植物离体快速培养 植物快繁

第5章植物离体快速繁殖和脱毒技术主要内容快速繁殖技术〔定义、实验程序、影响因素、应用〕植物脱毒技术〔原理、实验程序、鉴定、保存〕第一节植物快速繁殖技术快繁的定义快繁的技术程序影响快繁效果的因素快繁的应用一、快繁的定义快速繁殖〔rapidclonepropagation〕：也叫离体繁殖〔invitropropagation〕、微体繁殖〔Micropropagation〕，是指在无菌条件下，将植物体的器官、组织或细胞培养于人工培养基中，并辅以人工控制环境，使其生长出完整植株的繁殖技术。微繁：跟常规的繁殖方法相比它是一种微型操作过程。一、快繁的定义离体微繁殖技术的应用，首先应归功于Morel，他在1960年首先建立了兰花离体繁殖的方法〔原球茎繁殖〕。目前已有近400种植物的离体繁殖已获得成功，其中许多具有重要经济价值的花卉(如兰花、菊花、石竹)、果树(草莓、无籽西瓜、葡萄)、经济作物(马铃薯、甘蔗)、林木(桉树、杨树)均已在种苗生产上广泛应用，取得了巨大的经济和社会效益。一、快繁的定义荷兰是试管苗的生产王国我国快速繁殖植物的种类达443种之多植物种类木本植物园艺花卉类禾本科豆科蔬菜草本中草药其它物种数15513829162895216微繁图片龟背竹试管苗非洲紫罗兰壮苗生根二、快繁的技术程序无菌材料的建立芽苗的增殖生根及移苗1.无菌材料的建立初代培养：取材消毒接种培养外植体的选择主要应考虑以下问题：繁殖对象的品种典型性。植物在自然条件下的繁殖特点。尽可能取自然繁殖器官的适当部位作外植体，外植体的取材部位和大小、生理状态。2.培养物的增殖增殖方式：腋芽增殖愈伤组织增殖体细胞胚增殖不定芽增殖〔1〕、不定芽增殖不定芽：从现存的芽以外的任何器官、组织上通过器官发生重新形成的芽称之为不定芽。特点：繁殖系数高遗传稳定性较好继代次数有限本卷须知：激素浓度不能过高；防止使用2，4-D等活性强的生长素，以减少变异发生。〔2〕.腋芽增殖腋芽进行离体培养时可不断生长，逐渐形成芽丛，反复切割和转移可不断形成新的芽丛，因此可在短时间内获得大量芽。本卷须知：这一繁殖方式一般不需要添加外源激素。需要添加激素的可使用少量细胞分裂素，但浓度不能过高，否那么容易形成愈伤组织。蝴蝶兰腋芽萌发成丛芽〔3〕、愈伤组织增殖愈伤组织增殖培养：即愈伤组织继代培养以扩大愈伤组织量进而分化形成更多苗。特点：成功率高，繁殖系数大，但遗传稳定性较差。本卷须知：降低激素浓度对要求遗传稳定性高的品种一般不采用这一途径快繁。〔4〕.体细胞胚增殖特点：增长率高；双极性免去生根环节。问题：胚状体休眠的诱导和解除还难以把握；局部物种胚状体诱导困难且成苗率仍不高。这一途径仅适用于少量植物。3、芽苗生根培养根本培养基1/2或1/4MS培养基生长调节剂IBA和温度：比增殖培养略低生产用苗的培育：炼苗－假植－定植－生产用苗炼苗：适应自然环境移植：洗掉附着的培养基，移植土壤采用人工调配的混合培养土〔泥炭土、蛭石、珍株岩等〕；土壤湿度不宜过大〔影响通气、烂根〕；空气湿度初期较大〔微雾喷雾〕。定植：三、影响微繁效果的因素基因型外植体培养基和培养条件继代培养植株再生方式三、影响微繁效果的因素继代培养：继代间隔与外植体大小有关：外植体大，继代培养时间短〔3-4周〕；外植体小，那么继代培养时间长〔5-6周〕。一般继代时间延长变异增多。形态发生能力的保持或丧失培养中发生的变异：正比三、影响微繁效果的因素植株再生方式与变异率：茎芽增殖〈腋芽〈直接发生途径形成的芽〈愈伤组织形成的不定芽。使用低浓度的生长物质可减少变异。四、快繁的应用及局限性1.应用用于加速某些难繁殖或繁殖速度很低的植物，或某些需要加速繁殖的特殊基因型，如名贵花卉、优良资源、工程植株等等。

