基因工程基因操作的工具酶

3.3DNA聚合酶DNA聚合酶：能够催化脱氧核糖核苷酸连续加到双链DNA分子引物链的游离3’-OH末端，使核苷酸发生聚合作用，而不从模板上解离。反应特点：(1)以四种三磷酸脱氧核糖核苷（dNTP）为底物(2)反应需要模板的指导，加入的核苷酸由模板链所决定(3)聚合反应需要有引物存在，且引物要有3’-OH游离基团(4)DNA链的生长方向为5’3’(5)产物DNA链的性质与模板相同（半保留复制）

DNA聚合酶只能在已有的核酸链上延伸DNA链，而不能从无到有开始DNA链的合成。种类：到目前为止，已从E.coli中发现了PolI、PolII、PolIII三种DNA聚合酶。其中PolI和PolII的主要功能是参与DNA的修复过程，PolIII与DNA的复制有关。三种聚合酶中，只有PolI同分子克隆关系密切。3.3.1大肠杆菌DNA聚合酶I（E.coliDNAPolI）

DNAPolI是从大肠杆菌细胞中分离得到的，该酶是由单一多肽组成的球蛋白，MW=109000，直径=65ÅDNAPolI已得到高度纯化，从100kg大肠杆菌中可以分离到约500mg纯化的酶蛋白。每个成熟的大肠杆菌细胞中约有400个分子的PolI。1.DNAPolI在空间结构上有三个位点：(1) DNA模板结合位点——结合模板(2) 核苷酸-磷酸结合位点——结合引物(3) dNTP结合位点——结合底物2.DNAPolI是一种多功能酶：(1)5’3’的聚合酶活性催化单核苷酸逐个地结合到DNA模板的3’-OH末端，沿着引物的3’-OH方向按模板顺序从5’3’延伸。每分子DNApolI每分钟可以催化约1000个核苷酸的聚合。(2)5’3’的外切酶活性只作用于双链DNA（dsDNA），从5’端切割下一个个单核苷酸。(3)3’5’的外切酶活性能从游离的3’末端降解单链DNA（ssDNA）成为单核苷酸，通常对双链DNA不作用。在正常聚合条件下，该酶对dsDNA的3’5’外切酶活性受到5’3’聚合酶活性的抑制。但一旦出现错配碱基时，聚合反应立即停止，由3’5’外切酶迅速除去错误进入的核苷酸，然后聚合反应才得以继续进行下去。所以3’5’核酸外切酶活力被认为起着校对功能，对DNA复制的忠实性极为重要。3.E.coliDNAPolI在基因工程中的用途:(1)可用于填补dsDNA上的缺口，以便有效地进行DNA重组(2)用于DNA序列分析(3)用于制备DNA探针在DNA分子的单链缺口上，DNA聚合酶I的5’3’核酸外切酶活性和聚合作用可以同时发生。当外切酶活性从缺口的5’一侧移去一个5’核苷酸后，聚合作用就会在缺口的3’一侧补上一个新的核苷酸。随着反应的进行，5’一侧的核苷酸不断地被移去，3’一侧的核苷酸又按序地增补，于是缺口便沿着DNA分子按合成的方向移动——缺口平移（NickTranslation）。应用缺口平移法制备DNA杂交探针，其典型的反应体系是：在25

