实时荧光定量PCR原理和实验课件

实时荧光定量PCR原理和实验

.实时荧光定量PCR原理和实验

.1我们都知道理论上PCR是一个指数增长的过程，但是实际的PCR扩增曲线并不是标准的指数曲线，而是S形曲线。这是因为随着PCR循环的增多，扩增规模迅速增大，Taq酶、dNTP、引物，甚至DNA模板等各种PCR要素逐渐不敷需求，PCR的效率越来越低，产物增长的速度就逐渐减缓。当所有的Taq酶都被饱和以后，PCR就进入了平台期。由于各种环境因素的复杂相互作用，不同的PCR反应体系进入平台期的时机和平台期的高低都有很大变化，难以精确控制。所以，即使是重复实验，各种条件基本一致,最后得到的DNA拷贝数也是完全不一样的，波动很大。为什么终点定量不准确？

.我们都知道理论上PCR是一个指数增长的过程，但是实际的PCR2为什么不选普通PCR?对于绝大多数实验，比如甲肝的诊断、药物疗效的监测等,需要测定的都是PCR放大之前标本中的DNA原始拷贝数,经过PCR扩增以后的DNA拷贝数已经不能反映真实情况。在这种情况下，就不能采用终点定量，而要根据CT值确定DNA起始拷贝的数量。传统的定量方法，如溴乙锭染色或放射性核素掺入标记后的光密度扫描等，测定的都是PCR的终产物，而不是起始DNA拷贝数。由于PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出起始DNA拷贝数。.为什么不选普通PCR?.3荧光定量PCR的优势在实时荧光定量PCR反应中，引入了一种荧光化学物质,随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。该技术借助于荧光信号来检测PCR产物，一方面提高了灵敏度，另一方面还可以做到PCR每循环一次就收集一个数据，建立实时扩增曲线，准确地确定CT值，从而根据CT值确定起始DNA拷贝数，做到了真正意义上的DNA定量。.荧光定量PCR的优势在实时荧光定量PCR反应中，引入了一4CT值与模板DNA的关系

一般地，我们有Rn=RB+XO(1+EX)nRS,也就是说第n次PCR循环时的荧光信号强度(Rn)等于背景信号强度(RB)加上每个分子的荧光强度(即单位荧光强度，RS)与分子数目的乘积。当循环次数n=CT时，则有RT=RB+XO(1+EX)CTRS。两边取对数，得log(RT-RB)=logX0

+CTlog(1+Ex)+logRs。整理此式，CTlog(1+Ex)=-logX0

+log(RT-RB)–logRs。

Ct=-klgX0+b.CT值与模板DNA的关系

一般地，我们有Rn=RB+XO(15CT值的确定

基线:在PCR的最初几个循环中，荧光信号是几乎不变的，这确定了扩增图中的基线。基线范围的定义是从第3个循环起到CT值前3个循环止，一般取第3到第15个循环之间。在这些初始的循环中，我们看到的其实是反应的荧光背景。

Rn（Normalizedreporter）:是荧光报告基团的荧光发射强度与参比染料的荧光发射强度的比值。

△Rn:是Rn扣除基线后得到的标准化结果（△Rn=Rn–基线）。

阈值:

用于确定实时定量分析中的CT值的某个△Rn水平。一般将PCR反应前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值是PCR3-15个循环荧光信号标准差的10倍，这个水平设定得比基线高，又在扩增曲线的指数增长区域内足够低。

