植物细胞悬浮培养及次生代谢产物生产

第六章

植物细胞悬浮培养及次生代谢产物生产

1983年，日本三井石油化学工业公司在世界上首次成功地采用紫草细胞培养工业化生产紫草宁。1植物次生代谢产物概述2细胞的初代培养3高产细胞系的筛选4植物细胞悬浮培养方法5植物次生代谢物质生产

1.1植物代谢产物（1）初生代谢：为维持植物正常的生长发育所必须的代谢。初生代谢过程中形成的各种产物为初生代谢产物。初生代谢产物不稳定，在体内容易发生转化。（2）次生代谢：建立在初生代谢基础上，对于植物的正常生长发育非必需的代谢，其代谢产物为次生代谢产物，次生代谢产物是末端代谢产物，比较稳定，可以在体内积累。

类别次生代谢产物用途

黄酮银杏黄酮，大豆黄酮治疗心血管疾病醌紫草宁抗菌、抗炎、抗病毒、止血简单酚类香豆素香料，抗菌消炎萜类紫杉醇抗癌青蒿素抗疟疾生物碱长春新碱抗癌奎宁抗疟疾酚类化合物长春碱：＄2million/kg长春新碱：＄15million/kg李时珍在《本草纲目》中所开列的1892种药物绝大多数是植物药物，目前仍有约25％的法定药品来自植物。其药物的有效成分均为次生产物。天然的次生代谢产物已经超过2万种。次生代谢产物的应用：色素、香料、药物、添加剂、工业原料等。紫杉醇：二二萜类化合合物最早由太平平洋红豆杉杉Taxusbrevifolia的树皮中分分离广泛用于治治疗卵巢癌癌、乳腺癌癌、非小细细胞肺癌等等十几种癌癌症目前主要来来源于红豆豆杉属植物物紫杉醇简介介市场需求抗癌一线用用药销售额年增长率5亿美元理论需求量量2g/人人,500万人/年1000kg/年实际销量350kg/年紫杉醇供需需相差十分分悬殊图1：国际际紫杉醇原原料药需求求走势图（（单位：公公斤）图2：国际际紫杉醇销销售额（亿亿美元）药源问题红豆杉主要原料植植物国家一级保保护野生植植物，全球球十大濒危危物种之一一生长缓慢分分布有限限Taxol含量量低树皮中Taxol含含量:0.00001-0.069%3000棵棵树=10吨树皮=1kgTaxol=500病人700岁的的红豆杉惨惨遭剥皮人工栽培采用种子繁繁殖、扦插插等无性繁繁殖方法快快速、大面面积人工繁繁育红豆杉杉幼苗寻找红豆衫衫的替代物物从红豆杉非非树皮部位位提取产紫杉醇的的非红豆杉杉植物药源问题解解决办法（（一）药源问题解解决办法（（二）化学合成全合成1994年年获得成功功现有六种途途径半合成以10-DABⅢ和和BaccatinⅢ作为为半合成原原料获得紫紫杉醇药源问题解解决办法（（三）生物方法组织和细胞胞培养微生物发酵酵生物合成研究阶段红豆杉生物物合成途径径基本明确确10种相关关酶基因被被克隆表达达利用基因工工程手段改改造红豆杉杉提高紫杉杉醇产量1.2获获得植物次次生代谢产产物的方法法从植物中提取化学合成植物细胞大规模培养生产次生代谢产物植物细胞具具有形态全能性性，化学全全能性（在离体的的条件下可可以合成整整株植物能能合成的物物质）自然植物和和细胞培养养的紫草宁宁含量比较较生产方式生生产产周期紫紫草草宁含量（（％干重））完整植物2～3年年1～2植物细胞培培养3周周14细胞培养是是生产次生生代谢产物物的理想途途径：①缩短周期期，提高生生产效率植物细胞培培养生产周周期为15-30d；而完整整植株生长长短则几个个月，长则则数年，如如木瓜8个个月，而紫紫草为5年年②易于管理理，减轻劳劳动强度③培养在无无菌条件下下进行，可可排除病虫虫害干扰④可探索新新的合成路路线，获得得新的有用用物质1.3植植物细胞悬悬浮培养：：即是将植物物细胞或小小的细胞团团在液体培培养基中进进行大规模模培养的技技术。成功的悬浮细胞培养体系必须满足3个条件：分散性良好，细胞团较小，一般在30～50个细胞以下，在实际培养中很少有完全由单细胞组成的植物细胞悬浮系。细胞分裂快，均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同，悬浮系外观为大小均一的小颗粒，培养基清澈透亮，细胞色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色。