l总体积中含有1g纯化的特定的DNA片段，并加入适量的DNaseI、polI、32PdNTP和未标记的dNTP。

脱氧核糖核苷酸酶I（DNaseI）是一种内切酶，它能够水解单链或双链DNA，形成带有5’-磷酸末端的单（寡）核苷酸。

由于32PdNTP比较较昂贵，所以以一般都采用用低浓度的32PdNTP（2mol/L））和高浓度的的未标记的dNTP（20mol/L））。而且就大大多数实验的的要求，使用用一种32PdNTP就足足够了，其他他3种均可采采用未标记的的dNTP，，或是用适量量的未标记的的dNTP稀稀释每种32PdNTP。改变反应体系系中DNaseI的数数量，可以控控制32PdNTP的参参入程度，一一般希望有30%左右的的32PdNTP参入入DNA链。。大大肠杆菌DNA聚合酶酶I的Klenow片片段（E.coliDNAPolIKlenowfragment））用蛋白酶将DNAPolI作作有限水解，，可得到分子子量为75000dal和36000dal的两个片片段，大片段段即称为Klenow片片段，它具有有5’3’的聚合酶酶活性和3’’5’的核酸外外切酶活性，，但失去了全全酶的5’3’的核酸外外切酶活性。。Klenow聚合酶可以以标记DNA片段末端（（5’延伸末末端）。对于限制性核核酸内切酶EcoRI切割后形成的的5’延伸末末端可用32PdATP标记记：而BamHI切割后形成成的5’延伸伸末端可用32PdGTP标记记：4DNA聚合酶酶是从T4噬菌体感染的的大肠杆菌中中分离纯化的的一种特殊的的DNA聚合合酶。1.T4DNA聚合酶酶也是一种多多功能酶：(1)5’’3’的聚合酶酶活性(2)3’’5’的外切酶酶活性其外切酶活性性比E.coliDNAPolI的的活性高200倍。(3)取代反应活性性如果在反应混混合物中仅存存在一种dNTP，则此此酶的3’5’外切酶活活性将从dsDNA的的3’末端降降解，直到互互补于这个dNTP的碱碱基出现为止止，然后在这这一位置发生生取代反应。。2.T4DNA聚合酶酶在基因工程程中的应用(1)以填填充反应标记记带有5’延延伸末端的dsDNA片片段(2)将将DNA的的3’’延伸伸末端端切成成平末末端(3)以以取代代反应应标记记带有有3’’延伸伸末端端或平平末端端的dsDNA片段段(4)以以部分分消化化dsDNA法法标记记DNA片片段作作为杂杂交探探针（（链特特异的的探针针）逆逆转录录酶是一种种有效效的转转录RNA成为为DNA的的酶，，又称称RNA依依赖的的DNA聚聚合酶酶，其其产物物DNA称称cDNA，即即互补补DNA。。1.逆逆转转录酶酶也是是一个个多功功能酶酶：(1)RNA依赖赖的DNA聚合合酶以RNA链链为模模板，，以带带有3’-OH末端端的DNA片段段为引引物，，沿5’3’方方向合合成DNA链。。几乎所所有真真核生生物的的mRNA分子子3’’末端端都有有一段段PolyA，故故加入入寡聚聚dT后，，mRNA就可可以成成为逆逆转录录酶很很好的的模板板，由由此可可合成成cDNA。(2)DNA依赖赖的DNA聚合合酶以ssDNA为为模板板，以以带有有3’’-OH末末端的的DNA片片段为为引物物，沿沿5’’3’方方向合合成DNA链。。可在新新合成成的DNA链上上合成成另一一条互互补DNA。(3)外外切RNA酶活活性底物是是RNA-DNA杂杂交分分子中中的RNA链，，其水水解方方向有有两种种：*从从RNA链链5’末末端外外切：：称5’3’外外切RNA酶*从从RNA链链3’末末端外外切：：称3’5’外外切RNA酶2.逆逆转转录录酶酶在在基基因因工工程程中中的的应应用用：：主要要用用途途是是转转录录真真核核生生物物的的mRNA成成为为cDNA，，从从而而制制备备基基因因片片段段。。3.商商品品化化的的逆逆转转录录酶酶有有两两种种：：(1)禽禽成成髓髓细细胞胞瘤瘤病病毒毒（（AMV））逆逆转转录录酶酶(2)Moloney鼠鼠白白血血病病病病毒毒（（Mo-MLV））逆逆转转录录酶酶AMV逆逆转转录录酶酶虽虽能能更更有有效效地地拷拷贝贝复复杂杂的的mRNA，，但但它它有有很很强强的的外外切切RNA酶酶活活性性。。而而Mo-MLV逆逆转转录录酶酶的的外外切切RNA酶酶活活性性较较弱弱，，更更有有利利于于制制备备全全长长的的cDNA。。两种种逆逆转转录录酶酶均均无无3’’5’外外切DNA酶活活性，，故不不具备备校对对功能能，在在高浓浓度dNTP和和Mn2+存在下下，容容易出出现核核苷酸酸错误误掺入入。3.4DNA和RNA的修修饰酶酶核核酸酶酶SI1.作作用特特点：：此酶是是从米米曲霉霉（Aspergillusoryzae）中提提取的的，可可降解解ssDNA或或ssRNA，，又称称单链链特异异性酶酶，其其降解解产物物是5’-磷酸酸末端端的单单或寡寡核苷苷酸片片段。。核酸酶酶SI对DNA底物物的活活性比比对RNA强。。高浓浓度的的核酸酸酶SI可可从缺缺口（（nick）或或小裂裂缝（（gap））处降降解dsDNA。2.作作用用条件件：需要Zn2+作为辅辅助因因子，，最适适pH是4.5，这这是与与基因因工程程的其其它工工具酶酶不同同的两两个特特点。。3.在在基基因工工程中中的应应用：：由于核核酸酶酶SI能从从DNA片片段中中切除除单链链尾巴巴，因因而在在质粒粒的重重建和和DNA重重组中中被广广泛使使用。。切除单单链粘粘性末末端，，产生生平末末端，，再用用T4连接酶酶连接接。切除cDNA的的发夹夹结构构。末末端脱脱氧核核苷酸酸转移移酶1.