阈值循环（CT）：荧光穿过阈值时的循环数,即阈值与扩增曲线的交叉点。

.CT值的确定

基线:在PCR的最初几个循环中，荧光信号是几乎6显然，CT值取决于阈值，阈值取决于基线，基线取决于实验的质量，CT值是一个完全客观的参数。CT值越小，模板DNA的起始拷贝数越多；CT值越大，模板DNA的起始拷贝数越少。正常的CT值范围在18-30之间，过大和过小都将影响实验数据的精度。.显然，CT值取决于阈值，阈值取决于基线，基线取决于实验的质量7实验方案的设计根据最终得到的数据不同，定量PCR可以分为相对定量和绝对定量两种。典型的相对定量如比较经过不同方式处理的两个样本中基因表达水平的高低变化，得到的结果是百分比；绝对定量则需要使用标准曲线确定样本中基因的拷贝数或浓度。根据所使用的技术不同，荧光定量PCR又可以分为TaqMan探针和SYBRGreenI荧光染料两种方法。比较而言，探针杂交技术在原理上更为严格，所得数据更为精确；荧光染料技术则成本更为低廉，实验设计更为简便。在选择实验方案时要根据实验目的和对数据精度的要求来决定。.实验方案的设计根据最终得到的数据不同，定量PCR可以分为相对8

TaqMan探针技术原理

TaqMan探针法是高度特异的定量PCR技术，其核心是利用Taq酶的3′→5′外切核酸酶活性，切断探针，产生荧光信号。由于探针与模板是特异性结合，所以荧光信号的强弱就代表了模板的数量。在TaqMan探针法的定量PCR反应体系中，包括一对PCR引物和一条探针。探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探针的5′端标记有报告基团(Reporter,R)，如FAM、VIC等，3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher,Q)，如TAMRA等。当探针完整的时候，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号。随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其3′→5′外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离淬灭基团，其能量不能被吸收，即产生荧光信号。所以，每经过一个PCR循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的过程。信号的强度就代表了模板DNA的拷贝数。.

TaqMan探针技术原理

TaqMan探针法是高度特异9

TaqMan探针根据其3′端标记的荧光淬灭基团的不同分为两种：普通的TaqMan探针和TaqManMGB探针。MGB探针的淬灭基团采用非荧光淬灭基团(Non-FluorescentQuencher)，本身不产生荧光，可以大大降低本底信号的强度。同时探针上还连接有MGB(MinorGrooveBinder)修饰基团可以将探针的Tm值提高10°C左右。因此为了获得同样的Tm值，MGB探针可以比普通TaqMan探针设计得更短，既降低了合成成本，也使得探针设计的成功率大为提高。因为在模板的DNA碱基组成不理想的情况下，短的探针比长的更容易设计。实验证明，TaqManMGB探针对于富含A/T的模板可以区分得更为理想。TaqManMGB探针

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TaqMan探针根据其3′端标记的荧光淬灭基团的不同分为两10SYBRGreenI荧光染料技术原理

SYBRGreenI荧光染料技术原理SYBRGreenI是一种只与DNA双链结合的荧光染料（图6）。当它与DNA双链结合时，发出荧光；从DNA双链上释放出来时，荧光信号急剧减弱。因此，在一个体系内，其信号强度代表了双链DNA分子的数量。SYBRGreen荧光染料法定量PCR的基本过程是：1、开始反应，当SYBRGreen染料与DNA双链结合时发出荧光。2、DNA变性时，SYBRGreen染料释放出来，荧光急剧减少。3、在聚合延伸过程中，引物退火并形成PCR产物。4、聚合完成后，SYBRGreen染料与双链产物结合，定量PCR系统检测到荧光的净增量加大。.SYBRGreenI荧光染料技术原理

SYBRGree11数据的校正定量实验与定性实验最大的不同，是要考虑统计学要求并对数据进行严格的校正，以消除偶然误差。因此重复实验和设立内对照非常重要。由于各种各样的客观原因，这一点在实践中往往被轻视或忽视，需要着重强调。当然，与定性实验一样，定量PCR也要设立阴性和阳性对照，以监控试剂和实验操作方面可能出现的问题。.数据的校正定量实验与定性实验最大的不同，是要考虑统计学要求并12重复实验和阴性对照

定量实验，误差是不可避免的。设立重复实验，对数据进行统计处理，可以将误差降低到最小。所以定量实验的每个样本至少要重复3次以上，严格的定量更应当重复6～8次，以满足小样本统计的要求。

阴性对照中不加模板DNA，而以水或缓冲液代替，用于检验是否存在PCR污染。.重复实验和阴性对照定量实验，误差是不可避免的。设立重复实验13实时荧光定量RT—PCR内参基因的选择

