碱性磷酸酶的动力学分析课件

实验四

碱性磷酸酶的动力学分析酶促反应动力学：研究酶促反应速度及其影响因素，并加以定量的阐述。影响因素：酶浓度、底物浓度、pH、温度、抑制剂、激活剂等。

在研究某种因素对酶促反应速度的影响时，其余各因素均需保持恒定。一、实验目的1.掌握ALP活性测定的原理与方法2.观察温度、pH、底物浓度、抑制剂对酶促反应速度的影响。3.掌握双倒数作图法测定km值的原理与方法。1.温度对酶促反应速度的影响温度对酶促反应速率具有双重影响酶的最适温度酶的最适温度不是酶的特征性常数，它与反应所需时间有关温度对淀粉酶活性的影响2.pH对酶促反应速度的影响酶促反应的最适pHpH通过改变酶与底物分子解离状态影响反应速率最适pH不是酶的特征性常数，它受底物浓度、缓冲液种类与浓度、及酶纯度等因素的影响。pH对某些酶活性的影响3.底物浓度对酶促反应速度的影响当底物浓度较低时,V随[S]的增大而急剧上升,两者成正比关系。随着底物浓度继续增加,反应速度增加,而幅度不断下降。若继续加大[S]，反应速度就不再增加,达到一个极限值Vmax。底物浓度对酶促反应速度的影响[S]与V的关系：米-曼氏方程

Vmax为最大反应速度，Km为米氏常数，[S]为底物浓度当[S]Km时，，反应速率与底物浓

度成正比当[S]Km时，VVmax，反应达到最大速率Km和Vmax值的测定双倒数作图法：将米氏方程式两侧取双倒数，得以1/V对1/[S]作图，得出一直线。双倒数作图法竞争性抑制曲线图

竞争性抑制剂与酶的底物结构相似,与底物竞争酶的活性中心,从而阻碍酶与底物结合成中间产物。特点：（1）V下降，发生抑制（2）Vmax不变（3）Km增大，亲和力下降反竞争性抑制曲线图特点:(1)V下降，发生抑制(2)Vmax减小(3)Km减小抑制剂与酶和底物形成的中间产物结合，使中间产物的量下降。既减少从中间产物转化为产物的量，也同时减少从中间产物解离出游离酶和底物的量。竞争性抑制作用

竞争性抑制剂与酶的底物结构相似，与底物竞争酶的活性中心，阻碍酶与底物形成中间产物，从而抑制酶的活性。竞争性抑制作用米氏方程双倒数方程竞争性抑制作用特点：抑制剂与底物结构相似两者都与酶的活性中心结合抑制程度取决于抑制剂与酶的相对亲和力及抑制剂与底物浓度的相对比例，增加底物浓度可减低或解除抑制作用动力学变化：Vmax不变、Km值变大

5.酶活性的测定

酶活性：是指酶催化化学反应的能力，衡量标准是酶促反应速度的大小。

酶促反应的速度（V）：通常用单位时间，底物的消耗量或产物的生成量来表示，而一般测定时都是以产物的生成量为准。

C6H5NH3C-NH3C-CC-NH2C=O

H3C-NOH+

C6H5NH3C-NH3C-CC-N=

C=O

H3C-NOK3Fe(CN)6OH-4-氨基安替比林醌衍生物O-P=OONaONa磷酸苯二钠+

H2OALPOHHO-P=OONaONa+

磷酸氢二钠醌衍生物为红色,根据红色深浅测出光密度值,计算不同底物浓度时酶的反应速度（以产物的生成量表示）。酚Lambert-Beer定律：=ＫＣＬ

Ａ三、试剂和仪器pH8.0、9.0、10、11.5甘氨酸缓冲液、0.04mol/L底物10mmol/L底物4-氨基安替比林0.5%铁氰化钾酶液0.5mol/LNaOHpH8.8Tris缓冲液、0.1mol/LpH10碳酸缓冲液磷酸氢二钠蒸馏水四、操作步骤1.温度对酶促反应速度的影响2.pH对酶促反应速度的影响3.底物浓度对酶促反应速度的影响4.抑制剂对酶促反应速度的影响六、结果绘图1、绘出pH对反应速度的影响，标出最适pH。2、绘出温度（T）对反应速度的影响，标出最适温度。3、绘出1/[S]对1/[V]的直线图，求出Km和Vmax。4、绘出有抑制剂Na2HPO4时1/[S]对1/[V]的直线图，求出有竞争性抑制剂存在时Km和Vmax的变化。[作图]1/[S]1/V-1/Km

根据图求得Km和Vmax,求出有竞争性抑制剂存在时Km和Vmax的变化。1/Vmax七、注意事项1.试剂较多，看清楚名称和浓度，认真实验，取样要准