作作用用特点点：此酶是是从小小牛胸胸腺中中提取取的，，可催催化单单核苷苷酸转转移到到另一一个DNA分子子的3’-OH末端端上，，不需需要模模板，，其引引物是是带3’-OH末端端的ssDNA（（Mg2+为辅因因子））。平平末端端的dsDNA只有有CO2+存在时时才能能作引引物。。2.在基基因工程中中的应用：：在连接平末末端DNA片段时加加上互补的的同源多聚聚物（同聚聚物加尾法法）。3.4.3外核酸酸酶III1.作用用特点：此酶是从E.coli中分离得到到的，是一一种从dsDNA的的3’-OH末端降降解产生5’单核苷苷酸的外切切酶。2.在基基因工程中中的应用：：产生具有5’延伸末末端的DNA片段制备特异的的DNA探探针3.4.4外核酸酸酶Bal311.作用用特点：此酶是从乳乳白短杆菌菌（Brevibaceriumaldidum）中提取的的。能以渐渐进的方式式从线型DNA分子子的3’，，5’两端端同时降解解，产物是是单核苷酸酸或寡核苷苷酸片段。。底物可以以是带延伸伸末端或是是平末端的的dsDNA，对3’、5’’两端的降降解速度相相同。2.作用用条件：降解时需要要Ca2+作辅助因子子，以EDTA作螯螯合剂，可可使Bal31失失活。3.在基基因工程中中的应用：：可用于组建建DNA的的物理图谱谱，以及造造成克隆DNA分子子的末端缺缺失。3.4.5T4多核苷酸激激酶1.作用用特点：此酶是从噬噬菌体T4感染的E.coli中分离的。。能催化ATP的γγ-磷酸转转移到DNA或RNA的5’’-OH末末端上。2.在基基因工程中中的应用：：可用于缺乏乏5’-磷磷酸的待连连接DNA片段的5’端磷酸酸化：反转转录mRNA生成的的cDNA、人工合合成的DNA片段及及PCR扩扩增得到的的DNA都都缺少5’’-磷酸基基，在与克克隆载体连连接之前，，需用T4多核苷酸激激酶将DNA的5’’-磷酸化化。3.4.6碱性磷磷酸化酶（（碱性磷酸酸酯酶）1.作用用特点：从细菌中分分离的碱性性磷酸化酶酶简称BAP，从小小牛肠中分分离的简称称CAP。。它能特异异性地切去去DNA或或RNA的的5’-磷磷酸。底物物可以是ssDNA、dsDNA或RNA，也也可以是核核糖或脱氧氧核糖核苷苷三磷酸。。2.在基基因工程中中的应用：：在用32P标记DNA的5’’末端之前前，除去磷磷酸。在DNA重重组技术中中，除去DNA片段段的5’-磷磷酸，阻阻止质粒粒自身环环化，提提高转化化效率。。形成带有有两个缺缺口的开开环分子子，由于于环状DNA（（即使是是有缺口口的环状状DNA）的转转化效率率比线状状质粒DNA片片段高得得多，因因此绝大大多数转转化子都都含有重重组质粒粒，并且且这样的的缺口在在寄主细细胞内可可自行补补上。9、静夜四无邻邻，荒居旧业业贫。。12月-2212月-22Friday,December23,202210、雨中黄叶树树，灯下白头头人。。05:56:0405:56:0405:5612/23/20225:56:04AM11、以我我独沈沈久，，愧君君相见见频。。。12月月-2205:56:0405:56Dec-2223-Dec-2212、故人江海海别，几度度隔山川。。。05:56:0405:56:0405:56Friday,December23,202213、乍乍见见翻翻疑疑梦梦，，相相悲悲各各问问年年。。。。12月月-2212月月-2205:56:0405:56:04December23,202214、他他乡乡生生白白发发，，旧旧国国见见青青山山。。。。23十十二二月月20225:56:04上上午午05:56:0412月月-2215、比不了得就就不比，得不不到的就不要要。。。十二月225:56上上午12月-2205:56December23,202216、行动动出成成果，，工作作出财财富。。。2022/12/235:56:0405:56:0423December202217、做前，能够够环视四周；；做时，你只只能或者最好好沿着以脚为为起点的射线线向前。。5:56:04上午5:56上上午05:56:0412月-229、没有有失败败，只只有暂暂时停停止成成功！！。12月月-2212月月-22Friday,December23,202210、很多多事情情努力力了未未必有有结果果，但但是不不努力力却什什么改改变也也没有有。。。05:56:0405:56:0405:5612/23/20225:56:04AM11、成功就就是日复复一日那那一点点点小小努努力的积积累。。。12月-2205:56:0405:56Dec-2223-Dec-2212、世间成成事，不不求其绝绝对圆满满，留一一份不足足，可得得无限完完美。。。05:56:0405:56:0405:56Friday,December23,202213、不知香积寺寺，数里入云云峰。。12月-2212月-2205:56:0405:56:04December23,202214、意志坚强的的人能把世界界放在手中像像泥块一样任任意揉捏。23十二月月20225:56:04上午05:56:0412月-2215、楚塞三湘接接，荆门九派派通。。。十二月225:56上上午12月-2205:56December23,202216、少年十五二二十时，步行行夺得胡马骑骑。。2022/12/235:56:0405:56:0423December202217、空空山山新新雨雨后后，，天天气气晚晚来来秋秋。。。。5:56:04上上午午5:56上上午午05:56:0412月月-229、杨杨柳柳散散和和风风，，青青山山澹澹吾吾虑虑。。。