肿瘤病理生物学-肿瘤病理生物学基础

第一节脱氧核糖核酸和核糖核酸第二节遗传信息的复制、转录和翻译第三节基因表达的调控第四节人类基因组计划第五节RNA干扰和微小RNA

第一章肿瘤病理生物学基础◆要求掌握基因构成，碱基互补原则，复制形式和基因表达调控过程；◆了解人类基因组计划和基因组图谱；◆了解miRNA与siRNA的概念、异同点。

学习要求第一节脱氧核糖核酸和核糖核酸一、脱氧核糖核酸（DNA）（一）DNA的基本结构基本构成单位是核苷酸基本成分构成：碱基（A、G、C、T）戊糖（D2脱氧核糖）磷酸（二）生物体中的DNA

◆主要是以双股链的构型存在于细胞核内，由碱基（T.A.C.G=n4),脱氧戊（核）糖和磷酸成分所组成。

◆双链彼此方向相反（5’→3’,3’

→

5’），并遵循碱基互补原则（A=T，G≡C；T=A，C≡G），以氢键相连接。DNA分子立体构型有三级

♦一级结构为单核苷酸长链；

♦二级结构为双股螺旋结构（主要是右手螺旋构型）；

♦三级结构为超螺旋结构，以高度折叠压缩状态存在于染色体内。DNA的分子构型

（三）DNA的性质及影响因素1、变性

DNA变性是指DNA二级结构被破坏，双螺旋结构解体的过程。2、复性

DNA的变性是可逆的，在适宜条件下，如温度或pH值逐渐恢复到生理范围，分离的DNA双链可以自动退火，再次互补形成双螺旋结构，这个过程叫做复性。3、疏水作用DNA分子间存在疏水相互作用4、碱基堆积作用碱基在DNA分子内部聚积在一起5、溶液的离子强度对DNA结构的影响

溶液中盐离子浓度对DNA稳定性有影响二、核糖核酸（RNA）（一）RNA的特点①碱基组成不同：A,G,C,U②戊糖性质不同:D-核糖③RNA主要是由单链核苷酸构成，细胞中不存在于其互补的配对链；④因为是单链，所以RNA分子里的碱基比例常不相等；⑥RNA是合成蛋白质的模板、遗传信息的传递和表达者;⑦某些RNA分子具有酶蛋白的催化活性；⑧某些RNA分子具有调节基因功能的作用。（二）RNA的种类、功能和结构主要包括三种：信使RNA（messengerRNA,mRNA）；转运RNA（transferRNA,tRNA）；核糖体RNA（ribosomalRNA,rRNA）。不同种类的RNA行使不同的功能。tRNA的二级结构（三叶草）tRNA的三级结构（倒L形）第二节遗传信息的复制、转录和翻译一、遗传信息的复制

DNA(基因)复制具有一定的特征（一）半保留式复制和半不连续复制

半保留复制方式

♦DNA复制时，分别以解开的亲链为模板，根据碱基互补原则合成新的DNA链（子链）。

♦复制完成后的子代DNA分子，其双螺旋链必然是由一股亲代原有的旧链与合成的子链互补形成的。

♦这就是Watson及Crick提出的著名的半保留复制(semi-conservativereplication)方式。原始亲代分子第一子代分子第二子代分子半保留复制半不连续复制-冈畸片断(Okazakifragment):◆生物体内催化DNA合成的DNA聚合酶只能催化5’→3’方向的合成，而不能催化3’→5’方向的新链合成。◆在以3’→5’方向的母链为模板时，复制合成出一条5’→3’方向的前导链（leadingstrand）。◆前导链的合成是连续进行的，而随从链的合成是不连续进行的。◆所以，从总体上看DNA复制是半不连续复制(semidiscontinuousreplication)，随从链的合成比前导链的合成要迟些，为此，两者的形成是不对称的。5'3'亲代DNA3'5'3'5'先导链冈崎片段滞后链半不连续复制DNA复制过程