由于内参基因在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数是恒定的，受环境因素影响较小，其定量结果代表了样本中所含细胞或基因组的数量。内参基因扩增中的变化可以反映RNA产量、质量和／或cDNA合成效率的变化。选择适当的内参基因以减少检测标本间的差异是必须的。内参基因一般选用b-actin、GAPDH、rRNA基因等管家基因。核酸提取时通常以重量或体积为单位取样，再加上提取效率和操作误差，造成等量提取物不一定来源于等量细胞（或基因组）。将定量结果校正为以细胞（或基因组）为单位，不同样品之间才具有可比性。.实时荧光定量RT—PCR内参基因的选择核酸提取时通常142003年10月：乔布斯被检查出胰腺癌。2004年，乔布斯接受了肿瘤切除手术。实时荧光定量PCR实验—ΔΔCT法

苹果前CEO史蒂夫·乔布斯逝世。让我们一起悼念这位“改变世界的天才”！.2003年10月：乔布斯被检查出胰腺癌。实时荧光定量PCR实15用什么方法来检测?药物对肿瘤细胞的影响:检测相关基因的表达是否发生了变化(EGR3、MAOB、OGDH、OSGEP、SERPING1）

.用什么方法来检测?药物对肿瘤细胞的影响:检测相关基因的表达是16

RNAcDNA扩增产物细胞裂解逆转录反应定量PCR反应untreatedtreated

RNAcDNA扩增产物细胞裂解逆转录反应定量PCR反应基因表达(geneexpression)是指细胞在生命过程中，把储存在DNA顺序中遗传信息经过转录和翻译，转变成具有生物活性的蛋白质分子GeneRNA蛋白质

转录翻译(cDNA)对扩增产物进行定量，扩增产物的变化体现了RNA的变化逆转录.RNAcDNA17实验方案的设计定量PCR绝对定量相对定量相对标准曲线∆∆CT.实验方案的设计定量PCR绝对定量相对定量相对标准曲线∆∆CT18∆∆CT实验的设计目的基因、内参基因、参照样本、重复反应孔

∆∆CT实验的设计选择PCR方法选择化学方法：选择RT方法选择探针和引物TaqMan或SYBRGreenIdye指明∆∆CT实验中组成部分:.∆∆CT实验的设计目的基因、内参基因、参照样本、重复反应孔19DesigntheComparativeCTExperimentPreparetheReactions.

Preparethereactionplate.AnalyzetheComparativeCTExperiment

.RuntheExperimentPreparethetemplatePreparethesampledilutionsPreparethereactionmixforeachtargetassayPreparefortherunEnablethenotificationsettingsStarttherunMonitortherunUnloadtheinstrumentViewtheGeneExpressionPlotandWellViewtheAmplificationPublishtheData

theComparativeCTExperimentworkflow

.DesigntheComparativeCTExpe20RT反应的操作RT反应提取RNA将提取的总RNA转化为cDNA:反转录试剂盒试剂盒提取RNARNA的浓度:A260/A280在1.9左右总RNA的质量RNA的完整性:琼脂糖凝胶电泳总RNA初始浓度的调节:50ng/µL.0h12h24h48hRNARNARNARNA.RT反应的操作RT反应提取RNA将提取的总RNA转化为cDN21ComponentµL/ReactionµL/21Reactionsa10✕ReverseTranscriptionBuffer1021025✕dNTPs48410✕randomprimers10210MultiScribe™ReverseTranscriptase,50U/µL5105Nuclease-freewater21441Totalperreaction5010501.准备RTmastermix

2.RT反应体系50µLoftheRTmastermix30µLofnuclease-freewater20µLofRNAsampleStepTypeTimeTemperatureHOLD10min25°CHOLD120min37°CHOLD5sec85°C