用于自然繁殖极易感染病毒的植物，如马铃薯、甘薯、甘蔗、香蕉、石竹、百合等等。用于有性繁殖变异范围大而自然条件下又不易无性繁殖的植物，如非洲菊、花竹、紫罗兰等。四、快繁的应用及局限性2.局限性有些植物离体繁殖技术未过关培养中的变异培养苗的“玻璃化〞和褐化2.快繁应用的局限性〔1〕、培养中的变异问题解决方案？激素、继代时间、植株再生方式、实验中的选择2.快繁应用的局限性〔2〕、培养苗的玻璃化问题(vitrification)玻璃苗：离体繁殖中出现的材料〔主要是嫩茎和叶片〕质地半透明、叶片肿胀的畸形苗。特征：茎、叶外表无蜡质，体内的极性化合物水平较高，细胞持水力差，植株蒸腾作用强。负作用：生长缓慢、不易生根、繁殖系数下降。2.快繁应用的局限性〔2〕、培养苗的玻璃化问题(vitrification)成因：目前没有一致的结论，一般认为是试管苗的生理失调主要是水分状态不适应的病症，实验发现以下因素对玻璃化有影响。材料：培养条件：液体培养易玻璃化；蔗糖浓度和琼脂浓度低可引起玻璃化；复原态氨浓度高容易引起玻璃化；细胞分裂素浓度过高；通气不良等。〔2〕、培养苗的玻璃化问题解决措施：固体培养，提高光照强度，降低湿度。提高培养基中蔗糖和琼脂浓度，降低NH4+浓度。参加添加剂：如活性碳、多效锉。降低培养基中细胞分裂素含量，可以考虑参加适量脱落酸。〔3〕褐化问题外植体褐变：指在接种后其外表开始变成褐色，有时甚至会使整个培养基褐变的现象。机制：由于植物组织中的多酚氧化酶被激活，而使细胞的代谢发生变化所致。在褐变过程中，会产生醌类物质，它们多呈棕褐色，当扩散到培养基后，就会抑制其他酶的活性，从而影响所接种外植体的培养。〔3〕褐化问题褐变的主要原因：植物品种：玫瑰、豆科原生质体培养外植体的生理状态：一般来说，处于幼龄期的植物材料褐变程度较浅，生长迅速的组织褐变少。培养基成分：浓度过高的无机盐会使某些植物的褐变程度增加；细胞分裂素的水平过高也会刺激某些外植体的多酚氧化酶的活性，从而使褐变现象加深。培养条件：光照过强、温度过高、培养时间过长易褐化。〔3〕褐化问题减轻褐变现象发生的方法：选择适宜的外植体：适宜的培养条件：无机盐成分、植物生长物质水平、适宜温度、及时继代培养均可以减轻材料的褐变现象。使用抗氧化剂：在培养基中使用半胱氨酸、抗坏血酸、PVP等抗氧化剂能够较为有效地防止或减轻很多外植体的褐变现象。另外，使用0.1%-0.5%的活性炭对防止褐变也有较为明显的效果。连续转移：对容易褐变的材料可间隔12~24h的培养后，再转移到新的培养基上，连续处理7-l0d后，褐变现象便会得到控制或大为减轻。(4)、白化白化苗：禾谷类植物的花药培养中经常会出现白化苗。花粉白苗除外观上缺乏绿色外，并无其它形态上的变异。缺绿的程度由完全白色到浅黄色不等，此外，有时还存在一种叶面呈绿白镶嵌的条纹状植株，但此种植株数量甚少。愈伤组织分化绿苗或白苗的特性是相对稳定的，由愈伤组织上芽点的颜色可以判断分化出来的将是绿苗或是白苗。叶绿体发育不正常引起，可能由染色体断裂造成。(4)、白化影响花粉白苗形成的因素有：供体植物的基因型、花粉发育的时期、培养基的成分和培养条件等。