微生物检测领域新技术介绍课件

产品经理邹黎明回顾近几年微生物检测仪器的变化沉降法测浮游菌回顾近几年微生物检测仪器的变化人工稀释自动稀释回顾近几年微生物检测仪器的变化传统灭菌及手动倒平板自动制备及分装系统回顾近几年微生物检测仪器的变化手工液体分装自动液体分装蠕动泵液体分装回顾近几年微生物检测仪器的变化手工计数简单的自动菌落计数压力传感式累加计数高级自动菌落计数回顾近几年微生物检测仪器的变化手工鉴定数据编码软件辅助鉴定全自动微生物鉴定系统灵敏度问题

导致出现假阴性结果检测速度问题

通常需要3-7天灵敏度问题25g+225g(mL)稀释→均质→增菌（1－3次）→取1mL菌液提取DNA→PCR检测一般定量PCR方法的检测限从数十个至几千个菌，也即是说250mL体系里要有数万个至上百万个菌才有可能检出。免疫磁分离方法，无需选择性增菌，快速实现高特异性分离。大样循环，提高灵敏度减少样品基质的干扰减少其它微生物的干扰，减少假阳性BiomereiuxVIDASTECRAELISADuPontBAXIDAHORAPIDLTROCHELightCyclerBioRad-IQBioAppliedBioSystemsCepheidSmartCyclerBioControlGDSOXOIDBECTONDICKINSONMETHODKEY=PCR

methods=Colourimetricmethods=PlateBased

MethodsPATHATRIXHASBEENSUCCESFULLYCOUPLEDTO….

取样量比较完整样品250,000µlPCR/ELISA5µl-100µl=225ml+25gfoodsample–standardPathatrix=50mlPooledsub-sample=0.05-0.1mlPCR/ELISAsub-sampleKEY

混合样50,000µl非选择性增菌数小时或过夜250mL或1375mL循环捕获免疫磁分离大样分离原理外磁场捕获磁分离免疫磁分离大样分离原理洗涤去除干扰杂质撤离磁场，洗脱，实现大样浓缩通常绝大多数病毒带负电荷，Matrix公司提供一种试剂PCAT50，它是一种带磁性的阳离子树脂，可以将大量样品中的病毒通过循环捕获进行浓缩纯化，可以大大提高灵敏度，减少样品基质的干扰。Pathatrix免疫纯化30分钟定量PCR快速确认<1hrSTANDARDPATHATRIXSAMPLEReplacecapandBeadBeatfor5minonVortexGeniewithTurboMixonhighestsettingTransfer25µlofbeadsuspensionintoSmallBeadTubeAdd100µlPBStoRe-suspendthebeadsPLATEOUTbeadsuspensionfromPathatrix(75µl)Transfer10µlofbeadfreesupernatantto‘unknown’vialPCR+VE?MagneticCaptureRackCaptureBeadsfor1minAdd10µlofPCRReconstitutionBufferto‘unknown’testvial(optional)25µl

Transfer18µlfrom‘Unknown’testvials9618µlUR10µlTestSample10µlReconstitutionBufferMIXWELLCapandSpin(3secs)tocapillaries.

PlacetestcapillariesinR.A.P.I.D.LTcarousel,Check-/+

PCRcontrolsareinposition1&2CloselidandfollowscreenshotprotocoltobeginPCRtestBeadfreeSupernatant单独用定量PCR检测微生物干扰物质多单独用定量PCR需要将菌增菌至104-105/mL，时间较长免疫磁分离可大大减少干扰免疫磁分离由于采用了大样循环，只需将菌增菌至102-103/mL就已经足够。减少样品基质的干扰，提高检测灵敏度加快检测速度处理公共应急突发事件，将免疫磁分离与定量PCR结合，快速在2小时内获取结果。做为一个方法储备“零”成本微生物鉴定时代即将来临美国MIT公司全称MicroEmagingTechnology是一家上市高新技术公司(OTCBB"MMTC"),MIT采用全新专利技术研发的MIT1000致病微生物快速鉴定系统，是一项具有划时代的影响深远的革命性的技术，对微生物检测领域无疑是一次质的飞跃和突破，从此政府和企业不必再承担高昂的微生物鉴定成本。MIT1000采用全新设计理念，与传统的检测表型或基因型方法鉴定微生物的原理完全不同，它采用660nm激光照射微生物活体细胞，通过35个光学检测器全方位检测反射和透射光谱信号，信号经过特殊算法合成一个光谱图，每种微生物的特征图谱是不同的，用各种标准菌株建立光谱图数据库，鉴定时系统只需分析10-50个细胞的光谱图，在10分钟内将检测到的图谱与数据库对比，给出最可能的鉴定结果。35个光学检测头全方位检测光谱信号鉴定10-50个微生物即可出结果鉴定10-50个微生物即可出结果鉴定10-50个微生物即可出结果鉴定成本低至1元人民币，与其它产品相比，无需专用鉴定耗材，检测成本几乎可以忽略鉴定速度快。只需挑取菌种，用无菌过滤水稀释后上机鉴定，10分钟出鉴定结果。目前可鉴定26种常见致病菌，数据库正在不断升级中。已经获得AOAC权威认可芽胞菌：蜡样芽胞杆菌和枯草芽胞杆菌产气肠杆菌粪肠球菌E.coli,E.coliO157:H7肺炎杆菌克氏库克菌李斯特菌spp奇异变形杆菌，普通变形杆菌绿脓杆菌沙门氏菌：猪霍乱沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌志贺氏菌：鲍氏志贺氏菌、福氏志贺氏菌、宋内氏志贺氏菌葡萄球菌：金黄色葡萄球菌、抗新青霉素型金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌化脓性链球菌小肠结肠炎耶尔森氏菌认证号：2009_060901认证结论：

