基因工程的常规技术

第三章基因工程常规技术

（P32—52）电泳技术杂交技术转化技术PCR扩增技术文库构建技术测序技术第一节凝胶电泳技术Electrophoresis电泳（electrophoresis)带电物质在电场中向相反电极移动的现象

核酸凝胶电泳是分子克隆核心技术之一，用于分离、鉴定和纯化DNA或RNA片段；一、琼脂糖凝胶电泳用琼脂糖凝胶作为支持介质的区带电泳法。

琼脂糖是一种线性多糖聚合物，是从红色海藻中提取而来。在高温水溶液下会溶解，常温下凝固并形成一定大小孔径的惰性介质，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。1、原理DNA分子的磷酸基团在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下DNA分子向正极泳动琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，主要是利用琼脂糖的分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。因而就可依据DNA分子的大小使其分离。该过程可以通过把分子量标准参照物和样品一起进行电泳而得到检测。溴化乙锭（EB）为扁平状分子，在紫外光照射下发射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物，其荧光强度与DNA的含量成正比。据此可粗略估计样品DNA浓度。注意事项：EB是致癌物质，切勿用手接触，更不要污染环境。2、琼脂糖凝胶电泳的影响因素1）样品DNA分子大小和分子构型2）琼脂糖浓度p33取决于所分离DNA片段的大小3）缓冲液TAE、TBE4）电泳条件

