生物选修3基因工程的基本操作程序上课用课件

1.2基因工程的基本操作程序

1.2基因工程的基本操作程序能够发光的热带鱼能够发光的热带鱼基因工程的基本操作程序（1）目的基因的获取（2）（3）将目的基因导入受体细胞（4）目的基因的检测与鉴定基因表达载体的构建基因工程的基本操作程序（1）目的基因的获取基因表达载体的构建基因工程的基本操作程序：一：目的基因的获取

获取目的基因是实施基因工程的第一步。目的基因：主要是指能编码蛋白质的基因。例如：与生物抗逆性相关的基因、与优良品质相关的基因等。

基因工程的基本操作程序：获取目的基因是实施基因工程获取目的基因的方法：1.从基因文库中提取2.利用PCR技术扩增基因组文库部分基因文库3.化学方法人工合成获取目的基因的方法：1.从基因文库中提取2.利用PCR技术扩1.什么叫基因文库？

将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。

基因组文库：用限制酶切割一种生物的全部DNA，可以得到大量的DNA片段，然后将这些DNA片段与载体连接，再转化到细菌中去，让受体菌不停分裂。这样，每个受体菌包含有特定的基因组DNA片段，整个受体菌群体就包含这种生物的全部基因称为基因组文库。1.什么叫基因文库？2、部分基因文库：部分基因文库：只包含了一种生物的一部分基因，这种基因文库叫做部分基因文库，例：cDNA文库。用某种生物发育的某个时期的mRNA为模板，经反转录酶催化，在体外反转录成cDNA，与常用载体噬菌体或质粒载体连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这个受体菌群体就叫做这种生物的cDNA文库。2、部分基因文库：部分基因文库：只包含了一种生物的一部分基因组文库的构建模式图通过对受体菌的培养而储存基因基因组文库的构建模式图通过对基因组DNA文库cDNA文库基因组DNA文库与cDNA文库的比较基因组DNA文库cDNA文库基因组DNA文库与cDNA文库的cDNA文库和基因组文库的比较

文库类型cDNA文库基因组文库文库大小小大基因中启动子无有基因组中内含子无有基因多少某种生物的部分基因某种生物的全部基因物种间的基因交流可以部分基因可以cDNA文库和基因组文库的比较

文库类型cDNA文库基因组补：原核细胞的基因结构非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游与RNA聚合酶结合位点启动子终止子

RNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。转录开始后，RNA聚合酶沿DNA分子移动，并以DNA分子的一条链为模板合成RNA。转录完毕后，RNA链释放出来，紧接着RNA聚合酶也从DNA模板链上脱落下来。补：原核细胞的基因结构非编码区非编码区编码区编码区上游编码①不能转录为信使RNA，不能编码蛋白质。：能转录相应的信使RNA，能编码蛋白质编码区非编码区原核细胞的基因结构②有调控遗传信息表达的核苷酸序列，在该序列中，最重要的是位于编码区上游的RNA聚合酶结合位点。非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游启动子终止子①不能转录为信使RNA，不能：能转录相应的信使RNA，能真核细胞的基因结构编码区非编码区非编码区与RNA聚合酶结合位点内含子外显子能够编码蛋白质的序列叫做外显子不能够编码蛋白质的序列叫做内含子启动子终止子编码区上游编码区下游内含子：外显子：真核细胞的基因结构编码区非编码区非编码区与RNA聚合酶内含子结构基因外显子内含子转录、加工修饰mRNA结构基因外显子内含子转录、加工修饰mRNA结构基因外显子内含子转录、加工修饰mRNA结构基因外显子内含子转录、加工修饰mRNA真核细胞的基因结构编码区非编码区:外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列

有调控作用的核苷酸序列，包括位于编码区上游的RNA

聚合酶结合位点。非编码序列：包括非编码区和内含子真核细胞的基因结构编码区非编码区:外显子：能编码蛋白质的原核细胞真核细胞不同点编码区是_____的编码区是间隔的、_____的相同点都由能够编码蛋白质的______

和具有调控作用的______

区组成的原核细胞与真核细胞的基因结构比较思考编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？连续不连续编码区非编码原核细胞真核细胞不同点编码区是编码区是间隔的、_____的都如何从基因文库中得到所需要的基因？依据：目的基因的有关信息如：根据基因的核苷酸序列基因的功能基因在染色体上的位置基因的转录产物mRNA基因翻译产物蛋白质等特性如何从基因文库中得到所需要的基因？依据：目的基因的有关信息（1）从基因组文库中获取：限制酶供体细胞中的DNA许多DNA片段运载体与载体连接受体细胞产生特定性状导入外源DNA扩增目的基因分离（1）从基因组文库中获取：限制酶供体细胞中的DNA许多DNA以目的基因转录成的信使RNA为模板，再反转录酶的催化下反转录成互补的单链DNA，然后在DNA聚合酶的作用下合成双链DNA，即cDNA，从而获得所需的基因。（2）从部分基因文库中获取（例cDNA文库的构建方法）以目的基因转录成的信使RNA为模板，再反转录酶的（3）根据已知的氨基酸序列人工合成DNA法：根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使RNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出它的结构基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测目的基因化学合成（3）根据已知的氨基酸序列人工合成DNA法：上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？优点缺点从基因组文库中获取从部分基因文库中获取根据已知氨基酸合成DNA法操作简便广泛使用工作量大，盲目，专一性差，分离出来的有时并非一个基因专一性强操作过程麻烦，mRNA很不稳定，要求的技术条件较高专一性最强仅限于合成核苷酸对较少的简单基因，适用范围小上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？优点缺点从基因组文库中