3.Programthethermalcycler.Component22样品的稀释SampleNameStockConcentration(ng/µL)SampleVolume(µL)DiluentVolume(µL)TotalVolumeofDilutedSample(µL)0h100.066.066.0132.012h100.066.066.0132.024h100.066.066.0132.048h100.066.066.0132.0Thestocksampleconcentrationis100ng/µL.AfterdilutingthesampleaccordingtotheSampleDilutionsCalculationstable,thesamplehasaconcentrationof50ng/µL.Adding5µLatthisconcentrationtothefinalreactionmixvolumeof50µLyieldsa1✕concentrationinthefinalreaction..样品的稀释SampleStockConcentratio23配制PCR反应mixComponentVolume(µL)for1ReactionMasterMix(2.0✕)25.0AssayMix(20.0✕)2.50Water17.50TotalVolume45.0

Thereactionmixcomponentsare:–TaqMan®UniversalPCRMasterMix(2✕)–18SAssayMix(20✕)–EGR3AssayMix(20✕)–MAOBAssayMix(20✕)–OGDHAssayMix(20✕)–OSGEPAssayMix(20✕)–SERPING1AssayMix(20✕)–Water反应成分反应成分的体积计算.配制PCR反应mixComponent24Forthe18Sassay,addtherequiredcomponentstothe18SReactionMixtube:ComponentVolume(µL)for1ReactionVolume(µL)for16Reaction)TaqMan®UniversalPCRMasterMix(2✕)25.0440.018SAssayMix(20✕)2.544.0Water17.5308.0TotalReactionMixVolume45.0792.0TubeReactionMixReactionMixVolume(µL)SampleSampleVolume(µL)118SReactionMix198.00h22.0218SReactionMix198.012h22.0318SReactionMix198.024h22.0418SReactionMix198.048h22.0(Plus10%Excess).Forthe18Sassay,addthereq25..26ViewtheGeneExpressionPlotandWellTable.ViewtheGeneExpressionPlot27..28ViewtheAmplificationPlot

∆RnvsCycle–∆RnisthemagnitudeofnormalizedfluorescencegeneratedbythereporterateachcycleduringthePCRamplification.Thisplotdisplays∆Rnasafunctionofcyclenumber.Youcanusethisplottoidentifyandexamineirregularamplificationandtoviewthresholdandbaselinevaluesfortherun.RnvsCycle–Rnisthefluorescencefromthereporterdyenormalizedtothefluorescencefromthepassivereference.ThisplotdisplaysRnasafunctionofcyclenumber.Youcanusethisplottoidentifyandexamineirregularamplification.CTvsWell–CTisthePCRcyclenumberatwhichthefluorescencemeetsthethresholdintheamplificationplot.ThisplotdisplaysCTasafunctionofwellposition.Youcanusethisplottolocateoutlyingamplification(outliers)..ViewtheAmplificationPlot∆R29ViewtheAmplificationPlot-∆RnvsCycle

.ViewtheAmplificationPlot-∆30BaselineExamples.BaselineExamples.31ViewtheAmplificationPlot-∆RnvsCycle.ViewtheAmplificationPlot-∆32ThresholdExamples.ThresholdExamples.33ViewtheAmplificationPlot-CTvsWell

.ViewtheAmplificationPlot-C34实时荧光定量PCR原理和实验

.实时荧光定量PCR原理和实验

.35我们都知道理论上PCR是一个指数增长的过程，但是实际的PCR扩增曲线并不是标准的指数曲线，而是S形曲线。这是因为随着PCR循环的增多，扩增规模迅速增大，Taq酶、dNTP、引物，甚至DNA模板等各种PCR要素逐渐不敷需求，PCR的效率越来越低，产物增长的速度就逐渐减缓。当所有的Taq酶都被饱和以后，PCR就进入了平台期。由于各种环境因素的复杂相互作用，不同的PCR反应体系进入平台期的时机和平台期的高低都有很大变化，难以精确控制。所以，即使是重复实验，各种条件基本一致,最后得到的DNA拷贝数也是完全不一样的，波动很大。为什么终点定量不准确？

