微生物检验机构质量管理

关于微生物检验机构质量管理第一页，共五十四页，2022年，8月28日微生物检验的特点-1微生物种类繁多而又复杂，必须正确把握样本的采集时机、部位、运送、保存及处理等环节，选择最佳方法，及时检验，正确、规范操作，才能及时、准确地报出准确可靠的结果。第二页，共五十四页，2022年，8月28日

微生物检验的特点-2

五大卫生样品中的病原微生物数量少，种类又多，生物学性状也是多种多样的，将环境中存在数量较多、具有一定代表性、检测方法较简单的微生物作为指标性微生物。根据这些指标性微生物的检出情况，来判断样品被污染的程度，间接地指示病原微生物存在的可能；以及对人群是否构成潜在的威胁。第三页，共五十四页，2022年，8月28日一、微生物检验过程关键控制点微生物检验过程是个涉及多个子过程的系统，一般包括：采样与运输（需要时）、样本接收、保存与处置、样品制备、检验与记录、结果与报告等子过程。每个子过程又由多个环节构成，个个环节又受多种因素影响，因此识别和控制关键环节是质量管理的重点。第四页，共五十四页，2022年，8月28日过程关键控制点影响微生物检测结果正确性和可靠性的关键控制点及其控制要求涉及到的要素包括：服务和供应品的采购-试剂与培养基的控制人员设施和环境条件检测和校准方法及方法确认设备测量的溯源性抽样检测和校准物品的处置第五页，共五十四页，2022年，8月28日试剂与培养基的控制要求实验室应有对试剂与培养基进行检查、评估，要求在初次使用和保存期限内验证并记录每一批对检测起决定性作用的试剂与培养基的适用性，不得使用未达到相关标准的试剂与培养基。第六页，共五十四页，2022年，8月28日实验用水的控制要求除非实验方法有特殊要求，培养基、试剂及稀释剂配制用水应经蒸馏、去离子或反转渗透处理并无菌、无干扰剂和抑制剂，配制用水应满足下列参数：a)电阻率在25℃时应≥300000Ω.cm），建议每周检测一次b)菌落总数小于1000cfu/mL，建议每月检测一次c)重金属（Cd，Cr，Cu，Ni，Pb等）小于0.05mg/L，重金属总量小于10mg/L，建议每年检测一次。《GB/T27405-2008实验室质量控制规范食品微生物检测》5.4试剂和培养基中的规定第七页，共五十四页，2022年，8月28日培养基质量控制方法

1.理化试验方法1.1

pH值测定:灭菌前后都应该测定pH值,采用连接可渗透陶器型液体接头的电极测定液体培养基的pH,固体培养基可用平头电极或者连接微型探头的电极测定pH。pH值在灭菌前后均需测定,测量时尽量使培养基温度降到20℃～25℃,校正通常用接近40g/L的NaOH或者接近36.5g/L(约1mol/L)HCl。第八页，共五十四页，2022年，8月28日

1.理化试验方法1.2凝胶强度测定:凝胶强度也是一个重要指标,灭菌条件特别是pH会影响凝胶强度。Gelometer(MarineColloidsInc1,2,EdisonPlace,Springfield,NJ07081,U1S1A1)和theLFRATextureAnalyser(C1S1Stevens&SonLtd1DolphinYard,HolywellHill,St1Albans,Herts,U.K.)均能提供良好的测量性能。这种仪器利用直径为10mm～25mm的圆柱形金属探头测量压破琼脂表面时所需的压力。第九页，共五十四页，2022年，8月28日2.微生物学方法根据培养基的用途不同，培养基的质量控制方法不同。第十页，共五十四页，2022年，8月28日2.1普通增菌培养基质量控制将质控菌种新鲜培养液按1：10000稀释，接种0.01ml（约100CFU）培养，应获得充分生长。第十一页，共五十四页，2022年，8月28日2.1.1混合增菌培养法SC肉汤质控目标菌：鼠伤寒沙门氏菌、非目标菌：大肠杆菌方法：将目标菌和非目标菌肉汤新鲜培养物按照99：1进行混合，接种SC肉汤，35℃培养18-24h，适当稀释，涂布麦康凯琼脂，沙门氏菌为无色菌落，平板上应90%以上均为沙门氏菌生长，大肠杆菌为粉红色，平板上生长应<10%。第十二页，共五十四页，2022年，8月28日2.1.2测定增菌倍数法四硫磺酸盐煌绿增菌培养基(TTB)