4.利用PCR技术扩增目的基因

称多聚酶链式反应穆里斯等人于1988年发明的。PCR是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。

4.利用PCR技术扩增目的基因

称多聚酶链式反应利用PCR技术扩增目的基因利用PCR技术扩增目的基因1234522557294时间（min）温度（℃）PCR反应PCR反应条件PCR过程PCR的特点适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍1234522557294时间（min）温度（℃）PCR反应模板DNA95℃模板DNA95℃PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点50℃引物1引物2DNA引物PCR的基本原理PCR反应条件50℃引物1引物2DNA引物PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶PCR的基本原理PCR反应条件引物1引物2DNA引物72℃TTaq

DNA聚合酶（thermusaquaticus)酶活性(%)温度(℃)40506070809010010080604020TaqDNA聚合酶（thermusaquaticus)酶PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃第1轮结束第2轮开始PCR的基本原理PCR反应条件72℃第1轮结束第2轮开始PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理PCR反应条件95℃50℃72℃TaqTaqPCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃第2轮结束PCR的基本原理PCR反应条件72℃第2轮结束生物选修3基因工程的基本操作程序上课用课件PCR的基本反应步骤变性90-95˚C延伸70-75˚C复性55-60˚CPCR总结：PCR的基本反应步骤变性延伸复性55-60˚CPCR总结：变性：加热至90～95℃双链DNA解链成为单链DNA复性：冷却至55～60℃部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合延伸：加热至70～75℃以目的基因为模板，合成互补的新DNA链变性复性延伸变性：加热至90～95℃双链DNA解链成为单链DNA变性复性①概念：PCR全称为_______________，是一项在生物____复制___________的核酸合成技术。③前提条件：_______________________；原料：___________、___________、__________________、________________。②原理：__________④方式：以_____方式扩增，即____（n为扩增循环的次数）⑤结果：聚合酶链式反应体外特定DNA片段DNA复制已知基因的核苷酸序列四种脱氧核苷酸DNA引物热稳定DNA聚合酶指数2n使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增模板DNA①概念：PCR全称为_______________，是一项生物选修3基因工程的基本操作程序上课用课件PCR技术扩增与DNA复制的比较PCR技术DNA复制相同点原理原料条件不同点解旋方式场所酶结果碱基互补配对四种脱氧核苷酸模板、能量、酶DNA在高温下变性解旋解旋酶催化体外复制细胞核内热稳定的DNA聚合酶细胞内的DNA聚合酶大量的DNA片段形成整个DNA分子PCR技术扩增与DNA复制的比较PCR技术DNA复制相同点原PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点重复30轮后230=1,073,741,824模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增理想拷贝数=2nn循环次数实际拷贝数=(1+x)nX平均效率,约为0.85n循环次数

PCR的基本原理PCR反应条件重复30轮后模板DNA第1轮扩人工合成(基因比较小)DNA合成仪人工合成(基因比较小)DNA合成仪从基因文库中获取利用PCR技术扩增利用化学方法人工合成归纳：获取目的基因的方法从基因文库中获取归纳：获取目的基因的方法

用一定的_____切割质粒，使其出现一个切口，露出____________。用_____________切断目的基因，使其产生_________________。

将切下的目的基因片段插入质粒的______处，再加入适量___________，形成了一个重组

DNA分子（重组质粒）限制酶黏性末端同一种限制酶相同的黏性末端切口DNA连接酶1.过程:二基因表达载体构建——

核心用一定的_____切割将切下的目的基因片段插入质粒的_质粒DNA分子限制酶处理一个切口两个黏性末端两个切口获得目的基因DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）同一种过程:质粒DNA分子限制酶处理一个切口两个切口DNA连接酶重组DN2.构建基因表达载体的目的（1）使目的基因在受体细胞中稳定存在并可以遗传给下一代；（2）使目的基因能够表达和发挥作用。2.构建基因表达载体的目的

科学家在培育抗虫棉时，经历了多次失败，才获得成功。起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基因在棉花体内没有表达。然后在插入抗虫基因的质粒中插入启动子(抗虫基因首端)，导入棉花受精卵，长成的棉花植株还是没有抗虫能力。科学家又在有启动子、抗虫基因的质粒中插入终止子(抗虫基因末端)，导入棉花受精卵，结果成长的植株，有了抗虫能力。资料:科学家在培育抗虫棉时，经历了多次失败，才获得成功。资思考：作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？（P15）

不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是：思考：作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗（1）生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达；（2）通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；（3）目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；（4）为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子（增强基因启动子工作效率的顺式作用序列，能够在相对于启动子的任何方向和任何位置(上游或下游)上都发挥作用。）等；（5）有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。（1）生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动3.基因表达载体的组成：它们有什么作用？a、目的基因b、启动子c、终止子d、标记基因3.基因表达载体的组成：它们有什么作用？a、目的基因b、启动调节基因操纵基因结构基因RNA聚合酶半乳糖苷酶酶酶