（二）DNA复制相关的酶

Ⅰ：还具有核酸外、内切酶作用1、DNA聚合酶Ⅱ：核酸外切酶作用

Ⅲ：起主要作用2、DNA连接酶：只能连接一个切口而不能连接一个缺口。3、与解链相关的酶和蛋白质包括单链结合蛋白，解旋酶，拓扑异构酶Ⅰ、Ⅱ，

引物酶，引发前体蛋白等。DNA连接酶的作用方式

（三）复制子、复制的起点与终点◆基因组中能独立进行复制的单位称为复制子(replicon)。◆复制子含有控制起始的特定位点称为复制起始点（origin），真核细胞一般有几个起始点，即有多个复制子。◆终止复制的位点称为复制终点(terminus）。titit(1)(2)(3)(4)复制子复制子复制叉真核生物DNA的复制二、遗传信息的转录◆mRNA行使转录功能时，则以DNA单链为模板，依照A-U，G-C；U-A，C-G碱基配对规则转录遗传信息；◆由于mRNA的半衰期很短，故用于检测的样品必须新鲜。启动子转录起始序列内含子末端序列DNA编码序列（外显子）内含子5'3'mRNA前体5'端加帽，3'端加poly(A)尾5'帽剪切剪切内含子环化5'5'内含子切除AAA…AAA3'AAA…AAA3'Poly(A)尾AAA…AAA3'成熟的真核mRNA帽Poly(A)尾前导序列尾随序列编码序列真核mRNA转录后加工成熟过程示意图DNA复制mRNA翻译tRNA蛋白质转录逆转录中心法则三、遗传信息的翻译◆tRNA则以mRNA为模板通过反密码子的特异性接传，翻译成具有相应氨基酸序列的肽链或蛋白质。◆遗传信息（基因）的表达一般是通过合成各种各样的蛋白质体现的，使生物细胞表现出各种各样的生理功能，以及千差万别的生物学性状。◆遗传密码的摆动学说

tRNA在蛋白质的肽链合成过程中起到了“搬运工”的作用，tRNA带有30种左右的反密码子，而密码子却有64种,1966年Crick提出了密码子－反密码子之间碱基配对的摆动假说，即密码子5’端的前两个碱基必须严格地按照碱基互补配对的原则与反密码子配对，但是第三个碱基可以摆动，与密码子形成非标准配对。遗传密码的摆动假说

◆翻译的基本过程核糖体是蛋白质合成的工厂，有一系列蛋白质合成相关的结合位点：①一个mRNA结合位点；②三个tRNA结合位点(氨基酰tRNA结合位点：A位点；肽酰tRNA结合位点：P位点；释放的tRNA结合位点：E位点)；③各种因子如起始因子、延伸因子以及释放因子等的结合位点。翻译过程示意图翻译的基本过程

第三节基因表达的调控从DNA到蛋白质的过程叫基因表达(geneexpression)，对这个过程的调节即为基因表达调控

(regulationofgeneexpressionorgenecontrol)。基因表达调控主要表现在以下几个方面：①染色体水平；②DNA复制水平；③转录及转录后水平；④翻译及翻译后水平。一、转录前的调控（包括两大方面）1、DNA序列改变或基因拷贝数改变引起的基因表达水平的改变；如：基因丢失、突变、扩增、重排等2、基因序列或拷贝数没有改变，但发生了表观遗传学的改变。如：基因甲基化、组蛋白乙酰化等二、转录水平调控

顺式调控元件

其他顺式调控元件：应答元件、转座子

反式作用因子启动子增强子沉默子DNA结合域转录活化域三、转录后水平调控♦前体RNA(hnRNA)加工成熟包括加尾、剪接、修饰等♦mRNA运输

包括RNA干扰四、翻译水平的调控♦翻译起始因子(IF)的调节：主要通过磷酸化和去磷酸化作用来实现的♦起始密码子的上游序列与翻译控制：

同一mRNA可翻译出两条肽链♦mRNA稳定性与翻译控制：五、翻译后水平的调控：♦多肽加工；♦化学修饰（磷酸化、乙酰化等）。

DNA基因转录初级转录体转录后加工氨基酸核酸翻译成熟mRNA蛋白(非活性）修饰蛋白(活性)蛋白降解氨基酸基因表达的多水平调控第四节人类基因组计划一、人类基因组计划的概念和意义：