质控菌株：目标菌：伤寒杆菌NICPBP50098、鼠伤寒沙门氏菌NICPBP50013。非目标菌：大肠杆菌NICPBP44156、粪链球菌NICPBP32221。方法：-将质控菌肉汤培养物10倍稀释至10-6；-取1mL稀释菌液接种于9mL四硫磺酸钠增菌液，重复接种3管，同时从同一10-6管稀释液中吸取0.1mL，涂抹于营养琼脂平板，重复3副平板，37℃培养18h后，平板菌落计数；第十三页，共五十四页，2022年，8月28日续-沙门氏菌的增菌液3管各取1mL混匀后，10倍系列稀释到10-5，取0.1mL涂布于营养琼脂平板，重复3副平板，并于37℃培养18h后，作菌落计数。-大肠杆菌和粪链球菌的增菌液各3管分别混匀后，稀释到10-2，取0.1mL涂布营养琼脂平板，各重复3副平板，并于37℃培养18h后，作菌落计数。

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测定增菌倍数法（续2）结果判定：增菌后平板菌落计数平均值×105

1）沙门氏菌增菌倍数= ≥105

增菌前平板菌落计数平均值

增菌后平板菌落计数平均值×1022）大肠杆菌和粪链球菌增菌倍数=≤102 增菌前平板菌落计数平均值3）合格指标：沙门氏菌应增菌105倍以上大肠杆菌和粪链球菌增菌应低于102

第十五页，共五十四页，2022年，8月28日2.2选择性分离培养基

在此类培养基中，一般都含有某种指示剂和抑菌剂，以指示某种生化反应和抑制某些非目标菌的生长。目标菌在这类培养基上生长的过程中，伴随着生化反应，使其具有明显的菌落特征，能与其他细菌相区别。第十六页，共五十四页，2022年，8月28日选择性分离培养基（续）将质控菌种新鲜培养液按1：10000稀释，接种0.1ml（约100~1000CFU）涂布培养。按ISO/TS11133-1（食品和动物饲料微生物学—制备和生产培养基的导则—第一部分）中要求，接种目标阳性菌、弱生长阳性菌株、呈现不同生化特性的菌株和非目标菌（被抑制菌株），观察菌种的典型生长情况，并通过灵敏度、特异性对该类培养基的质量进行控制。灵敏度：目标菌应能生长100~1000CFU/板特异性：目标菌应生长良好，并具有典型特性，非目标菌应不生长。第十七页，共五十四页，2022年，8月28日

2.3鉴别培养基鉴别培养基是一类检测细菌生理、生化特性的培养基。它适用于细菌纯培养物的分类与鉴定。鉴别培养基的基本反应原理：借助于某些微生物所特有的某种酶，对培养基中某一特有成分进行分解，如脱氢、脱氨、脱羧、发酵、水解等作用。第十八页，共五十四页，2022年，8月28日续在这些作用过程中往往会显示一定的生化反应，可以根据这些特有的生化反应情况，来判别某一或某些细菌是否存在，或所分离菌种是属哪一类型。所以这类培养基的质控，必须先用已知菌种进行鉴定，在证明各种反应显示正常后方可使用。[质控菌株]阳性和阴性控制菌株

[操作]

挑取斜面质控菌单菌落菌苔，接种于待检培养基，培养后观察典型生化反应。有些培养基需要制备标准浓度菌悬液接种。第十九页，共五十四页，2022年，8月28日续质控菌株：阳性和阴性控制菌株操作：挑取斜面质控菌单菌落菌苔，接种于待检培养基，培养后观察典型生化反应。有些培养基需要制备标准浓度菌悬液接种。第二十页，共五十四页，2022年，8月28日人员要求微生物检验人员教育、培训、能力、资质、层次配备与数量应与所开展的微生物工作相适应。第二十一页，共五十四页，2022年，8月28日1.教育与培训微生物检验人员应有具微生物或相近学科专业教育背景的专业人员（原则上应具有专科及以上学历）；培训主要是针对具体的实验操作而对有关人员进行的专门培训，包括样品的处理原则、微生物检测技能、仪器设备的正确使用、实验室生物安全、新技术、新方法的继续教育等方面培训。培训应保存计划和效果评价记录。第二十二页，共五十四页，2022年，8月28日2.资质与确认一般资质：微生物检验人员经培训，考核合格后持证上岗，可从事微生物检验工作。第二十三页，共五十四页，2022年，8月28日

