脂质过氧化及抗氧化剂抗氧化活性的检测方法

.z脂质过氧化及抗氧化剂抗氧化活性的检测方法摘要：越来越多的研究说明，很多疾病和衰老现象都与脂质过氧化有关。本文对近年来脂质过氧化与抗氧化剂抗氧化活性的检测方法作简单综述，包括气相色谱、液相色谱、质谱、化学发光法等，并对不同方法进展了综合比拟与评价。各种检测技术的对象各有不同，而且各有优缺点。因此，要针对不同的实验目的及条件来选择不同的检测方法。关键词：脂质过氧化；抗氧化剂；抗氧化活性；检测Lipidspero*idationandtheDetectionMethodsofAntio*idantactivitiesofAntio*idantsAbstractLipidpero*idationhasreceivedconsiderableattentionbecauseofitspossiblecontributiontothepotentialdamageofbiologicalsystems.Thestudyonthemechanismandtheprotectionoflipidpero*idationareconcernedtoourlivingandhealth.Lipidspero*idationandthemethodsofdeterminationofpero*idationandantio*idantactivitiesinbiologicalsystemswerereviewed,includingGaschromatography,LiquidChromatography,MS,Chemiluminescenceandsoon.Differentmethodsareparedprehensivelyandevaluated.Avarietyofdetectiontechnologieshavedifferenttargetclientele,butalsohavetheirownadvantagesanddisadvantages.Therefore,itisnecessaryfordifferente*perimentalpurposesandconditionstochooseadifferentdetectionmethod.Keyword:lipidpero*idation,antio*idant,antio*idantactivity,detection在生物体，很多脂类含有高不饱和脂肪酸，特别在生物膜的磷脂中，高不饱和脂肪酸含量极高。由于不饱和脂肪酸双键电子云密度大，化学性质很不稳定，很容易受到过氧化作用的损伤，产生有细胞毒性的脂质过氧化物。这些化合物能破坏人体细胞正常的生理功能，促使人体衰老和诱发癌症。目前，国外关于氧化应激、自由基损伤和生物抗氧化的研究主要集中在食品、化装品、生理学、流行病学和医学等领域，从分子水平上研究其作用机理、基元反响和构造/活性关系的工作尚不多见，许多根底理论问题尚待解决。因此，脂质过氧化的检测方法在反响机理的研究中就显得尤为重要。各种抗氧化物质抗氧化作用的强弱取决于其抗氧化的能力〔或称抗氧化活性，Antio*idantActivity〕。抗氧化能力的测定方法有许多种，有直接的，也有间接的，还有简便的总抗氧化能力〔TAC〕试剂盒等。这些方法都有一定的优缺点或局限性〔或专用性〕，测定原理也各不一样。因此，为获得准确的评价结论，还需综合评估各种方法，以获得满意的结果[1]。1脂质过氧化反响的机理脂质过氧化作用(LipidPero*idation)是自由基生物学的一个分支，是指脂类〔RH〕的多不饱和脂肪酸〔PUFA〕与自由基反响，形成中间体自由基，再与分子氧形成脂质过氧化自由基，引起酸败变形[2]。生物膜的脂质中含有较多的多烯不饱和脂肪酸，易发生脂质过氧化而损伤膜的功能与构造。正常生命过程产生的自由基是维持生命所必须，但假设浓度过高则对机体有害。体自由基的产生与去除处于动态平衡中，一旦平衡破坏就危害机体。环境中有多种因素促使自由基的产生，引起脂质过氧化，例如电离辐射、紫外线、臭氧、废气、杀虫剂、除草剂、光敏剂及金属离子等等[3]。自由基是指一类可以独立存在的含有未配对电子的物质，包括分子、原子、原子团或离子。假设这类物质含有不配对电子的含氧基团称为氧自由基〔O*yenFreeRadicais,OFR〕，主要包括超氧阴离子自由基〔O2-〕、过氧化氢〔H2O2〕、羟自由基〔HO•〕、单线态氧〔1O2〕等。