电压：3-5V/cm时间：30-60min常用的电泳缓冲液二、聚丙烯酰酰胺凝胶电泳泳以聚丙烯酰胺胺凝胶作为支支持介质，其其分辨率高于于琼脂糖凝胶胶电泳，用于于核酸和蛋白白质的分离、、纯化及检测测。分离小片片段DNA(1—1000bp)效效果较好,其其分辩力极高高。聚丙烯酰胺由由丙烯酰胺单单体和甲叉双双丙烯酰胺聚聚合而成。三、脉冲电场场凝胶电泳（PFGE））（Pulse-fieldgelelectrophoresis）PFGE是交替变换电电场方向的电电泳，以一定定的角度一定定的时间变换换电场方向。。DNA分子在在交替变换方方向的电场中中作出反应所所需的时间取取决于它的大大小。分子越越大，改变构构象的时间就就越长，重新新定向的时间间就越长，移移动也就慢，，反之越快。。可区分长度为为50-100Kb以上上，甚至Mb级别的大片片段DNA分分子。第二节分分子杂交技术术杂交的基本原原理探针及探针标标记杂交的基本方方法一、基本原理理变性与复性杂交技术：是是利用DNA分子的变性性、复性以及及碱基互补配配对的高度精精确性，对某某一特异性DNA序列进行探查查的技术。二、探针与探探针标记探针（probe）：用作检测的被被标记的短片片段特异DNA或RNA序列。（一）探针的的种类基因组DNA探针、cDNA探探针、寡核苷苷酸探针、RNA探针（二）标记物物同位素标记：：32P、35S、3H等非同位素标记记：地高辛、、生物素、荧荧光素等切口平移法随机引物法KlenowDNA聚聚合酶3’’末端补平反反应T4多核苷酸酸激酶5‘末端引入入标记磷酸基基团末端转移酶3‘末端连连接标记的核核苷酸（三）探针标标记方法1、均匀标记记2、末端标记记法DnaseⅠ使DNA双链产生缺缺口DNA聚合酶将生生物素标记记的dNTP插入到缺口口的3`端1）切口平平移标记法法2）随机引引物法（randompriming）以6~8个个核苷酸长长的序列随随机的寡核核苷酸作为为引物，在在Klenow片段段作用下，，加入带有有标记的dNTP进进行随机扩扩增，即可可形成放射射性同位素素标记的DNA探针针。优点：由于随机引引物标记仅仅仅需要一一种酶，比比较简单，，条件易于于控制，杂杂交重复性性好，所以以应用较多多。末端标记用KlenowDNA聚聚合酶对DNA的3‘末端进进行标记用T4多核核苷酸激酶酶标记DNA5ˊ末末端p-CGA……CG-OH碱性磷酸酶酶(AKP）OH-CGA………CG-OH[γ-32P]ATPT4噬菌体多核核苷酸激酶酶（PNK）32P-CGA……….CG-OH三、分子杂杂交的基本本方法Southern杂杂交Northern杂杂交Western杂交交菌落（噬菌菌斑）原位位杂交斑点杂交（一）Southern杂交交1975年年，英国EdwenSouthern创建检测DNA杂交方法法，即将DNA电泳泳、转印到到固相支持持物上，用用探针进行行检测的方方法。Southern杂杂交主要要用来判断断某一生物物样品中是是否存在某某一基因，，以及该基基因所在的的限制性酶酶切片段的的大小。关键技术1、Southern印迹转转移：核酸酸样品在凝凝胶上进行行分离后，，通过影印印的方式转转移到固相相支持物滤滤膜上的过过程。2、分子杂杂交：将具具有核酸印印迹的滤膜膜同带有放放射性标记记的DNA/RNA探针进行行杂交。因此，核酸酸杂交也被被称为“DNA印迹迹杂交”。。1、Southern印迹转转移可以通过毛毛细管虹吸吸法或电转转移或真空空转移的方方式，将凝凝胶上的DNA转转移到硝硝酸纤维素素滤膜或尼尼龙膜上。。最后通过过80℃℃处理或或紫外线照照射将DNA固固定在滤膜膜上。吸水纸毛细管虹吸吸法Southern转膜2、分子杂杂交预杂交将将结合了DNA分分子的滤滤膜先与特特定的预杂杂液进行预预杂交，也也就是将滤滤膜的空白白处用鱼精精DNA或牛奶奶蛋白封闭闭起来，防防止在杂交交过程中滤滤膜本身对对探针的吸吸附。杂交在在一一定的溶液液条件和温温度下，将将标记的核核酸探针与与滤膜混合合，如果滤滤膜上的DNA分分子存在在与探针同同源的序列列，那么探探针将与该该分子形成成杂合双链链，从而吸吸附在滤膜膜上。洗膜经经过过一定的洗洗涤程序将将游离的探探针分子除除去。1.待测DNA样品品的制备、、酶切2.待测DNA样样品的电泳泳分离：琼琼脂糖凝胶胶电泳3.凝胶中中DNA的的变性：碱碱变性4.Southern转膜(印迹)：：毛细管虹吸吸印迹法、、电转移法法、真空转转移法5.Southern杂交(预杂交、、杂交、洗洗膜)6.杂交结结果的检测测：放射性性自显影/生化检测测Southern杂杂交流程总总结（a）（b）（c）（d）（e）基因组DNA