1990年10月1日，美国国会正式批准美国的“人类基因组计划”（HumanGenomeProject,HGP）启动。这项由美国、英国、法国、德国、日本和中国六个国家共同参与。

研究的最终目的是对生命进行系统和科学的解码，以此达到了解和认识生命的起源、种间和个体间存在差异的起因、疾病产生的机制等生命现象。该计划历经十年，耗资数十亿美元，成为人类基因研究史上一个重要的里程碑。2001年，上述计划宣告完成，绘制出了四种不同的图谱：遗传图谱、物理图谱、序列图谱和基因图谱。（一）遗传图谱（geneticmap）又称为连锁图谱（linkagemap）或遗传连锁图谱◆是某一物种的染色体图谱，显示所知的基因和/或遗传标记的相对位置，而不是在每条染色体上特殊的物理位置。由遗传重组测验结果推算出来的、在一条染色体上可以发生的突变座位的直线排列（基因位点的排列）图。◆其研究经历了从经典的基因连锁图谱到现代的DNA标记连锁图谱的过程。第一代多态性标记：限制性片段长度多态性（RFLP）第二代多态性标记：微卫星位点或短串联重复片段（VNTR）第三代遗传标记：单核苷酸多态性（singlenucleotidepolymorphism,SNP）（二）物理图谱◆利用限制性内切酶将染色体切成片段，再根据重叠序列确定片段间连接顺序，以及遗传标志之间物理距离碱基对(bp)或千碱基(kb)或兆碱基(Mb)的图谱。◆以人类基因组物理图谱为例，它包括两层含义，一是获得分布于整个基因组30000个序列标志位点(STS，其定义是染色体定位明确且可用PCR扩增的单拷贝序列)。◆完整的物理图谱包括人类基因组的不同载体DNA克隆片段重叠图谱、大片段限制性内切酶酶切位点图谱、DNA片段或一段特异DNA序列或序列标签位点以及基因组中广泛存在的特征性序列（CpG序列、Alu序列等）的标记图等。（三）序列图谱随着遗传图谱和物理图谱的完成，测序工作成了重中之重的任务，其主要策略是把庞大的基因组分成若干有路标的区域，然后进行测序分析。

2003年完成了人类全基因组测序，差错率为万分之一，比预期的目标提前两年完成。（四）基因图谱在识别基因组所包含的蛋白质编码序列的基础上绘制有关基因序列、位置及表达模式等信息的图谱。

基因图谱就是鉴别出约全部基因的位置、结构与功能，其中包括决定各类RNA的基因。人类基因组计划催生了更先进、更快速、高通量的测序技术。于是，基于大规模平行测序思想的第二代基因测序技术（NGS）应运而生。NGS的出现使得基因研究领域快速发展，测序成本也大大降低。如：全基因组测序在2001年时需要耗费100万美元，而2011年二代测序已经降到1万美元。现在四代测序技术（又称纳米孔测序技术）已经问世，该技术利用分子在通过纳米孔道时会产生不同的电流，识别基因中的碱基排列顺序。二、后基因组计划

2004年10月，人类基因组完成图公布，初步确定人类基因约为3.5万条。

功能基因组研究的进一步发展以及“后基因组时代”的到来，蛋白组学（proteomics）为核心的研究计划成为新的热点。除蛋白组学外，大规模的结构基因组学、药物基因组学、比较基因组学、代谢组学等一系列“组学(omics)”相继产生，后基因组计划将成为21世纪生命科学中继基因组研究后的主要任务。表1-1人类基因组计划和后基因组计划人类基因组计划后基因组计划研究方向结构基因组学功能基因组学研究目标最终明确人类基因遗传多样性及疾病发生的分子基础通过分析基因组所表达的蛋白质的表达规律和生物学功能，阐明复杂的生物学现象研究任务基因组测序；疾病基因的定位克隆；多基因病研究等基因功能及表达调控研究；代谢组学研究；蛋白组学研究等研究手段RFLP、SSCP、全基因组测序、生物信息学等EST法、SAGE法、蛋白双向电泳和质谱分析、反向遗传学和基因诱变技术、RNA干扰、生物信息学等第五节RNA干扰和微小RNA