RNA聚合酶启动子RNA聚合酶启动子：位于基因首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质。调节基因操纵基因结构基因RNA聚合酶半乳糖苷酶酶酶思考1：

表达载体为什么一定要有启动子？（1）生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能有利于基因的表达；（2）通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体细胞无法转录。思考1：

表达载体为什么一定要有启动子？（1）生物之间进思考2：终止子的作用是什么？

终止子是位于基因尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录。是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来。思考3：标记基因有什么作用？思考2：终止子的作用是什么？是为了鉴别受体细胞①载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构。注意②用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键。③启动子、终止子对于目的基因表达必不可少。④目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。①载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DN基因工程技术路线基因工程技术路线三、将目的基因导入受体细胞常用的受体细胞：有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。将目的基因导入受体细胞的原理：借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。（一）转化：目的基因进入_________内，并且在受体细胞内维持_____和_____的过程受体细胞稳定表达三、将目的基因导入受体细胞常用的受体细胞：有（二）方法将目的基因导入植物细胞将目的基因导入动物细胞将目的基因导入微生物细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法——显微注射法——感受态细胞（二）方法将目的基因导入将目的基因导入将目的基因导入农杆菌转1.将目的基因导入植物细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法1.将目的基因导入植物细胞农杆菌转化法（1）农杆菌转化法①特点：

易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力②原理：

Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。（1）农杆菌转化法①特点：②原理：③转化过程:Ti质粒目的基因构建表达载体导入植物细胞插入植物细胞染色DNA表达新性状转入农杆菌③转化过程:Ti质粒构建表达载体导入植物细胞插入植物细胞染色

基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。（2）基因枪法适用于单子叶植物基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将（3）花粉通道法植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。适用于被子植物（3）花粉通道法植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过胚珠花药花丝柱头花柱子房壁子房雄蕊雌蕊胚珠花药花丝柱头花柱子房壁子房雄蕊雌蕊2.将目的基因导入动物细胞（1）方法：显微注射法（将基因表达载体提纯，用显微仪注射到受精卵中）思考：为什么要用受精卵而不用体细胞？2.将目的基因导入动物细胞（1）方法：显微注射法（将基因表达（2）操作程序:提纯含目的基因表达载体取受精卵显微注射移植到子宫受精卵发育新性状动物（2）操作程序:提纯含目的基因表达载体取受精卵显微注射移植到常用法：Ca2+处理常用菌：大肠杆菌微生物作受体细胞原因：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少过程：Ca2+处理大肠杆菌感受态细胞表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA3.将目的基因导入微生物细胞思考：为什么要用Ca2+处理受体细胞？用Ca2＋处理，增加细菌细胞壁的通透性常用法：Ca2+处理常用菌：大肠杆菌微生物作受体细胞原因：过培养培养培养导入含目的基因的重组质粒导入大肠杆菌含有氨苄青霉素的完全培养基含有四环素的完全培养基两种培养基均不能生长大肠杆菌Ca2+

处理细胞形成感受态细胞检测（培养不具有氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因的大肠杆菌）只有氨苄青霉素抗性基因质粒只具有氨苄青霉素抗性基因大肠杆菌不具有氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性积基因的大肠杆菌完全培养基培养培养培养导入含目的基因的重组质粒导入大肠杆菌含有氨苄青霉导入接种培养接种培养接种培养含有四环素的完全培养基完全培养基大肠杆菌不含抗四环素基因证明：不存活含有四环素的完全培养基证明：

大肠杆菌的受体细胞含有目的基因

四环素抗性基因

四环素抗性基因存活如何把导入了目的基因的受体细胞筛选出来？存活导入接种培养接种培养接种培养含有四环素的完全培养基完全培养基导入接种培养接种培养接种培养接种培养含有四环素的完全培养基完全培养基大肠杆菌不含抗四环素基因证明：不存活含有四环素的完全培养基证明：大肠杆菌含抗四环素基因证明：

大肠杆菌的受体细胞含有目的基因

四环素抗性基因

四环素抗性基因完全培养基存活如何把导入了目的基因的受体细胞筛选出来？导入接种培养接种培养接种培养接种培养含有四环素的完全培养基完受体生物植物动物微生物受体细胞导入方法受精卵体细胞受精卵细胞/个体农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法显微注射技术用Ca2+处理成感受态细胞采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基因的作法正确的是（）

A.将毒素蛋白注射到受精卵中

B.将编码毒素蛋白的DNA序列，与质粒重组，导入细菌，用该细菌感染棉的体细胞，再进行组织培养

C.将编码毒素蛋白的DNA序列，与质粒重组，注射到棉的子房并进入受精卵

D.将编码毒素蛋白的DNA序列，注射到棉受精卵中BC受体生物植物动物微生物受体细胞导入方法受精卵四、目的基因的检测与鉴定检测:是否插入目的基因是否转录是否翻译鉴定:分子水平鉴定个体生物学水平鉴定四、目的基因的检测与鉴定检测:1、检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因①首先取出转基因生物的基因组DNA；（1）方法:DNA分子杂交（2）过程:②

将含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记,以此做探针；③

使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明染色体已插入染色体DNA中。（一）检测1、检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因①首先基因探针：是一段带有检测标记，且序列已知的，与目的基因互补的核酸序列。基因探针通过分子杂交与目的基因结合，产生杂交信号，能从浩翰的基因组中把目的基因显示出来。基因探针：是一段带有检测标记，且序列已知的，与目的基因互补的DNA分子杂交示意图