续特殊资质：从事消毒和操作高压灭菌器的人员，应具备消毒学常规知识，并通过质量技术监督部门组织的特种压力设备操作知识的专门培训，取得合格证资质后，由单位授权上岗。第二十四页，共五十四页，2022年，8月28日续负责高致病性菌毒种和标本运输的人员，需经过国家疾控中心实验室管理处和国家民航总局组织的相关培训，并取得民航总局颁发的“中国民用航空危险品运输训练合格证”资质后，方能完成运输交接和领取工作。对于负责高致病性对于使用操作全自动微生物鉴定仪、核酸测序仪等大型精明仪器设备的人员和菌毒种、化学危险品管理人员等，单位应组织培训考核，并授权。第二十五页，共五十四页，2022年，8月28日技能确认与培训效果评价方法通过开展微生物检验实验室内部质量控制、使用标准菌株或参加能力验证、实验室间比对活动等方式，评估微生物检验人员的技能掌握程度，客观评价人员培训的有效性。当开展新项目或进行非经常开展项目或技术时，在检测前应对微生物检测人员的操作技能再作确认。第二十六页，共五十四页，2022年，8月28日3.健康监护从事传染病实验室检验的人员，特别是开展高致病性病原检验和研究工作的人员，需建立个人健康档案，保留上岗前个人特定空白血清；每年进行健康检查和与从事特定病原检验工作的针对性疾病检查，必要时预防性接种适用疫苗；建立实验室暴露或感染的处理工作程序和感染应急就医等预案，确定定点医院。第二十七页，共五十四页，2022年，8月28日设施和环境条件卫生微生物实验室应具有进行微生物检测所需的适宜、充分的设施条件。应有具单向流的各功能区，包括：净化室（局部百级）（无菌室）、半无菌缓冲区、二级生物安全实验室、微生物培养室、高压灭菌与洗涤烘干室、培养基配制间以及耗材试剂储藏室等。应设计工作流保证整个微生物实验区的布局符合要求，明显标识各功能区。第二十八页，共五十四页，2022年，8月28日续病原微生物实验室应有具有净化室、二级以及二级以上级别生物安全实验室。实验室的建设应以“无回路”为宗旨；整个试验区有防鼠、防蚊虫或其他昆虫进入的设施（符合GB/T19489-2008规定）。第二十九页，共五十四页，2022年，8月28日续一般设有：常规病原微生物检验区、实验辅助区、PCR或分子生物学实验区、专门重点疾病实验区（HIV实验室等）、BSL-3试验区（有另外规定略）等。第三十页，共五十四页，2022年，8月28日控制措施在病原微生物各试验区必须设置出入控制设施，如门禁系统或其他物理隔离装置或警戒线；在控制处设明显的警示标识，如生物安全标识、进入控制提示语等；在控制进入处设供参观者使用的个人防护用品和记录簿。第三十一页，共五十四页，2022年，8月28日环境监测实验室应制定科学合理的环境监测操作规程。洁净区域应检测洁净度状态如：沉降菌、浮游菌、尘埃粒子数；设定可接受的背景菌落数量，并且有文件化的规定来处理背景菌落总数超标情况。定期更换净化室初效、中效和高效过滤器。第三十二页，共五十四页，2022年，8月28日续生物安全柜应监测风速、压力、气流方向等指标，必要时检测箱体内粒子数和无菌检测；缓冲间和无菌间均有紫外线杀菌灯（2-2.5W/m3），应定期检查辐射强度，使照射操作台达40W/cm2。第三十三页，共五十四页，2022年，8月28日续传统无菌操作室应按要求进行使用前后的无菌处理。不符合要求的紫外灯、消毒液应及时更换。记录与数据分析应倾向于能够确定污染水平。第三十四页，共五十四页，2022年，8月28日卫生要求应尽可能减少在实验室进行文件处理；禁止把植物和个人物品带入实验室工作区域。根据所检测的微生物危害等级的不同，在实验室内穿着相应的防护服，离开工作区域时必须脱下。这对分子生物学实验室和危害等级II级以上实验室尤其重要。应准备足够数量的洗手设施和急救材料。第三十五页，共五十四页，2022年，8月28日检测方法的确认实验室应对非标准方法实验室设计（制定）的方法超出其预定范围使用的标准方法扩充和修改过的标准方法进行确认；在采用新的方法进行检测前，对方法进行验证标准更后的方法的技术能力的确认。第三十六页，共五十四页，2022年，8月28日确认方法通过使用自然污染产品或人工污染预定微生物的样品来实现检测方法的确认。向基质中添加预定微生物能反映出实际检测状况，这是简单模拟自然污染的状态，是目前唯一的最佳方法。需要确认的范围取决于所用方法及其预期应用范围。第三十七页，共五十四页，2022年，8月28日验证指标对非标准方法、实验室设计（制定）的方法、超出其预定范围使用的标准方法、扩充和修改过的标准方法验证指标：定性微生物检测方法应确认其特异性、阳性偏差、阴性偏差、检测限、培养基影响、重复性和再现性。第三十八页，共五十四页，2022年，8月28日续定量微生物检测方法应确认其特异性、灵敏度、阳性偏差、阴性偏差、重复性、再现性以及规定的可变范围内的检测限。在检测不同种类的样品时，应考虑不同培养基的差异。应使用适当的统计方法评估检测结果。第三十九页，共五十四页，2022年，8月28日