有效成分含量高。次生产物的的产量=细细胞量*细细胞次生代代谢产物的的产率可控遗传因素决决定植物细胞培培养具有周期长、细细胞抗剪切切能力弱、、易聚团等特点。植物细胞培培养反应器器的设计不不仅要考虑虑有利于细细胞生长，，还要考虑虑有利于产物的积累累和分离。适合植物细细胞培养的的反应器应应具有适宜的氧传传递、良好好的流动性性和较低的的剪切力。2细胞的的初始培养养实验中获得得适宜于悬悬浮培养的的细胞系的的过程称为为细胞的初初始培养。。2.1建立立悬浮系获取悬浮培培养的细胞胞细胞的振荡荡培养酶解法愈伤组织培培养法使细胞团分分散促进气体交交换搅拌培养；；旋旋转振荡培培养；旋旋转转培养培养方式：：2.2建建立良好的的悬浮系的的关键环节节1.选择择适宜的外外植体双子叶植物物：幼胚、成熟胚、、下胚轴、、叶片单子叶植物物：幼胚、成熟胚、、幼穗、花花药等2.诱诱导导疏疏松松愈愈伤伤组组织织；；培养养基基愈伤伤组组织织的的异异质质性性；；继代代培培养养3.选选择择适适宜宜的的培培养养基基；；基本本培培养养基基+CTK/AUX+天天然然复复合合物物eg:SH+NAA3.0+BA1.0+CM/YE培养养基基的的PH李忠忠光光，，龚龚明明.2006.74.悬悬浮浮培培养养初初期期的的控控制制转速速，，光光，，温温度度5.悬悬浮浮细细胞胞的的继继代代与与选选择择继代代中中收收集集小小的的细细胞胞团团条件件培培养养基基：：新新鲜鲜培培养养基基3高高产产细细胞胞系系的的筛筛选选(P113)3.1高高产产细细胞胞系系筛选选的的整整体体思思路路外植植体体愈伤伤组组织织的的诱诱导导筛筛选选悬浮浮培培养养细细胞胞高产产细细胞胞系系筛筛选选高产产细细胞胞系系的的建建立立高产产细细胞胞株株系系的的特特点点培养养细细胞胞在在遗传传上上应应是是稳稳定定的，，以以得得到到产产量量恒恒定定的的产产物物细胞胞生生长长及及产产物物合合成成的的速度度快快，在在较较短短的的时时间间内内能能得得到到较较高高产产量量的的终终产产物物代谢谢产产物物要要在在细细胞胞中中积积累累，，而而不不被被迅迅速速分分解解，，最最好好能能将将其其释放放到到培培养养基基中高产产细细胞胞系系的的筛筛选选过过程程⑴选选定定特特定定起起始始材材料料①准准确确选选择择能能够够产产生生目目的的代代谢谢产产物物的的植植物物种种类类、、品品种种或或单单株株②应应尽尽量量选选择择自自然然状状态态下下产产生生天天然然产产物物的的组组织织或或器器官官为为外外植植体体⑵诱诱导导愈愈伤伤组组织织，，并并获获得得单单细细胞胞悬悬浮浮液液⑶诱诱变变处处理理细细胞胞悬悬浮浮液液，，筛筛选选目目的的突突变变细细胞胞⑷通通过过单单细细胞胞培培养养突突变变细细胞胞，，获获得得突突变变细细胞胞无无性性系系（即即突突变变细细胞胞愈愈伤伤组组织织获获得得））高产产细细胞胞系系的的筛筛选选方方法法⑴目目测测法法注意意：：真真正正的的变变异异体体or生生理理状状态态不不同同的的细细胞胞克克隆隆⑵根根据据单单细细胞胞克克隆隆次次生生代代谢谢产产物物含含量量进进行行筛筛选选⑶抗抗性性筛筛选选如：：添添加加抗抗性性抑抑制制剂剂庚庚二二酸酸------生生物物素素⑷诱诱变变筛筛选选3.2高高产产系系的的稳稳定定性性及及保保存存方方法法尽量量减减少少继继代代次次数数，，用用矿矿物物油油包包埋埋法法，，低低温温保保存存法法（（0-4℃℃）），，超超低低温温保保存存法法（（-196℃℃））保保存存。。同时时从从高高产产系系中中不不断断克克隆隆形形成成新新的的高高产产细细胞胞系系。。4植物细胞胞悬浮培养的的方法悬浮培养：将游离的细细胞或者细胞胞团按一定密密度，悬浮在在液体培养基基中，不断搅搅拌或者振荡荡培养，使细细胞快速、大大量增殖。技术难点：通气、剪切力力的适应性；；细胞同步化化控制。