采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。DNA分子杂交示意图采用一定的技术手段，将两种生物（二）鉴定（个体生物学水平）2、检测目的基因是否转录出了mRNA3、检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等①方法:分子杂交方法:抗原-抗体杂交②过程:用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,表明目的基因转录出了mRNA。（二）鉴定（个体生物学水平）2、检测目的基因是否转录出了mR提取（3）检测目的基因是否翻译成蛋白质方法——抗原-抗体杂交苏云金杆菌Bt毒素蛋白将Bt毒蛋白注射小鼠体内从小鼠血管抽出血液分离出抗Bt毒素的抗体抗体蛋白质

出现杂交带脱分化组织培养提取（3）检测目的基因是否翻译成蛋白质方法——抗原-抗体杂交若不能表达，要对抗虫基因再进行修饰。怎样检验抗虫基因在棉细胞内是否表达呢？没有抗虫基因的棉植株有抗虫基因的棉植株棉铃虫虫没有死虫被杀死没有表达目的基因表达若不能表达，要对抗虫基因再进行修饰。怎样检验抗虫基因在棉细胞鉴定——抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。鉴定——抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等例：用棉铃饲喂棉铃类型步骤检测内容方法结果显示分子检测第一步目的基因是否进入受体细胞DNA分子杂交（DNA和DNA之间）是否成功显示出杂交带第二步目的基因是否转录出mRNA分子杂交技术（DNA和mRNA之间）是否成功显示出杂交带第三步目的基因是否翻译出蛋白质抗原—抗体杂交是否成功显示出杂交带个体水平鉴定包括抗虫、抗病的接种实验，以确定是否有抗性以及抗性的程度；基因工程产品与天然产品的活性比较，以确定功能是否相同等。目的基因的表达和检测类型步骤检测内容方法结果显示分子检测第一步目的基因是否进入受提示：

①DNA分子杂交技术首先提取受体细胞中的DNA，然后高温解成单链，再与同位素标记的DNA探针杂交；

②抗原－抗体杂交所用到的抗体是用表达出的蛋白质注射动物进行免疫，产生相应的抗体，并提取出而来的。提示：归纳:基因工程的基本操作程序获取目的基因从基因文库利用PCR化学方法人工合成构建基因表达载体目的基因、启动子、终止子、标记基因将目的基因导入受体细胞转化法（微生物）、农杆菌转化法（植物）、显微注射法（动物）目的基因的检测与鉴定检测：是否插入、转录、翻译归纳:基因工程的基本操作程序获取目的基因为什么要构建基因文库？直接从含有目的基因的生物体内提取不行吗？构建基因文库是获取目的基因的方法之一，并不是唯一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通过PCR方式从含有该基因的生物的DNA中，直接获得，也可以通过反转录，用PCR方式从mRNA中获得，不一定要构建基因文库。但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想从一种生物体内获得许多基因，或者想知道这种生物与另一种生物之间有多少基因不同，或者想知道一种生物在个体发育的不同阶段表达的基因有什么不同，或者想得到一种生物的全基因组序列，往往就需要构建基因文库。为什么要构建基因文库？直接从含有目的基因的生物体内提取不行吗利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？