小麦、水稻和大麦的白化苗频率较高，而玉米花粉植株中白化苗却较少。除葡萄外，在禾本科以外的植物花药培养中尚未发现白化苗。花药培养中，白化苗的比例随接种时花粉发育时期的延迟而提高，小孢子已完成有丝分裂的花药往往只能得到白化苗。培养基对花粉白苗形成的影响主要在愈伤组织发生阶段。在小麦花药培养中12％的蔗糖比6～10％的蔗糖浓度有更高的绿苗率。高浓度的2,4－D也可使所产生的愈伤组织分化成更多的白化苗。第二节植物脱毒技术植物脱毒的定义植物脱毒原理植物脱毒技术一、植物脱毒的定义目前，植物感染病毒呈增多趋势，受病毒侵染的植株生长缓慢、产量下降、品质变劣。常见的有：蔬菜：白菜、大蒜、葱、番茄、萝卜果树：柑橘、苹果、草莓、香蕉花卉：香石竹、各种菊花、天竹葵、紫罗兰等一、植物脱毒的定义目前，植物病毒的防治方法有三类：物理方法：用射线、超声波、高温等处理材料化学方法：用孔雀绿、病毒唑干扰病毒复制生物学方法：培育抗病毒品种，组织培养脱毒植物脱毒：利用植物组织培养技术，脱去植物细胞中侵染的病毒，获得健康繁殖材料的过程。一、植物脱毒的定义目前应用组织培养技术脱毒的方法有：种子繁殖茎尖培养愈伤组织培养茎尖微体嫁接珠心胚培养花药培养脱毒法二、茎尖培养脱毒法1、原理：病毒在植物体内的布不均匀，顶端分生组织无病毒或病毒浓度很低。传导抑制：病毒通过维管束和胞间连丝传递，分生组织维管不健全。酶缺乏：分生组织缺乏病毒复制所需的酶系统。能量竞争：二、茎尖培养脱毒法2、茎尖培养脱毒研究简况1943年：White培养番茄根，烟草花叶病毒(TMV)侵染的番茄根切段病毒含量不一致，在近根尖的切段低，而在根尖顶端那么全部无病毒。1948-1949年：Holmes和Masset等发现，由病毒感染的植株，不同部位病毒分布不一致。在老叶和成熟的组织、器官中含量高，而幼嫩和未成熟组织、器官中含量低，在生长点区域，几乎不含病毒。1952年：Mores等从感染花叶病毒的大丽花植株别离了茎尖大小的分生组织，培养获得无病毒植株。1955年：Mores以马铃薯为材料，获得了无病毒种苗。已有近100种园艺植物通过茎尖培养方法获得无病毒苗。二、茎尖培养脱毒法茎尖培养获得的无病毒植物植物种类病毒茎尖大小(mm)香石竹花叶病毒0.2-0.8百合花叶病毒0.2-1大蒜花叶病毒0.3-1矮牵牛烟草花叶病毒0.1-0.3菊花花叶病毒0.2-草莓各种病毒0.2-1甘蔗花叶病毒0.7-0.8春山芥芜青花叶病毒0.5三、茎尖脱毒技术茎尖脱毒技术的程序：材料选择〔病毒诊断〕材料预处理茎尖分生组织别离培养再生植株病毒检测脱毒植株保存快繁三、茎尖脱毒技术1、材料选择〔病毒诊断〕选材：品种典型性〔高产优质的品种〕染病轻的母本病毒诊断：指示植物法血清学鉴定三、茎尖脱毒技术1、材料选择〔病毒诊断〕指示植物：是指具有能够区分某种病毒的专化性病症的寄主植物。

血清学鉴定：试管沉淀反响；免疫双扩散；酶联免疫吸附测定(ELISA)。三、茎尖脱毒技术2、材料预处理：采用一些辅助脱毒技术如热处理。无损伤脱毒区热致死区生长温度高温生长区热处理区三、茎尖脱毒技术3、茎尖分生组织别离培养外植体消毒茎尖剥离〔带1~2个叶原基〕不带叶原基难以分化成苗，叶原基过多脱毒效果不好剥离在解剖镜下进行，尽量迅速以防脱水。三、茎尖脱毒技术茎尖形状、大小和外围幼叶、叶原基着生方式草莓大蒜兰花青芋山芋香石竹三、茎尖脱毒技术4、脱毒效果检测〔同病毒诊