①培养：培养养基：基本培培养基+CTK/AUX培养条件：温温度、氧气、、PH、转速速②同步化控制制③细胞增殖的的监测，适时时测定细胞的的数量，掌握握放罐时机。。4.1细胞胞悬浮培养的的方法(P117)分批培养法连续培养法半连续培养法法细胞固定化培培养分批培养：把细胞分散散在一定溶积积的培养基中中进行培养。。注：中途不添添加也不更换换培养基设备简单，操操作方便，重重复性好。适合与突变体体筛选和遗传传转化的研究究。悬浮培养细胞胞增殖曲线时间（d）细胞数量123451——滞后期、2——对数生长期3——直线生长期、4——减缓期5——静止期（1）细胞扩扩增生长成S形曲线（2）继代培培养：要求缩短滞后后期滞后期的长短短：a继代细胞胞所处的生长长时期；对数数期b继代的细细胞密度104-105个/ml连续培养：在培养过程中中，不断向反反应器中以一定流流量添加新培培养基，同时时以一定流量从系系统中取出培培养基及培养养物的方式。。加入培养基排出培养基及其培养物半连续培养：在完成分批批培养的一个个周期后，从反应器器中取出大部部分细胞悬液液，只保留小部分细细胞悬液作为为下一培养周周期的种子细胞，然然后加入新鲜鲜培养基进行行培养的方式。细胞固定化培培养：将细胞固定定在固相基质质上，放入培培养液进行培培养的方式。。悬浮培养反应应器的类型：：机械搅拌式反反应器气动式反应器器内循环气升式式外循环气升式式机械搅拌式内循环气升式式外循环气升式式4.2培养养基：与培养养的细胞密度度相关（1）高密度度悬浮系（>5*104个/ml）a用B5，，ER等专用用培养基b对传统培培养基做出改改良如：加大2,4-D用量量；改良MS，加入VB、CH等天天然复合物（2）低密度度悬浮系（<5*104个/ml）a条件培养养基b向培养基基中添加多种种成分，尽可可能满足细胞胞生长的需要要细胞同步化：：同一悬浮培养养体系的大多多数细胞都同同时通过细胞胞周期的某一一特定时期。。细胞培养的同同步化方法：：饥饿法：限制制必需物质的的供应抑制法：化学学抑制，物理理抑制分级培养：细细胞分级仪4.3悬浮浮细胞培养的的同步化(P121)4.4悬浮浮细胞的生长长量和活力分分析(P122)（1）测定悬悬浮细胞数量量的方法：①细胞计数-血球计数板板②鲜重重、干重的测测定③细胞密实体体积(PVC)（2）细胞活活力测定①二乙酸荧光光素法（FDA）-活细胞内有有荧光产生②伊凡兰染色色法-染色受受损细胞核---死细胞胞③相差显微镜镜法-胞质环环流是否存在在5植物细胞胞大规模培养养生产次生代代谢物质植物细胞大规规模培养的技技术要求：从工程的角度度讲必须要进进一步研究和和开发适宜于于植物细胞生生长和次生代代谢产物生产产的生物反应应器，建立最最佳的控制和和调节系统。。从细胞生长与与培养技术方方面讲必须满满足以下3个个条件：1、培养的细细胞在遗传上上应是稳定的的，以得到产产量恒定的产产物。2、细胞生长长及生物合成成的速度快，，在较短的时时间内能得到到较高产量的的终产物。3、代谢产物物要在细胞中中积累而不被被迅速分解，，最好能将其其释放到培养养基中。5.1技术术路线(1)选择择适宜的外植植体；诱导疏疏松愈伤组织织；(2)通过过含量分析，，选择高产细细胞系(3)研究究培养条件（（达到高产、、稳产）；(4)建立立悬浮细胞培培养、优化培培养条件（达到高产、、稳产）；(5)小试试、中试、优优化培养条件件；(6)大规规模培养；(7)工业业化生产，产产品分离，纯纯化。5.2提高高次生代谢产产物产量的方方法（1）筛选高高产细胞系不同植物种类类，不同植株株及同一植株株的不同部位位，往往有不不同的代谢能能力；通过人工诱变变改良细胞系系；通过遗传改良良筛选细胞系系。云南红豆杉东北红豆杉中国红豆杉南方红豆杉杂种红豆杉筛选出的高效效、高产细胞胞株系，有的的植物细胞系系其高效、高高产性能稳定定多年，但有有的植物细胞胞系不稳定，，因此，还需需要定期检测测，更新细胞胞株系。培养基的营养养成分一方面面要满足植物物细胞的