这些不成对的电子使OFR具有不稳定性和高反响活性[4、5]。脂质过氧化过程是一个产生自由基和自由基参于的链式反响，可分为三个阶段：1.1诱导阶段〔Inductionstep〕RH→→R•+H•1.2传播阶段(Propagationstep)R•+O2→→ROO•ROO•+RH→→ROOH+R•生成的ROOH很容易发生各式各样的分解反响，例如：ROOH→→RO•+HO•RO•和HO•都是非常活泼的自由基，与RH起反响均能生成R•：RO•+RH→→ROH+R•HO•+RH→→H2O+R•1.3终止阶段(Terminationstep)各种自由基在量的增加后相互结合，链式反响终止：R•+R•→→RRROO•+R•→→ROORROO•+ROO•→→ROOR+O2式中的RH为参加反响的油脂中的不饱和底物，H是邻近双键两旁的亚甲基上的氢原子。反响过程中产生的R•、ROO•、RO•及HO•等自由基均可以由自旋共振仪测定。2脂质过氧化的检测2.1脂质过氧化底物的检测氧耗不饱和脂肪酸发生脂质过氧化的过程伴随有氧气的消耗，因此氧耗也成为检测脂质过氧化的指标之一，氧耗的测定可采用Wills测压法及氧电极法，后者较为常用。而且此法只需一个氧电极即可，利用氧电极可以很方便的测量溶液中的氧浓度，因此，可以用它检测一个反响体系中的氧消耗以研究自由基产生的动力学过程。氧气吸收的量用电子电位差计记录，它还可以连续检测脂质过氧化的进程，但体系必须是封闭的。最近，又开展起来一种自旋探针测氧法，它是利用自旋探针ESR波谱的超精细构造随氧浓度改变来测量一个反响体系中氧浓度的方法。氧气是一个顺磁性的三重态分子，它可以和自旋探针的未成对电子产生自旋相互作用，使自旋探针的ESR波谱产生自旋-自旋增宽，使本来存在的一些超精细构造无法分辨。利用超精细构造随氧气浓度的改变就可以测量该体系中浓度和氧的消耗。但利用这一方法测量生物体系氧消耗的时间不能太长，也不能有氧化复原反响。增重法脂质过氧化过程中必定要吸收一定的氧，底物吸氧后形成过氧化物增重。通过对氧化混合物作NMR分析，由乙烯基质子峰面积可以得出不饱和脂肪酸氧化随时间变化的情况。此法只适用于常温下的反响，且底物体系中无易挥发的物质。2.2脂质过氧化产物的检测脂自由基在脂质过氧化进程中会产生许多自由基如R•、ROO•、RO•、HO•等，这些自由基含有一个未成对电子，这就决定了具有顺磁性和很高的反响活性。所有检测自由基的方法都是根据自由基这两个特性开展起来的，这些方法可分为物理方法和化学方法两大类。所有检测自由基的方法原则上都可以检测氧自由基。但氧自由基具有它自己的特性，所以还有一些检测氧自由基的特殊方法。电子自旋共振(electronspinresonance,ESR)，又称电子顺磁共振〔electronparamagneticreonance,EPR〕，是检测自由基最直接和最有效的方法。根据共振条件hv=gβH，一个ESR波谱仪就是一套用来测量自由基时要满足这个共振条件的设备。一般ESR波谱仪都是固定频率，通过改变磁场来满足共振条件，因此，称为扫场式。由于高频微波热效应很大，特别对含水样品，水对微波吸收很厉害，所以，一般高频ESR波谱仪不能测量活体中的自由基。最近开展起来的低频L波段ESR波谱仪解决了这一问题，一是热效应低，二是样品腔大，可以容纳大体积样品，甚至活体动物。近年来开展起来的自旋捕集技术具有更广的应用空间。所谓自旋捕集技术就是为了检测和识别短寿命自由基，将一种不饱和的抗磁性物质〔称自旋捕集剂，一般为氨酮和亚硝基化合物〕参加要研究的反响体系，生成寿命较长的自旋加合物，可以用ESR检测：自旋捕集剂+R•→→自旋加合物最常用的自旋捕集剂是tNB(nitrosotert-butane)、DMPO(5,5-dimethyl-pyrroline-1-o*ide)和PBN(phenyl-tert-butynitrone)，它们和自由基反响都可以生成氮氧自由基，所得ESR波谱的一级分裂都是氮原子引起的三重分裂，这一点和自旋标记所得到的ESR波谱很类似。但是，自旋加合物的ESR波谱常常被分裂为二、三级更复杂的图谱，由二、三级分裂峰制得的数目和强度可以推导出捕捉到自由基的构造和性质。