.我们都知道理论上PCR是一个指数增长的过程，但是实际的PCR36为什么不选普通PCR?对于绝大多数实验，比如甲肝的诊断、药物疗效的监测等,需要测定的都是PCR放大之前标本中的DNA原始拷贝数,经过PCR扩增以后的DNA拷贝数已经不能反映真实情况。在这种情况下，就不能采用终点定量，而要根据CT值确定DNA起始拷贝的数量。传统的定量方法，如溴乙锭染色或放射性核素掺入标记后的光密度扫描等，测定的都是PCR的终产物，而不是起始DNA拷贝数。由于PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出起始DNA拷贝数。.为什么不选普通PCR?.37荧光定量PCR的优势在实时荧光定量PCR反应中，引入了一种荧光化学物质,随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。该技术借助于荧光信号来检测PCR产物，一方面提高了灵敏度，另一方面还可以做到PCR每循环一次就收集一个数据，建立实时扩增曲线，准确地确定CT值，从而根据CT值确定起始DNA拷贝数，做到了真正意义上的DNA定量。.荧光定量PCR的优势在实时荧光定量PCR反应中，引入了一38CT值与模板DNA的关系

一般地，我们有Rn=RB+XO(1+EX)nRS,也就是说第n次PCR循环时的荧光信号强度(Rn)等于背景信号强度(RB)加上每个分子的荧光强度(即单位荧光强度，RS)与分子数目的乘积。当循环次数n=CT时，则有RT=RB+XO(1+EX)CTRS。两边取对数，得log(RT-RB)=logX0

+CTlog(1+Ex)+logRs。整理此式，CTlog(1+Ex)=-logX0

+log(RT-RB)–logRs。

Ct=-klgX0+b.CT值与模板DNA的关系

一般地，我们有Rn=RB+XO(139CT值的确定

基线:在PCR的最初几个循环中，荧光信号是几乎不变的，这确定了扩增图中的基线。基线范围的定义是从第3个循环起到CT值前3个循环止，一般取第3到第15个循环之间。在这些初始的循环中，我们看到的其实是反应的荧光背景。

Rn（Normalizedreporter）:是荧光报告基团的荧光发射强度与参比染料的荧光发射强度的比值。

△Rn:是Rn扣除基线后得到的标准化结果（△Rn=Rn–基线）。

阈值:

用于确定实时定量分析中的CT值的某个△Rn水平。一般将PCR反应前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值是PCR3-15个循环荧光信号标准差的10倍，这个水平设定得比基线高，又在扩增曲线的指数增长区域内足够低。

阈值循环（CT）：荧光穿过阈值时的循环数,即阈值与扩增曲线的交叉点。

.CT值的确定

基线:在PCR的最初几个循环中，荧光信号是几乎40显然，CT值取决于阈值，阈值取决于基线，基线取决于实验的质量，CT值是一个完全客观的参数。CT值越小，模板DNA的起始拷贝数越多；CT值越大，模板DNA的起始拷贝数越少。正常的CT值范围在18-30之间，过大和过小都将影响实验数据的精度。.显然，CT值取决于阈值，阈值取决于基线，基线取决于实验的质量41实验方案的设计根据最终得到的数据不同，定量PCR可以分为相对定量和绝对定量两种。典型的相对定量如比较经过不同方式处理的两个样本中基因表达水平的高低变化，得到的结果是百分比；绝对定量则需要使用标准曲线确定样本中基因的拷贝数或浓度。根据所使用的技术不同，荧光定量PCR又可以分为TaqMan探针和SYBRGreenI荧光染料两种方法。比较而言，探针杂交技术在原理上更为严格，所得数据更为精确；荧光染料技术则成本更为低廉，实验设计更为简便。在选择实验方案时要根据实验目的和对数据精度的要求来决定。.实验方案的设计根据最终得到的数据不同，定量PCR可以分为相对42

TaqMan探针技术原理

TaqMan探针法是高度特异的定量PCR技术，其核心是利用Taq酶的3′→5′外切核酸酶活性，切断探针，产生荧光信号。由于探针与模板是特异性结合，所以荧光信号的强弱就代表了模板的数量。在TaqMan探针法的定量PCR反应体系中，包括一对PCR引物和一条探针。探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探针的5′端标记有报告基团(Reporter,R)，如FAM、VIC等，3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher,Q)，如TAMRA等。当探针完整的时候，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号。随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其3′→5′外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离淬灭基团，其能量不能被吸收，即产生荧光信号。所以，每经过一个PCR循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的过程。信号的强度就代表了模板DNA的拷贝数。.