有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。寻根问底：利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功能的根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理,你能分析出农杆菌不能将目的基因不能导入单子叶植物的原因吗?若将一个抗病基因导入小麦中,理论上讲你应该怎样做?①要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物；②要加趋化和诱导的物质，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）和激活农杆菌的诱导的基因，使T-DNA转移并插入到染色体DNA上。酚类诱导物主要在双子叶植物细胞壁中合成，通常不存在于单子叶植物中根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理,你能分析出农4.β-珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分异常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。假如让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的β-珠蛋白，想一想，应如何进行设计？（1）从小鼠中克隆出β-珠蛋白基因的编码序列（cDNA)。（2）将cDNA前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，另外加上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。（3）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未进入大肠杆菌中，大肠杆菌会不含有抗四环素基因而死掉；如果培养基上长出大肠杆菌菌落，则表明β-珠蛋白基因已进入其中。（4）培养进入了β-珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破碎后从中提取β-珠蛋白。4.β-珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分异常时①检测是否插入目的基因，利用DNA分子杂交技术，目的基因DNA一条链（作探针）与受体细胞中提取的DNA杂交，看是否有杂交带。②检测是否转录出了mRNA，利用分子杂交技术，目的基因DNA一条链（作探针）与受体细胞中提取的mRNA杂交，看是否有杂交带。③检测目的基因是否翻译成蛋白质。抗体与蛋白质进行抗原－抗体杂交，看是否有杂交带。④还可以进行个体水平的鉴定，根据其性状。提示：①DNA分子杂交技术首先提取受体细胞中的DNA，然后高温解成单链，再与同位素标记的DNA探针杂交；②抗原－抗体杂交所用到的抗体是用表达出的蛋白质注射动物进行免疫，产生相应的抗体，并提取出而来的。①检测是否插入目的基因，利用DNA分子杂交技术，目的基因DN生物选修3基因工程的基本操作程序上课用课件三种印迹技术的比较三种印迹技术的比较分子杂交实验①②③分子杂交实验①②③放射自显影照片放射自显影照片DNA链末端合成终止法DNA链末端合成终止法生物选修3基因工程的基本操作程序上课用课件1.下列有关PCR过程的叙述中不正确的是（）A．变性过程中破坏的是DNA分子内碱基对之间的氢键，也可利用解旋酶实现B．复性过程中引物与DNA模板链的结合是依靠碱基互补配对原则完成C．延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP、四种核糖核苷酸D．PCR与细胞内DNA复制相比所需要酶的最适温度较高C1.下列有关PCR过程的叙述中不正确的是（）3.PCR技术扩增DNA,需要的条件是（）①目的基因②引物③四种脱氧核苷酸④DNA聚合酶等⑤mRNA⑥核糖体A、①②③④B、②③④⑤C、①③④⑤D、①②③⑥A2.获取目的基因的方法有多种，下列不属于目的基因获取方法的是（）A、从基因组文库中获取B、从cDNA文库中获取C、从含目的基因生物细胞中获取D、利用PCR技术获取C3.PCR技术扩增DNA,需要的条件是（）A22008年诺贝尔化学奖授予了“发现和发展了水母绿色荧光蛋白“的三位科学家。将绿色荧光蛋白基因的片段与目的基因连接起来组成一个融合基因，再将该融合基因转入真核生物细胞内，表达出的蛋白质就会带有绿色荧光。绿色荧光蛋白在该研究中的主要作用是A．追踪目的基因在细胞内的复制过程B．追踪目的基因插入到染色体上的位置C.追踪目的基因编码的蛋白质在细胞内的分布D．追踪目的基因编码的蛋白质的空间结构。C2008年诺贝尔化学奖授予了“发现和发展了水母绿色荧光蛋白“继哺乳动物乳腺生物反应器研发成功后，膀胱生物反应器的研究也取得了一定进展。最近，科学家培育出一种转基因小鼠，其膀胱上皮细胞可以合成人的生长激素并分泌到尿液中。请回答：（1）将人的生长激素基因导入小鼠受体细胞，常用方法是____________________。（2）进行基因转移时，通常要将外源基因转入__________中，原因______________________（3）通常采用____________________技术检测外源基因是否插入了小鼠的基因组。（4）在研制膀胱生物反应器时，应使外源基因在小鼠的__________细胞中特异表达。显微注射技术受精卵受精卵（或早期胚胎细胞）具有全能性，可使外源基因在相应的组织细胞中表达。DNA分子杂交膀胱上皮（或早期胚胎）继哺乳动物乳腺生物反应器研发成功后，膀胱生物反应器的研究也取生物选修3基因工程的基本操作程序上课用课件

1.2基因工程的基本操作程序

1.2基因工程的基本操作程序能够发光的热带鱼能够发光的热带鱼基因工程的基本操作程序（1）目的基因的获取（2）（3）将目的基因导入受体细胞（4）目的基因的检测与鉴定基因表达载体的构建基因工程的基本操作程序（1）目的基因的获取基因表达载体的构建基因工程的基本操作程序：一：目的基因的获取

获取目的基因是实施基因工程的第一步。目的基因：主要是指能编码蛋白质的基因。例如：与生物抗逆性相关的基因、与优良品质相关的基因等。

基因工程的基本操作程序：获取目的基因是实施基因工程获取目的基因的方法：1.从基因文库中提取2.利用PCR技术扩增基因组文库部分基因文库3.化学方法人工合成获取目的基因的方法：1.从基因文库中提取2.利用PCR技术扩1.什么叫基因文库？

将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。

基因组文库：用限制酶切割一种生物的全部DNA，可以得到大量的DNA片段，然后将这些DNA片段与载体连接，再转化到细菌中去，让受体菌不停分裂。这样，每个受体菌包含有特定的基因组DNA片段，整个受体菌群体就包含这种生物的全部基因称为基因组文库。1.什么叫基因文库？2、部分基因文库：部分基因文库：只包含了一种生物的一部分基因，这种基因文库叫做部分基因文库，例：cDNA文库。用某种生物发育的某个时期的mRNA为模板，经反转录酶催化，在体外反转录成cDNA，与常用载体噬菌体或质粒载体连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这个受体菌群体就叫做这种生物的cDNA文库。2、部分基因文库：部分基因文库：只包含了一种生物的一部分基因组文库的构建模式图通过对受体菌的培养而储存基因基因组文库的构建模式图通过对基因组DNA文库cDNA文库基因组DNA文库与cDNA文库的比较基因组DNA文库cDNA文库基因组DNA文库与cDNA文库的cDNA文库和基因组文库的比较

文库类型cDNA文库基因组文库文库大小小大基因中启动子无有基因组中内含子无有基因多少某种生物的部分基因某种生物的全部基因物种间的基因交流可以部分基因可以cDNA文库和基因组文库的比较

文库类型cDNA文库基因组补：原核细胞的基因结构非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游与RNA聚合酶结合位点启动子终止子

RNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。转录开始后，RNA聚合酶沿DNA分子移动，并以DNA分子的一条链为模板合成RNA。转录完毕后，RNA链释放出来，紧接着RNA聚合酶也从DNA模板链上脱落下来。补：原核细胞的基因结构非编码区非编码区编码区编码区上游编码①不能转录为信使RNA，不能编码蛋白质。：能转录相应的信使RNA，能编码蛋白质编码区非编码区原核细胞的基因结构②有调控遗传信息表达的核苷酸序列，在该序列中，最重要的是位于编码区上游的RNA聚合酶结合位点。非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游启动子终止子①不能转录为信使RNA，不能：能转录相应的信使RNA，能真核细胞的基因结构编码区非编码区非编码区与RNA聚合酶结合位点内含子外显子能够编码蛋白质的序列叫做外显子不能够编码蛋白质的序列叫做内含子启动子终止子编码区上游编码区下游内含子：外显子：真核细胞的基因结构编码区非编码区非编码区与RNA聚合酶内含子结构基因外显子内含子转录、加工修饰mRNA结构基因外显子内含子转录、加工修饰mRNA结构基因外显子内含子转录、加工修饰mRNA结构基因外显子内含子转录、加工修饰mRNA真核细胞的基因结构编码区非编码区:外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列

有调控作用的核苷酸序列，包括位于编码区上游的RNA

聚合酶结合位点。非编码序列：包括非编码区和内含子真核细胞的基因结构编码区非编码区:外显子：能编码蛋白质的原核细胞真核细胞不同点编码区是_____的编码区是间隔的、_____的相同点都由能够编码蛋白质的______

和具有调控作用的______

区组成的原核细胞与真核细胞的基因结构比较思考编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？连续不连续编码区非编码原核细胞真核细胞不同点编码区是编码区是间隔的、_____的都如何从基因文库中得到所需要的基因？依据：目的基因的有关信息如：根据基因的核苷酸序列基因的功能基因在染色体上的位置基因的转录产物mRNA基因翻译产物蛋白质等特性如何从基因文库中得到所需要的基因？依据：目的基因的有关信息（1）从基因组文库中获取：限制酶供体细胞中的DNA许多DNA片段运载体与载体连接受体细胞产生特定性状导入外源DNA扩增目的基因分离（1）从基因组文库中获取：限制酶供体细胞中的DNA许多DNA以目的基因转录成的信使RNA为模板，再反转录酶的催化下反转录成互补的单链DNA，然后在DNA聚合酶的作用下合成双链DNA，即cDNA，从而获得所需的基因。（2）从部分基因文库中获取（例cDNA文库的构建方法）以目的基因转录成的信使RNA为模板，再反转录酶的（3）根据已知的氨基酸序列人工合成DNA法：根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使RNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出它的结构基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测目的基因化学合成（3）根据已知的氨基酸序列人工合成DNA法：上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？优点缺点从基因组文库中获取从部分基因文库中获取根据已知氨基酸合成DNA法操作简便广泛使用工作量大，盲目，专一性差，分离出来的有时并非一个基因专一性强操作过程麻烦，mRNA很不稳定，要求的技术条件较高专一性最强仅限于合成核苷酸对较少的简单基因，适用范围小上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？优点缺点从基因组文库中

4.利用PCR技术扩增目的基因

称多聚酶链式反应穆里斯等人于1988年发明的。PCR是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。

4.利用PCR技术扩增目的基因

称多聚酶链式反应利用PCR技术扩增目的基因利用PCR技术扩增目的基因1234522557294时间（min）温度（℃）PCR反应PCR反应条件PCR过程PCR的特点适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍1234522557294时间（min）温度（℃）PCR反应模板DNA95℃模板DNA95℃PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点50℃引物1引物2DNA引物PCR的基本原理PCR反应条件50℃引物1引物2DNA引物PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶PCR的基本原理PCR反应条件引物1引物2DNA引物72℃TTaq

DNA聚合酶（thermusaquaticus)酶活性(%)温度(℃)40506070809010010080604020TaqDNA聚合酶（thermusaquaticus)酶PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃第1轮结束第2轮开始PCR的基本原理PCR反应条件72℃第1轮结束第2轮开始PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理PCR反应条件95℃50℃72℃TaqTaqPCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃第2轮结束PCR的基本原理PCR反应条件72℃第2轮结束生物选修3基因工程的基本操作程序上课用课件PCR的基本反应步骤变性90-95˚C延伸70-75˚C复性55-60˚CPCR总结：PCR的基本反应步骤变性延伸复性55-60˚CPCR总结：变性：加热至90～95℃双链DNA解链成为单链DNA复性：冷却至55～60℃部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合延伸：加热至70～75℃以目的基因为模板，合成互补的新DNA链变性复性延伸变性：加热至90～95℃双链DNA解链成为单链DNA变性复性①概念：PCR全称为_______________，是一项在生物____复制___________的核酸合成技术。③前提条件：_______________________；原料：___________、___________、__________________、________________。②原理：__________④方式：以_____方式扩增，即____（n为扩增循环的次数）⑤结果：聚合酶链式反应体外特定DNA片段DNA复制已知基因的核苷酸序列四种脱氧核苷酸DNA引物热稳定DNA聚合酶指数2n使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增模板DNA①概念：PCR全称为_______________，是一项生物选修3基因工程的基本操作程序上课用课件PCR技术扩增与DNA复制的比较PCR技术DNA复制相同点原理原料条件不同点解旋方式场所酶结果碱基互补配对四种脱氧核苷酸模板、能量、酶DNA在高温下变性解旋解旋酶催化体外复制细胞核内热稳定的DNA聚合酶细胞内的DNA聚合酶大量的DNA片段形成整个DNA分子PCR技术扩增与DNA复制的比较PCR技术DNA复制相同点原PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点重复30轮后230=1,073,741,824模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增理想拷贝数=2nn循环次数实际拷贝数=(1+x)nX平均效率,约为0.85n循环次数

