontimeBackGround：H2CO3(15μS)Conductivity17抑制器安装在电导池之前提高待测离子的电导率：

Na+,Cl-H+,Cl-提高灵敏度降低背景电导(淋洗液):Na+,HCO3-H2CO3减少噪音Na+,OH-H2O18Y+Na+

抑制器的工作原理(阴离子)X-:

样品中的阴离子Y+:

样品中的阳离子H2OH2OOH-Na+Y+H2ONa+Y+

X-

Na+CO32-(样品,淋洗液)H+H++CO32-H++X-

至检测器H2CO3H+X-H+

+O2H2OH2

+OH-H2ONa+OH-,H2H2O,O2废液废液电极（－）电极（＋）纯水或来自检测器的流体

H+H+H+H+阳离子交换膜阳离子交换膜19H2OH2OH+

+O2H2OH2

+OH-H2O废液/气体废液H2OSO42-Y+

X-H+MSA-(样品e,淋洗液）OH-OH-MSA-SO42-X-OH-MSA-SO42-X-H+MSA-,O2H2O,H2H++OH-Y++OH-

H+

抑制器的工作原理(阳离子)

至检测器H2OY+OH-X-:

样品中的阴离子Y+:

样品中的阳离子电极（＋）电极（－）阴离子交换膜阴离子交换膜纯水或来自检测器的液体

2020VI空间排阻色谱法SizeExclusionChromatography,SEC22固定相：多孔性凝胶流动相：水溶液或有机溶液分离原理：分离组分的分子尺寸凝胶的孔径大小(葡聚糖凝胶，琼脂糖凝胶)动画特点：体积大的分子完全被排阻洗脱下来体积小的分子最后的被洗脱下来分析对象：高聚物，生物大分子（蛋白、核酸）VII亲和色谱法AffinityChromatography,AC固定相：固定相表面键合特异性配基流动相：类似LLPC（乙腈/甲醇、水等）分离原理：根据固定相对溶质的特异性吸附而分离分离过程：一般流动相携带试样亲和物与配基结合强洗脱能力的流动相洗脱亲和物（大分子）23分离对象：酶与基质（或抑制剂）抗原与抗体激素与受体外源凝集素与核酸的碱基对10.4高效液相色谱仪24仪器特点：高压、高效、高速分离对象：生物大分子、天然产物、高分子化合物、大多数高沸点有机化合物工作过程：高压输液系统核心部件：高压泵压力范围：30~50KPa。为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10m），液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的显著特点。25要求：1）输液精度高,调节范围宽

分析型0.1-10mL•min-1

制备型50-100mL•min-1

2）流量稳定（保持柱效和分析重现性）3）压力平稳、脉冲小（低背景噪音）4）耐酸碱腐蚀等特性，泵的死体积小26单柱活塞往复泵双柱活塞往复泵进样系统

要求重复性好、死体积小。普通进样装置：HPLC常用10μL注射器＋六通阀：自动进样器：

清洗、取样、进样、换样等过程自动完成，一次可放

置数十个试样。27色谱柱色谱柱：实现分离的核心部件，要求柱效高、柱容量大和性能稳定。柱性能与柱结构、填料特性、填充质量和使用条件有关。预柱(保护柱)：防止流动相或样品中的不溶性颗粒堵塞色谱柱色谱填料：经过制备处理后直径为5-10μm粒径的球形颗粒。色谱柱管：内部抛光的不锈钢管。典型的HPLC分析柱尺寸是内径4.6mm，长度有150mm和250mm。28色谱填料29色谱填料：由基质和功能层两部分构成。基质：又常称作载体或担体，通常制备成数微米至数十微米粒径的球形颗粒，对分离不起明显的作用，只是作为功能基团的载体。（硅胶和有机高分子聚合物微球）

功能层：是通过化学或物理的方法固定在基质表面的、对样品分子的保留起实质作用的有机分子或功能团。

十八烷基硅烷（ODS柱或C18柱）、辛烷基硅烷（C8柱）、氨基或氰基等HPLC检测器a.