◆小RNA是非编码的RNA分子，控制着真核细胞的许多功能，影响基因表达、细胞周期和个体发育等多种行为。◆小RNA主要包括微RNA(microRNA/miRNA)和小干扰RNA(shortinterferingRNA,siRNA)两类。一、RNA干扰和siRNARNA干扰（RNAinterference,RNAi）是1998年由华盛顿卡耐基研究院AndrewFire和马萨诸塞大学癌症中心CraigMeno首次在线虫中发现的，指一种由双链RNA诱发的基因沉默现象，其机制是通过阻碍特定基因的翻译或转录来抑制基因表达。

（一）RNA干扰的基本原理RNAi引起的基因沉默具有以下特征：①通过降解细胞中mRNA在转录后水平来调控目的基因的表达，对靶基因的复制和转录并无影响；②具有高度序列特异性；③抑制靶基因表达具有高效性；④RNAi可在不同细胞间长距离传递和长时间维持，而在某些生物（如线虫）中则具有遗传特性。（二）RNAi在肿瘤研究中的应用♦抑制肿瘤生长、血管形成、侵袭和转移♦确认药物靶标♦发现新的肿瘤基因♦特定基因功能解析和人类疾病的研究二、MicroRNA/微小RNA♦MiRNA是一类长度很短的非编码调控单链小分子RNA，长度约21～22个核苷酸;♦能够通过与靶mRNA特异性的碱基配对引起靶mRNA的降解或者抑制其翻译，从而对基因进行转录后表达的调控;♦其转录独立于其他基因并不翻译成蛋白质，而是具有调节其他基因表达的活性;♦在生物发育过程中发挥着重要作用。（一）miRNA的合成先转录生成较长的初级RNA分子(pri-miRNA)，在Drosha酶(RNaseⅢ家族成员)的作用下，被剪切成具有茎环结构的前体miRNA(pre-miRNA)，然后在exportin-5(GTP依赖的核转运因子)的转运作用下，从核内转移到胞质，pre-miRNA在细胞质中经过Dicer酶被加工成为成熟的miRNA分子，然后与相关蛋白相结合，形成复合物后发挥其生物学作用。（二）miRNA的特点①广泛存在于真核生物中，是一组不编码蛋白质的短序列RNA;②miRNA的长度一般为20～24个碱基，但在3′端可以有1～2个碱基的长度变化;③成熟miRNA的5’端有一磷酸基团，3’端为羟基;④miRNA基因在基因组上不是随机排列的,其中一些通常形成基因簇;⑤有些miRNA分子在一些物种中是高度保守的;⑥miRNA还呈现组织特异性表达和发育阶段特异性表达的特点。（三）miRNA的作用机制♦miRNA的作用机制类似于siRNA。♦细胞内miRNA前体经过剪切和加工后形成双链RNA，其中只有一条链稳定而形成单链，即miRNA，可与成熟mRNA上任意与之互补的序列相结合，从而抑制基因转录和(或)使mRNA降解而抑制基因表达。♦miRNA只与其靶基因3’端非翻译区的特殊位点结合抑制其翻译过程，从而调控基因表达。♦在大多数情况下(例如在动物中)，复合物中的单链miRNA与靶mRNA的3pUTR不完全互补配对，从而阻断该基因的翻译过程。miRNA的合成及作用简图

（四）miRNA的研究手段主要有两种：♦利用核酸杂交技术研究miRNA的特征，具体包括Northern杂交、实时定量-PCR、微阵列杂交、原位杂交及miRNA受体转基因等技术♦通过cDNA文库、分子克隆技术和生物信息学分析来发现新的miRNA（五）MiRNA的应用前景♦MiRNA在生命活动中起着重要作用，对基因表达、生长、发育和行为等都具有十分深远和复杂的影响。♦目前正围