共轭二烯氢过氧化物〔CDHP〕不饱和脂肪酸的侧链氧化过程中伴随有CDHP的生成，该共轭二烯构造在紫外区234nm附近具有很强的特征吸收，因此可以利用这一特征对脂质过氧化进展检测。该法操作简单，用一个简单的紫外分光光度计即可。该法适用于检测纯度较高的脂质过氧化反响，因为反响体系中的其他底物也可能在这个波长围有吸收。另一个误差来源于脂肪酸本身在紫外区〔210nm〕的吸收和CDHP〔234nm〕的吸收只差20nm，并且CDHP本身也是一个不稳定的化合物。因此，CDHP含量的多少不能准确反映脂质过氧化的程度，它只能局部地反映氧化初始阶段脂质过氧化的程度。2.3脂质过氧化降解产物的检测脂质过氧化物很不稳定，可自发降解成小分子的复杂产物，如醛、酮、烷烃、烯烃、酸及聚合物等。对这些降解产物的检测被认为是最能有效的反映脂质过氧化的水平。其中丙二醛〔MDA〕是脂质过氧化的最典型的终产物。化学发光法(CL)发光是处于高能激发态的分子或原子向基态跃迁时，发射光子的现象。化学发光法是由化学反响引发的，发射光可以是紫光、可见或近红外光。能产生发光反响的化合物〔有机物或无机物〕很多，典型的反响可以表示为：〔※表示激发态〕A+B→→C※+DC※→→C+光化学发光法中，常用一些发光增强剂来提高检测的灵敏度，常用试剂有鲁米诺(luminal)、洛粉碱(luphine)、光泽精(lucigenin)和过氧物(pero*yo*adate)等。化学发光的测定最大优点是不需要对反响体系加热，因为即使在室温条件下反响的速度也是非常快的。将HPLC别离与化学发光法联用，可以使检测限到达皮摩尔级。采用HPLC柱后，检测技术还克制了HPLC受抗氧化剂干扰的缺点，从而可以通过测定保存时间来鉴定脂质氢过氧化物的性质。0.01nm的脂质过氧化物很容易检出，反相液相色谱能使氢过氧化物得到很好的别离。化学发光法有灵敏度高、平安性好、适用围广、发射率易控制等优点，故已在分析化学中得到广泛应用，但它也存在着有些反响观察时间长、重现性差的缺点。烃和脂质被氧化时会发光，这与氧化过程中不同步骤产生的自由基有关。化学发光的强度越大通常说明氧化程度也就是脂质酸败的程度越大。该法已用于测定豆油、方便面、奶粉和菜籽油等的氧化程度，亦可用于水产品脂质过氧化的检测[6]。荧光法脂质过氧化产生的羰基化合物如丙二醛〔MDA〕可以和蛋白质、氨基酸反响生成含有N-C=C-C=N构造并发荧光的烯夫碱〔Schiffbase〕。此碱具有典型的荧光激发光谱和发射光谱光谱〔420-470nm〕。因此，用荧光分光光度计测定其荧光的相对强度，可间接反映脂质过氧化的水平。此法灵敏度高，且可以反映丙二醛与体蛋白质的相互作用，具有重要的生物学意义。这一检测方法的机理很复杂，但灵敏度高，通常需要与标准荧光物质进展比拟，以相对荧光强度作为脂质过氧化程度的表示。硫代巴比妥酸法〔TBA〕TBA试验自1944年由Kohn和Liversedge提出即应用于食品和生物材料中脂类氧化的检测和定量，其应用程度居所有测试方法之首[7]。硫代巴比妥酸法是基于不饱和脂肪酸通过自由基反响，形成氧化自由基而氧化生成环氧化合物，环氧化合物分解生成丙二醛〔MDA〕，MDA与硫代巴比妥酸〔TBA〕作用生成TBA染料配合物。所以，TBA染料配合物形成的多少是衡量自由基氧化反响进展程度的标志。TBA试验是用2-硫代巴比妥酸与脂类氧化产物丙二醛相互作用生成一种粉红色化合物，此化合物在532nm下有最大吸收值。通常测试结果表示为532nm下的吸光值与丙二醛吸光系数之积，即通常所说的TBA值。由于TBA法检测到的MDA并不完全由脂质过氧化产生的，并且严格来说TBA对MDA也并不具有绝对专一性，更准确表示TBA试验结果的术语应该不是丙二醛浓度，而是TBARS〔可与TBA反响的物质的缩略语〕。作为测定脂类氧化的一个综合指标，TBA试验有着非常实用的价值。在考虑到干扰因素的前提下，TBA实验本身所具有的简洁、迅速、要求仪器少、一次可处理大批样的特点，应该在测定食品特别是肉类食品和生物体系的脂肪氧化是有着广泛用途[8]。气相色谱法在脂质氧化过程中，有戊烷、己烷等物质生成，戊烷可进一步被动物代，己烷则可经气体交换后排放于呼气之中，应用气相色谱分析技术检测己烷是衡量脂质过氧化水平的常用指标之一。该法广泛用于完整的动物、灌流肝脏、肝细胞等脂质过氧化测定[9]。3抗氧化剂抗氧化活性的检测抗氧化剂是指能防止或延缓食品成分氧化变质的食品添加剂。