DNA限制片段

硝酸纤维素滤膜

同探针同源杂交的基因DNA片段

X光底片

SouthernblottingSouthernblot的结果SouthernDNA印印迹杂交交之X光显显像图片水稻（OryzasativaL.)的叶绿绿体DNA分别用核核酸内切限限制酶BglⅡ(A-C)、、BamHⅠ（D-F）、EcoRⅠⅠ（G-I）、和HindⅢⅢ（J-L）消化，，加样在含含有EtBr染料的的1%的琼琼脂糖凝胶胶电泳中作作电泳分离离，然后同同32P标标记的玉米米psbA探针作Southern杂杂交。X光光底片中显显现的阳性性条带，，表明含有有水稻的psbA基基因序列。。ABCDEFGHIJKL（二）Northern杂杂交检测特定RNA（主主要是mRNA）分分子的方法法与Southern杂交的不不同靶核酸：RNARNA电泳泳:变性性凝胶电泳泳应用：检测测在转录水水平某基因因是否表达达（三）Western杂杂交蛋白杂交/蛋白质的的免疫印迹迹检测蛋白质质，即将电电泳分离的的蛋白质转转移到固相相载体上，，通过抗体体以免疫反反应形式检检测滤膜上上是否存在在被抗体识识别的蛋白白质，并判判断其分子子量。所用用的探针不不是DNA或RNA，，而是针针对某一蛋蛋白质制备备的特异性性抗体。主要步骤蛋白质样品品的制备SDS-聚聚丙烯酰胺胺凝胶(PAGE)电泳蛋白质的电电转移靶蛋白的免免疫学检测测靶蛋白于第第一抗体（（一抗）反反应与标记的第第二抗体（（酶标二抗抗）反应显色反应：：酶促反应应Western杂杂交主要用用来检测细细胞或组织织样品中是是否存在能能被某抗体体识别的蛋蛋白质，从从而判断在在翻译水平平上某基因因表达与否否、表达量量、分子量量。酶标记的第第二抗体第一抗体膜上结合的的蛋白成分分第一抗体膜上结合的的蛋白成分分（四）菌落落（或噬菌菌斑）原位位杂交colonysituhybridization直接以菌落落或噬菌斑斑为对象来来检测重组组子的技术术。因为生长在在培养基平平板上的菌菌落或噬菌菌斑，是按按照原来的的位置不变变的转移到到滤膜上，，并在原位位发生溶菌菌、DNA变性和杂杂交作用，，故也称为为原位杂交交。（五）斑点点杂交斑点杂交是是分子杂交交中最简单单的一种，，直接将DNA或或RNA分子子以斑点的的形式固定定在滤膜上上，然后进进行分子杂杂交。当核酸分子子的斑点面面积变得更更小，在单单位面积滤滤膜上处理理的样品数数量就更多多，当检测测的灵敏度度进一步提提高后，就就发展成DNA芯芯片。9、静夜四无无邻，荒居居旧业贫。。。12月-2212月-22Thursday,December29,202210、雨中黄叶叶树，灯下下白头人。。。11:16:5611:16:5611:1612/29/202211:16:56AM11、以我独沈久久，愧君相见见频。。12月-2211:16:5611:16Dec-2229-Dec-2212、故人江海别别，几度隔山山川。。11:16:5711:16:5711:16Thursday,December29,202213、乍见翻疑梦梦，相悲各问问年。。12月-2212月-2211:16:5711:16:57December29,202214、他乡生白白发，旧国国见青山。。。29十二二月202211:16:57上上午11:16:5712月-2215、比不了得就就不比，得不不到的就不要要。。。十二月2211:16上上午12月-2211:16December29,202216、行动出成成果，工作作出财富。。。2022/12/2911:16:5711:16:5729December202217、做前，能够够环视四周；；做时，你只只能或者最好好沿着以脚为为起点的射线线向前。。11:16:57上午午11:16上上午11:16:5712月-229、没有失败，，只有暂时停停止成功！。。12月-2212月-22Thursday,December29,202210、很多事情情努力了未未必有结果果，但是不不努力却什什么改变也也没有。。。11:16:5711:16:5711:1612/29/202211:16:57AM11、成功就是是日复一日日那一点点点小小努力力的积累。。。12月-2211:16:5711:16Dec-2229-Dec-2212、世间成事，，不求其绝对对圆满，留一一份不足，可可得无限完美美。。11:16:5711:16:5711:16Thursday,December29,202213、不知香积积寺，数里里入云峰。。。12月-2212月-2211:16:5711:16:57December29,202214、意志坚强的的人能把世界界放在手中像像泥块一样任任意揉捏。29十二月月202211:16:57上午午11:16:5712月-2215、楚塞三湘接接，荆门九派派通。。。十二月2211:16上上午12月-2211:16December29,202216、少年十五五二十时，，步行夺得得胡马骑。。。2022/12/2911:16:5711:16:5729December202217、空山新雨雨后，天气气晚来秋。。。11:16:57上上午11:16上午11:16:5712月-229、杨柳散和和风，青山山澹吾虑。。。12月-2212月-22Thursday,December29,202210、阅读一切切好书如同同和过去最最杰出的人人谈话。11:16:5711:16:5711:1612/29/202211:16:57AM11、越是没有本本领的就越加加自命不凡。。12月-22