第二节血涂片制备与染色

第二节血涂片制备与染色第1页，共15页。第二节血涂片制备与染色第2页，共15页。一、血涂片制备（一）主要器材1．载玻片2．推片第3页，共15页。（二）简要操作1．薄血膜推片法（1）手工推片法：采血→取血于载玻片上→推片→干燥。取1小滴血于载玻片的一端（1.5cm处或整片1/3处）；推片时使推片与载玻片成30°～45°角度，让推片接触血滴，使血液沿推片下缘散开，再向血滴前方向匀速移动推片。第4页，共15页。

如果用力不均匀、载片不清洁可造成血涂片分布不均合格的血涂片：厚薄适宜，头、体、尾分明，两端和两侧留有空隙，血膜至少长30~50mm，两侧空隙2~3mm。第5页，共15页。（2）仪器推片法：目前有多种型号的血细胞分析仪或血细胞形态分析仪配有血涂片仪和染色仪，可以根据需要进行自动送片、取血、推片、标记和染色等操作。2．厚血膜推片法采血→取1小滴血液于载玻片中央→以推片的一角将血滴由内向外旋转涂布，制成直径约1.5cm的圆形厚血膜，干燥→滴加蒸馏水，溶解红细胞，脱去血红蛋白→倾去水，干燥。第6页，共15页。（三）质量保证1．玻片载玻片需清洁、干燥、中性、无油腻，勿用手触及玻片表面。2．标本抗凝血需在4小时内制备血涂片，否则细胞形态会发生改变。3．制片①制备厚薄适宜的血涂片：

厚：血滴大、角度大、速度快——大、大、快薄：血滴小、角度小、速度慢——小、小、慢②制备血膜分布均匀的血片：血膜分布不均主要是推片边缘不齐、用力不匀和载玻片不清洁所致。4．制片后处理第7页，共15页。二、血涂片染色血涂片染色是为了使血细胞着色，染料将细胞的胞膜、胞质、胞核等染成不同的颜色，便于在显微镜下观察识别。第8页，共15页。（一）方法1．瑞特染色法（1）染色原理：细胞的着色既有物理的吸附作用，又有化学的亲和作用。第9页，共15页。（2）试剂①瑞特染液酸性染料伊红（伊红化钠

）碱性染料美蓝（氯化美蓝）复合物溶于甲醇。②磷酸盐缓冲液（PBS）（pH6.4～6.8）第10页，共15页。

（3）简要操作血涂片制备

干燥、标记加瑞特染液覆盖血膜固定约1分钟加等量缓冲液混匀→静置5～10分钟流水冲洗、干燥第11页，共15页。（4）染色效果正常情况下，经瑞特染色后血膜外观呈淡紫红色。显微镜下：红细胞呈粉红色圆盘状；白细胞的细胞核染紫红色，核染色质结构清楚，胞质中颗粒清楚，并显示出各种细胞特有的色；血小板染成紫红色。第12页，共15页。2．吉姆萨染色法（1）原理：吉姆萨染色原理与瑞特染色相同，但提高了噻嗪类染料亚甲蓝的质量，加强了天青的作用。与瑞特染色法比较，该法对细胞核着色效果较好，但对中性颗粒着色较差。（2）试剂：由吉姆萨染料、甲醇和甘油组成。（3）简要操作：同瑞特染色法。3．瑞-吉复合染色法可取长补短，使血细胞获得满意的染色效果。第13页，共15页。（二）质量保证1．瑞特染液质量在密封条件下，贮存时间愈久，亚甲蓝转化的天青B愈多，染色效果愈好。可用吸光度比值（RA）作为瑞特染液的质量评价指标RA=A650/A525，RA降至1.3±0.1即可使用。瑞特染液需适当加入甘油，密封严实，以防止甲醇挥发或氧化，影响染液质量。第14页，共15页。2．pH如环境pH＜PI（PI为该蛋白质的等电点），易与酸性伊红结合，染色偏红；当环境的pH＞PI则带负电荷增多，易与亚甲蓝结合，染色偏蓝。3．染色时机血涂片干透后才能染色，否则易脱落。4．染液用量以刚好覆盖血膜为宜。用量过多，会造成深染；过少，会导致血涂片局部未着色，或易干使染料沉积。5．混匀染液与缓冲液需充分混匀，否则细胞着色不均。6．染色时间环境温度越低、细胞越多，染色时间越长；反之亦然。7．冲洗用小流水将染液冲洗