紫外检测器Ultravioletdetector30DAD1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，得到三维立体谱图DAD可以得到三维的色谱光谱图像31荧光检测器

Fluorescencedetector灵敏度高，选择性好，灵敏度比UV高10~1000倍；要点：具有荧光或能形成荧光配合物分析对象：氨基酸、维生素、蛋白质等能发荧光的物质。32电化学检测(电导检测、安培检测)原理：两个对电极测量样品中离子型溶质的电导，由电导的变化测定溶质的浓度。要点：死体积小，灵敏度高，pH>7不够灵敏。33原理：利用待测物流入反应池时在工作电极表明发生氧化还原反应，两电极间有电流通过，电流大小与待测物质浓度成正比。要点：

具有电活性物质示差折光检测器differentialrefractiveindexdetector原理：样品组分的折射率与流动相折射率有差异，当组分洗脱出来时，会引起流动相折射率的变化，这种变化与样品组分的浓度成正比。要点：灵敏度低，不能用于梯度洗脱34蒸发光散射检测器evaporativelight-scatteringdetector,ELSD

35流出液雾化器雾化加热漂移管加热溶剂蒸发激光束照在溶质颗粒产生光散射散射光强只与溶质颗粒大小和数量有关。要点：通用型质量检测器，可用于梯度洗脱分析对象：适合于无紫外吸收、无电活性和不发荧光的样品的检测10.5超临界流体色谱supercriticalfluidchromatography,SFC36定义：以超临界流体为流动相的流动相的色谱分析法，具有GC和HPLC的优点，适于分析GC不能分析的高沸点、低挥发性的试样。超临界流体：

在高于临界压力与临界温度时，物质的一种状态。性质介于液体和气体之间。超临界流体即不是气体，也不是液体，而是一种介于二者之间的一种对分离很有利的流体。超临界流体的特性371）性质介于液体和气体之间;气体的低黏度，传质阻力小，可以快速高效的分离；液体的高密度，适于低温下分离热不稳定、分子量大的物质SFC的扩散系数、粘度和溶解力都是密度的函数，可通过改变SFC的密度调节组分分离，超临界流体的密度与压力有关。SFC的固定相和流动相38SFC色谱柱：填充柱dp:

3~10μm,Lcol:

25cm,内径:几mm

交联毛细管柱df:

0.05~1μm

,Lcol:

10~20cm,内径:0.05~1μm

SFC的固定相：固体吸附剂（硅胶）；键合到毛细管壁上的高聚物要点：CO2应用最广泛；无色、无味、无毒、易得、对各类有机物溶解性好，在紫外光区无吸收；缺点：极性太弱；加少量甲醇等改性；SFC的流动相：超临界流体色谱仪器39与HPLC差别：HPLC只在柱出口加压，而SFC整个都处于高压下，使流动相处于高密度状态；SFC必须装有毛细管限流器，以实现限流器两端相的转变高压泵无脉冲的注射泵，通过电子压力传感器和流量检测器，计算

机控制流动相的密度和流量；检测器

可采用HPLC的检测器(UV,FL)，也可采用GC的FID检测器.SFC中的压力控制40压力效应：在SFC中，压力变化对容量因子产生显著影响，超流体的密度随压力增加而增加，密度增加提高溶剂效率，淋洗时间缩短。

CO2流动相，当压力改变：7.0→9.0×106Pa，则：C16H34的保留时间：25→5min。程序升压SFC的应用I聚苯醚低聚物的SFC分析色谱柱：毛细管柱(10cm×63mi.d.)固定相：键合二甲基聚硅氧烷；流动相：CO2；柱温：120C；程序升压；SFC即可分析GC中不适用的高沸点、低挥发性样品和HPLC中缺少检测功能团的样品，它又比HPLC有更高的柱效和更快的分析速度。分析对象：天然产物、高聚物、表面活性剂等。SFC的发展现状43SFC的三次起落：1960’s的先驱性研究；1980’s初形成浪潮，认为会掀起分析方法的革命；目前，大公司纷纷撤去SFC分离设备，放弃进一步发展的计划。缺点：a.整个体系都要在高压下进行；b.流动相的选择有限(CO2)；c.仪器制造复杂，昂贵；G.Guiochon(AmericanLab1998,(9),14~15)指出成功和普及并成为定量分析方法必须具备：⑴易