ThePTMblindtestscoreof99%indicatesthattheMIT1000RMIDSystemcanaccurately

identifyListeriaanddistinguishitfromotherbacteriaandwerecommendthatthisMethodbe

approvedbyAOACRI.Thetestprotocolrequiredatotalof81blindtests–55donebytheMITlaboratoryand26donebytheUSDAARSlaboratory.Eightyof81testswerecorrectlyidentifiedyieldingascoreof99%.食品、药品和化妆品企业对致病菌进行快速鉴定用政府检测机构对致病菌进行快速低成本鉴定CDC、医院等对病原菌进行快速鉴定，节省大量检测成本。数据库还需要再扩充在中国的标准化问题进一步增加AOAC认证项目流式细胞与活细胞荧光标记技术在微生物快速检测中的应用华粤企业集团有限公司样品过滤或稀释平板上培养培养2-14天读数SinglecellColonyGrowthphase2-14days

90%的微生物测试使用此方法达到130年之久，倾注平板法由RobertKoch(1843-1910)和JuliusRichardPetri(1852-1921)发明，从单细胞至可见菌落需要几天时间速度慢经典时间2–14天事后性的追溯速度与灵敏度的折衷方案灵敏度不一致结果取决于微生物区系，培养基及培养条件孢子、受抑制的或厌氧的微生物需要延长相当长的培养时间目前的常规微生物快速检测方法显微镜快速计数优点：辅助适当染色剂，可快速地用于澄清的、高菌数的样品进行定性或粗略定量检测，一般用于水、饮料、酒类产品中的无菌检测或污染菌检测缺点：耗时费力，无法高通量，容易假阴性或假阳性，低菌数的样品需要过滤浓缩。目前的常规微生物快速检测方法ATP快速检测法(三磷酸腺苷)优点：生产线或管道清洁程度快速检测；纯培养微生物数量粗略定量；无菌产品保温数天后高通量快速检测；缺点：ATP法一般检测限细菌是10000个，酵母10个；受非微生物ATP干扰易出现假阳性结果；微生物的生长状况影响，样品保存条件，基质的干扰等各种因素影响较大物理参数间接测定微生物(电导率、二氧化碳、颜色)优点：菌数越高，越快出结果.电导率方法成本较低缺点：需要做标准曲线；要让菌数长到上百万个才有明显的信号变化；基于二氧化碳和颜色变化的方法检测成本太高；受样品基质干扰较大；微生物区系复杂偏差较大。优点：直接对单个细胞进行计数，无需长成菌落；检测时间只需1小时；灵敏度可以达到1-100个菌有全自动或半自动仪器可选缺点：仪器投入较大；检测成本相对较高。

Fluorassure®

Reagents荧光标记试剂ChemScan

®

RDI细胞扫描读数用于可过滤产品D-Count®

全自动流式细胞用于可过滤或不可过滤产品BactiFlow®

紧凑型流式细胞仪用于可过滤或不可过滤产品基于单个完整细胞的荧光标记技术可对总活菌数及特定微生物十几年工业应用经验大量的科学文献支持酶活性底物游离荧光色原细菌活细胞的标准:

酶活力

膜完整性用于:TVC总活菌数

酵母和霉菌总数

细菌酵母霉菌流式细胞技术在微生物检测中的应用

用于可过滤或不可过滤产品的微生物快速计数灵敏度可以达到1-100个细胞30-60min完成检测单细胞标记检测技术流式细胞:

线性流体

单细胞分析

高灵敏检测器红光检测器与鞘液混合后的废液绿光检测器标记后的样品激光鞘液鞘液流速：10mL/min样品流速：200uL/min前处理后的样品放入自动仪器中

每批25或50个样品自动化仪器，减少人工操作全自动标记和过滤

自动加所有试剂

自动控制保温温度和时间快速灵敏的分析

每小时50个样品

结果直接显示每mL多少个菌数饮料

果汁及浓缩汁

原奶、UHT奶、巴氏奶

软饮料食品酸奶

水果制品

甜品

蔬菜制品肉类部分调味品全球重要客户名单Antartic,UnileverBestFood,Campbell,Coca-Cola,Danone,Délifruits,EckesGranini,Gerber,IFF,InstitutPasteur,Joker,MoetetChandon,Migro,Mona,Müller,Nestlé,Onken,Sill,SwissDairyFood,Yoplait,Zott,Zuegg,…BDF,L’Oréal,P&G,Roval,YvesRocher,YvesSaintLaurent,…ChemScanÒRDI

用于可过滤产品的微生物或原生虫快速计数灵敏度可以达到1个细胞100min完成检测2.标记3.激光扫描3min1.过滤

1.过滤2.标记3.激光扫描样品过滤滤膜垫板含饱和预标记液主要目的是激活细胞内酶活力，增加膜通透性预标记60min滤膜转移ChemScanRDI

™

激光扫描滤膜垫板含饱和预标记液主要目的是对细胞进行荧光标记标记30min对滤膜进行全场扫描3分钟扫描时间结果直接显示细胞个数激光扫描扫描后的图像可接显微镜快速确认固定细胞计数技术应用领域饮用水总活菌数、贾第鞭毛虫和隐孢子虫可过滤澄清样品中的TVC检测制药企业过程用水中总活菌数(生物负载量)半导体企业生产用水中总菌数航空燃油领域用于总菌数检测知名药厂使用该技术通过FDA认证

GSK在2004年获FDA认可

FDA认可使用ChemScanRDI用于水中常规微生物分析SanofiWinthrop获西班牙权威认证

用于非灭菌产品。

severalsitesinEurope

havebeenauditedbyFDAanddemonstratedtheuseoftheChemScan.Noneoftheinspectorshadanyadverse