按溶解性分为油溶性与水溶性两类：油溶性的有丁基羟基茴香醚〔BHA〕、二丁基羟基甲苯〔BHT〕、叔丁基对苯二酚〔TBHQ〕、没食子酸丙酯〔PG〕等，水溶性的有异抗坏血酸及其盐等。按来源可分为天然的与人工合成的两类：天然的有生育酚、茶多酚等，人工合成的有丁基羟基茴香醚等。抗氧化剂的作用原理是阻断氧化反响链，自身抢先氧化，抑制氧化酶类的活性，络合铜、铁等金属离子，以消除其催化活性等等。它的作用原理在于防止或延缓食品氧化反响的进展，但不能在食品发生氧化反响后而使之复原[10]。3.1高效液相色谱法〔HPLC〕下面以几种常见的抗氧化剂说明HPLC法的应用，如没食子酸丙酯〔PG〕、叔丁基羟基苯甲醚〔BHA〕和2，6-二叔丁基对甲酚〔BHT〕为例。它们的测定方法大多采用光度法，气相色谱法等，样品前处理繁琐、费时，而用高效液相色谱测定十分方便。采用HP1090高效液相色谱仪、漩涡振荡器、LD4-2型离心机和1000uL吸液器等仪器。ODS-Hypersil(C18)高速色谱柱〔60*4.6mmI.D.,3um〕；检测波长UV280nm；流动相：10min，由20%乙腈水溶液线性梯度变为100%乙氰，乙腈和水均各加5%醋酸；流速0.8mL/min；进样量5uL，灵敏度0.064AUFS[11]。由检测结果可以看出，用微量化学法〔MICCM〕技术处理样品，不仅减少了分析试样量，而且还减少了溶剂和试剂的用量，最大的优点是提高了分析速度。为便于屡次提取，先用少量正己烷将样品均匀分散，再用乙腈提取，提取液过C18微柱净化，以取出同时提取的脂溶性物质、色素和其它杂质，不仅保护了反相色谱柱，而且使三种抗氧化剂到达有效的别离，分辨率大大提高[12]。3.2紫外可见分光光度法利用脂质体体外氧化试验，对γ-谷维醇及其水解物的抗氧化性进展研究为例。γ-谷维醇有一些特殊的生理功能，如降血脂、抗氧化、抗衰老、去自由基等。试验步骤为：每次从三角瓶中取出100uL培养液于试管中〔2个平行〕，参加10mL无水乙醇，混匀后，以甲基为空白，用1cm的石英皿，在234nm波长下用紫外分光光度计测定吸光度。通过对样品在234nm的紫外吸收的测定，来观察其氧化的过程和程度，并可以考察抗氧化剂对氧化程度的影响。开场氧化时，氢过氧化物产生的量逐渐增多，吸光度值也随着增大，最后到达最大值。随着氧化地进展，氢过氧化物的分解也加快，吸光度值又逐渐变小，抗氧化剂的作用是阻止自由基的传递，减缓氧化进程，吸光度峰值推迟出现。抗氧化剂的活性越强，峰值出现越晚。由试验结果可以看出γ-谷维醇具有一定的抗氧化能力，且抗氧化能力与浓度相关，最有效的抗氧化浓度为100umol/L，低于50umol/L已无抗氧化作用[13]。紫外光谱仪价格廉价，操作简便快速，是有机化合物分析中的重要工具。由于采用UV9100时最大吸收的位置不固定，而选择*一波长下的吸光度做回归得出的回归系数不同，所以必须确定选择哪一波长下的吸光度做回归分析。此试验选择234nm处的吸光值做回归分析较为适宜[14]。3.3其他方法水溶液体系利用Fenton反响体系产生羟自由基，采用ESR自旋捕集技术进展检测，可以定量测定天然抗氧化剂在水溶液中对羟自由基的去除作用。这一方法简单易行，特异性好，也可以用化学发光法进展检测。光照体系利用光照过氧化氢可以产生羟自由基，光照核黄素/EDTA可以产生超氧阴离子自由基。采用ESR自旋捕集，可以定量测定天然抗氧化剂在光照体系对羟基和超氧阴离子自由基的去除作用。酶体系利用黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶反响可以产生超氧阴离子自由基，采用ESR自旋捕集或化学发光法可以定量测定天然抗氧化剂在酶体系对超氧阴离子自由基的去除作用。4完毕语检测脂质过氧化和抗氧化剂抗氧化活性的方法各有优缺点，手段不同，反映的侧面也不同。ESR无疑是研究脂质过氧化自由基机理的最好方法，但仪器太昂贵；高效液相色谱、荧光法和气相色谱法定量明确，特异性好，但也都存在仪器昂贵、操作繁琐的问题；TBA-MDA法，设备要求低，但由于生物体系存在着多种干扰物质，以及常规比色法的非专一性，使得灵敏度差。可以说没有哪种方法可以单独准确的评价脂质过氧化行为以及*种抗氧化剂的抗氧化性能。因此，实验中只能根据自己的实验条件和目的来选择不同的检测方法或者选择几种