TaqMan探针技术原理

TaqMan探针法是高度特异43

TaqMan探针根据其3′端标记的荧光淬灭基团的不同分为两种：普通的TaqMan探针和TaqManMGB探针。MGB探针的淬灭基团采用非荧光淬灭基团(Non-FluorescentQuencher)，本身不产生荧光，可以大大降低本底信号的强度。同时探针上还连接有MGB(MinorGrooveBinder)修饰基团可以将探针的Tm值提高10°C左右。因此为了获得同样的Tm值，MGB探针可以比普通TaqMan探针设计得更短，既降低了合成成本，也使得探针设计的成功率大为提高。因为在模板的DNA碱基组成不理想的情况下，短的探针比长的更容易设计。实验证明，TaqManMGB探针对于富含A/T的模板可以区分得更为理想。TaqManMGB探针

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TaqMan探针根据其3′端标记的荧光淬灭基团的不同分为两44SYBRGreenI荧光染料技术原理

SYBRGreenI荧光染料技术原理SYBRGreenI是一种只与DNA双链结合的荧光染料（图6）。当它与DNA双链结合时，发出荧光；从DNA双链上释放出来时，荧光信号急剧减弱。因此，在一个体系内，其信号强度代表了双链DNA分子的数量。SYBRGreen荧光染料法定量PCR的基本过程是：1、开始反应，当SYBRGreen染料与DNA双链结合时发出荧光。2、DNA变性时，SYBRGreen染料释放出来，荧光急剧减少。3、在聚合延伸过程中，引物退火并形成PCR产物。4、聚合完成后，SYBRGreen染料与双链产物结合，定量PCR系统检测到荧光的净增量加大。.SYBRGreenI荧光染料技术原理

SYBRGree45数据的校正定量实验与定性实验最大的不同，是要考虑统计学要求并对数据进行严格的校正，以消除偶然误差。因此重复实验和设立内对照非常重要。由于各种各样的客观原因，这一点在实践中往往被轻视或忽视，需要着重强调。当然，与定性实验一样，定量PCR也要设立阴性和阳性对照，以监控试剂和实验操作方面可能出现的问题。.数据的校正定量实验与定性实验最大的不同，是要考虑统计学要求并46重复实验和阴性对照

定量实验，误差是不可避免的。设立重复实验，对数据进行统计处理，可以将误差降低到最小。所以定量实验的每个样本至少要重复3次以上，严格的定量更应当重复6～8次，以满足小样本统计的要求。

阴性对照中不加模板DNA，而以水或缓冲液代替，用于检验是否存在PCR污染。.重复实验和阴性对照定量实验，误差是不可避免的。设立重复实验47实时荧光定量RT—PCR内参基因的选择

由于内参基因在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数是恒定的，受环境因素影响较小，其定量结果代表了样本中所含细胞或基因组的数量。内参基因扩增中的变化可以反映RNA产量、质量和／或cDNA合成效率的变化。选择适当的内参基因以减少检测标本间的差异是必须的。内参基因一般选用b-actin、GAPDH、rRNA基因等管家基因。核酸提取时通常以重量或体积为单位取样，再加上提取效率和操作误差，造成等量提取物不一定来源于等量细胞（或基因组）。将定量结果校正为以细胞（或基因组）为单位，不同样品之间才具有可比性。.实时荧光定量RT—PCR内参基因的选择核酸提取时通常482003年10月：乔布斯被检查出胰腺癌。2004年，乔布斯接受了肿瘤切除手术。实时荧光定量PCR实验—ΔΔCT法

苹果前CEO史蒂夫·乔布斯逝世。让我们一起悼念这位“改变世界的天才”！.2003年10月：乔布斯被检查出胰腺癌。实时荧光定量PCR实49用什么方法来检测?药物对肿瘤细胞的影响:检测相关基因的表达是否发生了变化(EGR3、MAOB、OGDH、OSGEP、SERPING1）