PCR的基本原理PCR反应条件重复30轮后模板DNA第1轮扩人工合成(基因比较小)DNA合成仪人工合成(基因比较小)DNA合成仪从基因文库中获取利用PCR技术扩增利用化学方法人工合成归纳：获取目的基因的方法从基因文库中获取归纳：获取目的基因的方法

用一定的_____切割质粒，使其出现一个切口，露出____________。用_____________切断目的基因，使其产生_________________。

将切下的目的基因片段插入质粒的______处，再加入适量___________，形成了一个重组

DNA分子（重组质粒）限制酶黏性末端同一种限制酶相同的黏性末端切口DNA连接酶1.过程:二基因表达载体构建——

核心用一定的_____切割将切下的目的基因片段插入质粒的_质粒DNA分子限制酶处理一个切口两个黏性末端两个切口获得目的基因DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）同一种过程:质粒DNA分子限制酶处理一个切口两个切口DNA连接酶重组DN2.构建基因表达载体的目的（1）使目的基因在受体细胞中稳定存在并可以遗传给下一代；（2）使目的基因能够表达和发挥作用。2.构建基因表达载体的目的

科学家在培育抗虫棉时，经历了多次失败，才获得成功。起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基因在棉花体内没有表达。然后在插入抗虫基因的质粒中插入启动子(抗虫基因首端)，导入棉花受精卵，长成的棉花植株还是没有抗虫能力。科学家又在有启动子、抗虫基因的质粒中插入终止子(抗虫基因末端)，导入棉花受精卵，结果成长的植株，有了抗虫能力。资料:科学家在培育抗虫棉时，经历了多次失败，才获得成功。资思考：作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？（P15）

不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是：思考：作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗（1）生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达；（2）通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；（3）目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；（4）为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子（增强基因启动子工作效率的顺式作用序列，能够在相对于启动子的任何方向和任何位置(上游或下游)上都发挥作用。）等；（5）有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。（1）生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动3.基因表达载体的组成：它们有什么作用？a、目的基因b、启动子c、终止子d、标记基因3.基因表达载体的组成：它们有什么作用？a、目的基因b、启动调节基因操纵基因结构基因RNA聚合酶半乳糖苷酶酶酶

RNA聚合酶启动子RNA聚合酶启动子：位于基因首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质。调节基因操纵基因结构基因RNA聚合酶半乳糖苷酶酶酶思考1：

表达载体为什么一定要有启动子？（1）生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能有利于基因的表达；（2）通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体细胞无法转录。思考1：

表达载体为什么一定要有启动子？（1）生物之间进思考2：终止子的作用是什么？

终止子是位于基因尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录。是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来。思考3：标记基因有什么作用？思考2：终止子的作用是什么？是为了鉴别受体细胞①载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构。注意②用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键。③启动子、终止子对于目的基因表达必不可少。④目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。①载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DN基因工程技术路线基因工程技术路线三、将目的基因导入受体细胞常用的受体细胞：有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。将目的基因导入受体细胞的原理：借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。（一）转化：目的基因进入_________内，并且在受体细胞内维持_____和_____的过程受体细胞稳定表达三、将目的基因导入受体细胞常用的受体细胞：有（二）方法将目的基因导入植物细胞将目的基因导入动物细胞将目的基因导入微生物细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法——显微注射法——感受态细胞（二）方法将目的基因导入将目的基因导入将目的基因导入农杆菌转1.将目的基因导入植物细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法1.将目的基因导入植物细胞农杆菌转化法（1）农杆菌转化法①特点：

易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力②原理：

Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。（1）农杆菌转化法①特点：②原理：③转化过程:Ti质粒目的基因构建表达载体导入植物细胞插入植物细胞染色DNA表达新性状转入农杆菌③转化过程:Ti质粒构建表达载体导入植物细胞插入植物细胞染色

基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。（2）基因枪法适用于单子叶植物基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将（3）花粉通道法植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。适用于被子植物（3）花粉通道法植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过胚珠花药花丝柱头花柱子房壁子房雄蕊雌蕊胚珠花药花丝柱头花柱子房壁子房雄蕊雌蕊2.将目的基因导入动物细胞（1）方法：显微注射法（将基因表达载体提纯，用显微仪注射到受精卵中）思考：为什么要用受精卵而不用体细胞？2.将目的基因导入动物细胞（1）方法：显微注射法（将基因表达（2）操作程序:提纯含目的基因表达载体取受精卵显微注射移植到子宫受精卵发育新性状动物（2）操作程序:提纯含目的基因表达载体取受精卵显微注射移植到常用法：Ca2+处理常用菌：大肠杆菌微生物作受体细胞原因：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少过程：Ca2+处理大肠杆菌感受态细胞表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA3.将目的基因导入微生物细胞思考：为什么要用Ca2+处理受体细胞？用Ca2＋处理，增加细菌细胞壁的通透性常用法：Ca2+处理常用菌：大肠杆菌微生物作受体细胞原因：过培养培养培养导入含目的基因的重组质粒导入大肠杆菌含有氨苄青霉素的完全培养基含有四环素的完全培养基两种培养基均不能生长大肠杆菌Ca2+

