应用RNAi技术沉默STAT3基因对人胃癌细胞生长影响的实验研究

应用RNAi技术沉默STAT3基因对人胃癌细胞生长影响的实验研究

苏州大学附属第一医院普外科吕庆福

研究背景胃癌是威胁人类健康的大敌，目前，全世界每年大约有80万人被确诊为胃癌，占所有恶性肿瘤的第二位。在中国每年新确诊的胃癌患者达30万例，是恶性肿瘤发病率的第二位，在农村地区则占到了第一位。研究背景1.对于胃癌患者，传统治疗方法是手术为主,同时辅以化疗，但治愈率只有20%～40%，且高达50%的患者会复发转移。2.目前还没有对胃癌细胞有特异性杀伤作用的药物。各种药物及治疗方法的疗效还不令人满意。3.胃癌是在内外因素影响下发生的多基因表达调控失调的一种个体化疾病，因此胃癌的基因治疗一直是研究的热点。近年来兴起的RNA干扰（RNAinterference，RNAi）技术使基因治疗胃癌成为可能。

RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是由双链RNA(double-strandedRNA，dsRNA)引发的转录后基因沉默机制。研究背景研究背景STAT3基因是转录信号传导子与激活子家族(signaltransducersandactivatorsoftranscription，STAT)的重要成员，STAT3信号传导通路与细胞的增殖、分化及凋亡密切相关，该通路持续激活可导致细胞异常增殖和恶性转化，目前定义为癌基因；STAT3在多种肿瘤细胞和组织中都有过度激活；研究目的观察瞬时转染特异性siRNA后对人胃癌细胞STAT3的表达，探讨RNA干扰STAT3对人胃癌细胞增殖和凋亡的影响

实验靶向STAT3的RNA干扰对人胃癌细胞增殖的实验研究主要材料SGC-7901细胞株中科院上海细胞所STAT3siRNA上海吉玛制药技术有限公司

四甲基偶氮唑蓝Sigma公司

PI染液美国CalBiochem公司Trizol美国invitrogne公司主要材料人STAT3siRNA序列：Sense：5’-UUCAGACCCGUCAACAAAUdtdt-3’Anti-sense：5’-AUUUGUUGACGGGUCUGAAdtdt-3’5-FAM荧光标记阴性对照siRNA序列：Sense：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’Anti-sense：5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’β-actin引物序列：

Forward：5’-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3’Reverse：5’-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3’

产物长度为285bp.STAT3引物序列：Forward：5’-ACTCCATCGCTGACAAAA-3’，Reverse：5-CAGTGACCAGGCAGAAGA-3’，产物长度为108bp方法

实验分三组：

A空白组

B阴性对照组

CsiRNA组方法转染SGC-7901细胞抗人STAT3siRNA1）转染前一天，将处于对数生长期的1.5*105个SGC-7901细胞接种在6孔板上，1.5ml含10％FBS的1640培养基培养，24小时细胞汇合达到70%。

2）200pmolsiRNA用无血清Opti-MEM细胞培养基稀释成终体积250μl，轻轻混匀。

3）在240μl的无血清Opti-MEM细胞培养基中加入转染试剂LipofectamineTM200010ul，轻轻混匀室温下放置5分钟。

4）将稀释好的siRNA和LipofectamineTM2000试剂混合，轻轻混匀室温放置20分钟，以便形成复合物。

5）将500μl的复合物加入1.5ml的含10%FBS的1640培养液的6孔板中，总体积为2ml，siRNA的终浓度为100pmol/ml，37℃、5%CO2的培养箱内继续培养6小时。

6）6小时后更换培养液继续培养。

7）阴性对照组转染N.C.FMA.siRNA操作同上，终浓度为100pmol/ml；空白对照组加1.5ml10%FBS的1640培养液，0.5ml的无血清Opti-MEM细胞培养基。方法1.MTT法检测细胞抑制率

2.流式细胞仪检测细胞周期和凋亡

3.RT-PCR检测STAT3mRNA

结果

荧光显微镜观察转染效率：

转染荧光图6小时转染荧光图24小时

组别0h(OD值)24h(OD值)48h(OD值)72h(OD值)空白组0.302±0.0060.619±0.0100.890±0.0101.126±0.028阴性对照组0.300±0.0070.613±0.0050.881±0.0131.110±0.023siRNA组**0.301±0.0060.501±0.0080.506±0.0080.485±0.011

结果1.MTT检测结果结果

生长曲线结果2.流式细胞仪检测细胞周期与凋亡（48h）

空白组阴性对照组siRNA组结果

细胞周期分布直观图组别STAT3mRNA抑制率（%）空白组0.638±0.013-阴性对照组0.610±0.0074.39siRNA组**0.172±0.01673.04

3.RT-PCR检测转染细胞STAT3mRNA表达水平结果结果

PCR产物电泳图

MMarkA空白组B阴性对照组CsiRNA组285bpMABC108bpSTAT3ß-actin讨论

STAT3可以被多种细胞外信号激活，包括：①生长因子：表皮生长因子、血小板源生长因子等；②细胞因子：IL-6、IL-11及白血病抑制因子等；③非受体酪氨酸激酶：c/v-Src、Tel-Jak等；④G蛋白：促甲状腺素(TSH)、巨噬细胞炎症蛋白-1(MIP-1)等。讨论RNAi特点:

1.高特异性

2.高效性

3.传递性

4.时间剂量依赖性

5.可同时抑制多个基因且抑制效果互不干扰讨论本实验通过STAT3siRNA特异性干扰人胃癌细胞，结果显示：①siRNA干扰可以特异性抑制SGC-7901的STAT3mRNA表达,介导STAT3基因沉默，且效果显著；②通过特异性沉默STAT3基因表达，可以有效地抑制癌细胞增殖；③封闭STAT3基因表达可使胃癌细胞阻滞于G0-G1期并诱导其凋亡；④进一步证实了STAT3在胃癌细胞增殖的分子途径中具有重要作用。讨论STAT3基因与胃癌发生密切相关，国外实验提示STAT3可能通过以几种途径发挥作用：