.用什么方法来检测?药物对肿瘤细胞的影响:检测相关基因的表达是50

RNAcDNA扩增产物细胞裂解逆转录反应定量PCR反应untreatedtreated

RNAcDNA扩增产物细胞裂解逆转录反应定量PCR反应基因表达(geneexpression)是指细胞在生命过程中，把储存在DNA顺序中遗传信息经过转录和翻译，转变成具有生物活性的蛋白质分子GeneRNA蛋白质

转录翻译(cDNA)对扩增产物进行定量，扩增产物的变化体现了RNA的变化逆转录.RNAcDNA51实验方案的设计定量PCR绝对定量相对定量相对标准曲线∆∆CT.实验方案的设计定量PCR绝对定量相对定量相对标准曲线∆∆CT52∆∆CT实验的设计目的基因、内参基因、参照样本、重复反应孔

∆∆CT实验的设计选择PCR方法选择化学方法：选择RT方法选择探针和引物TaqMan或SYBRGreenIdye指明∆∆CT实验中组成部分:.∆∆CT实验的设计目的基因、内参基因、参照样本、重复反应孔53DesigntheComparativeCTExperimentPreparetheReactions.

Preparethereactionplate.AnalyzetheComparativeCTExperiment

.RuntheExperimentPreparethetemplatePreparethesampledilutionsPreparethereactionmixforeachtargetassayPreparefortherunEnablethenotificationsettingsStarttherunMonitortherunUnloadtheinstrumentViewtheGeneExpressionPlotandWellViewtheAmplificationPublishtheData

theComparativeCTExperimentworkflow

.DesigntheComparativeCTExpe54RT反应的操作RT反应提取RNA将提取的总RNA转化为cDNA:反转录试剂盒试剂盒提取RNARNA的浓度:A260/A280在1.9左右总RNA的质量RNA的完整性:琼脂糖凝胶电泳总RNA初始浓度的调节:50ng/µL.0h12h24h48hRNARNARNARNA.RT反应的操作RT反应提取RNA将提取的总RNA转化为cDN55ComponentµL/ReactionµL/21Reactionsa10✕ReverseTranscriptionBuffer1021025✕dNTPs48410✕randomprimers10210MultiScribe™ReverseTranscriptase,50U/µL5105Nuclease-freewater21441Totalperreaction5010501.准备RTmastermix

2.RT反应体系50µLoftheRTmastermix30µLofnuclease-freewater20µLofRNAsampleStepTypeTimeTemperatureHOLD10min25°CHOLD120min37°CHOLD5sec85°C

3.Programthethermalcycler.Component56样品的稀释SampleNameStockConcentration(ng/µL)SampleVolume(µL)DiluentVolume(µL)TotalVolumeofDilutedSample(µL)0h100.066.066.0132.012h100.066.066.0132.024h100.066.066.0132.048h100.066.066.0132.0Thestocksampleconcentrationis100ng/µL.AfterdilutingthesampleaccordingtotheSampleDilutionsCalculationstable,thesamplehasaconcentrationof50ng/µL.Adding5µLatthisconcentrationtothefinalreactionmixvolumeof50µLyieldsa1✕concentrationinthefinalreaction..样品的稀释SampleStockConcentratio57配制PCR反应mixComponentVolume(µL)for1ReactionMasterMix(2.0✕)25.0AssayMix(20.0✕)2.50Water17.50TotalVolume45.0

Thereactionmixcomponentsare:–TaqMan®UniversalPCRMasterMix(2✕)–18SAssayMix(20✕)–EGR3AssayMix(20✕)–MAOBAssayMix(20✕)–OGDHAssayMix(20✕)–OSGEPAssayMix(20✕)–SERPING1AssayMix(20✕)–Water反应成分反应成分的体积计算.配制PCR反应mixComponent58Forthe18Sassay,addtherequiredcomponentstothe18SReactionMixtube:ComponentVolume(µL)for1ReactionVolume(µL)for16Reaction)TaqMan®UniversalPCRMasterMix(2✕)25.0440.018SAssayMix(20✕)2.544.0Water