证实的方法与指标适用于新方法与标准变更（只年号变更除外）的方法确认向样品中添加指示菌来简单模拟自然污染状态，按标准方法操作。定性微生物检测方法：测定检测限、进行生化试验、血清学试验。

定量微生物检测方法：测定指示菌的回收率；结果判断标准：指示菌的回收率应不低于70%。第四十页，共五十四页，2022年，8月28日设备与测量的溯源性微生物实验室应制订并实施设备维护、校准和性能验证规程对仪器设备的校准和/或检定（验证）、确认的编制总体要求第四十一页，共五十四页，2022年，8月28日续

微生物检测涉及的需定期检定的仪器设备有：天平、砝码、pH计、分光光度计、温度和压力仪表、消毒压力容器、灭菌柜安全阀、游标卡尺等。计量器具执行《中华人民共和国强制检定的工作计量器具管理办法》规定，编制年度检定计划，依法送检第四十二页，共五十四页，2022年，8月28日使用与维护记录实验室在仪器设备完成相应的检定、校准、验证、确认其性能，并形成相应的操作、维护和保养的标准操作规程后方可正式使用，使用要有记录。为保证设备处于良好工作状态，应定期维护和期间核查，并保存相关记录。第四十三页，共五十四页，2022年，8月28日标准物质和标准菌株标准物质标准物质和有证标准物质提供了测量中基本的可溯源性，其可用来：a)证明结果的准确性；b)校准设备；c)监测实验室运转；d)验证试验方法； e)比较试验方法。第四十四页，共五十四页，2022年，8月28日标准菌株微生物检验用的试验菌应来自认可的国内或国外菌种收藏机构的标准菌株，或使用与标准菌株所有相关特性等效的商业派生菌株。第四十五页，共五十四页，2022年，8月28日

续标准菌株、标准储备菌株和工作菌株从储备菌株传代培养次数不得超过5次除非标准方法中要求并规定，或实验室能够提供文件化证据证明其相关特性没有改变。工作菌株不可代替标准菌株。标准菌株的商业衍生物仅可用作工作菌株。第四十六页，共五十四页，2022年，8月28日抽（采）样采样与样本运输针对不同疾病和检验目的制订详细的采样计划和方案，包括采样时间、对象、样本种类、方法、标识、包装运