处理细胞形成感受态细胞检测（培养不具有氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因的大肠杆菌）只有氨苄青霉素抗性基因质粒只具有氨苄青霉素抗性基因大肠杆菌不具有氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性积基因的大肠杆菌完全培养基培养培养培养导入含目的基因的重组质粒导入大肠杆菌含有氨苄青霉导入接种培养接种培养接种培养含有四环素的完全培养基完全培养基大肠杆菌不含抗四环素基因证明：不存活含有四环素的完全培养基证明：

大肠杆菌的受体细胞含有目的基因

四环素抗性基因

四环素抗性基因存活如何把导入了目的基因的受体细胞筛选出来？存活导入接种培养接种培养接种培养含有四环素的完全培养基完全培养基导入接种培养接种培养接种培养接种培养含有四环素的完全培养基完全培养基大肠杆菌不含抗四环素基因证明：不存活含有四环素的完全培养基证明：大肠杆菌含抗四环素基因证明：

大肠杆菌的受体细胞含有目的基因

四环素抗性基因

四环素抗性基因完全培养基存活如何把导入了目的基因的受体细胞筛选出来？导入接种培养接种培养接种培养接种培养含有四环素的完全培养基完受体生物植物动物微生物受体细胞导入方法受精卵体细胞受精卵细胞/个体农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法显微注射技术用Ca2+处理成感受态细胞采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基因的作法正确的是（）

A.将毒素蛋白注射到受精卵中

B.将编码毒素蛋白的DNA序列，与质粒重组，导入细菌，用该细菌感染棉的体细胞，再进行组织培养

C.将编码毒素蛋白的DNA序列，与质粒重组，注射到棉的子房并进入受精卵

D.将编码毒素蛋白的DNA序列，注射到棉受精卵中BC受体生物植物动物微生物受体细胞导入方法受精卵四、目的基因的检测与鉴定检测:是否插入目的基因是否转录是否翻译鉴定:分子水平鉴定个体生物学水平鉴定四、目的基因的检测与鉴定检测:1、检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因①首先取出转基因生物的基因组DNA；（1）方法:DNA分子杂交（2）过程:②

将含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记,以此做探针；③

使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明染色体已插入染色体DNA中。（一）检测1、检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因①首先基因探针：是一段带有检测标记，且序列已知的，与目的基因互补的核酸序列。基因探针通过分子杂交与目的基因结合，产生杂交信号，能从浩翰的基因组中把目的基因显示出来。基因探针：是一段带有检测标记，且序列已知的，与目的基因互补的DNA分子杂交示意图

采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。DNA分子杂交示意图采用一定的技术手段，将两种生物（二）鉴定（个体生物学水平）2、检测目的基因是否转录出了mRNA3、检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等①方法:分子杂交方法:抗原-抗体杂交②过程:用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,表明目的基因转录出了mRNA。（二）鉴定（个体生物学水平）2、检测目的基因是否转录出了mR提取（3）检测目的基因是否翻译成蛋白质方法——抗原-抗体杂交苏云金杆菌Bt毒素蛋白将Bt毒蛋白注射小鼠体内从小鼠血管抽出血液分离出抗Bt毒素的抗体抗体蛋白质

出现杂交带脱分化组织培养提取（3）检测目的基因是否翻译成蛋白质方法——抗原-抗体杂交若不能表达，要对抗虫基因再进行修饰。怎样检验抗虫基因在棉细胞内是否表达呢？没有抗虫基因的棉植株有抗虫基因的棉植株棉铃虫虫没有死虫被杀死没有表达目的基因表达若不能表达，要对抗虫基因再进行修饰。怎样检验抗虫基因在棉细胞鉴定——抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。鉴定——抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等例：用棉铃饲喂棉铃类型步骤检测内容方法结果显示分子检测第一步目的基因是否进入受体细胞DNA分子杂交（DNA和DNA之间）是否成功显示出杂交带第二步目的基因是否转录出mRNA分子杂交技术（DNA和mRNA之间）是否成功显示出杂交带第三步目的基因是否翻译出蛋白质抗原—抗体杂交是否成功显示出杂交带个体水平鉴定包括抗虫、抗病的接种实验，以确定是否有抗性以及抗性的程度；基因工程产品与天然产品的活性比较，以确定功能是否相同等。目的基因的表达和检测类型步骤检测内容方法结果显示分子检测第一步目的基因是否进入受提示：

①DNA分子杂交技术首先提取受体细胞中的DNA，然后高温解成单链，再与同位素标记的DNA探针杂交；

②抗原－抗体杂交所用到的抗体是用表达出的蛋白质注射动物进行免疫，产生相应的抗体，并提取出而来的。提示：归纳:基因工程的基本操作程序获取目的基因从基因文库利用PCR化学方法人工合成构建基因表达载体目的基因、启动子、终止子、标记基因将目的基因导入受体细胞转化法（微生物）、农杆菌转化法（植物）、显微注射法（动物）目的基因的检测与鉴定检测：是否插入、转录、翻译归纳:基因工程的基