河南科技大学大学生训练计划SR项目申请书RN

河科大大学生训练计划（SRTP）

RNAi诱导tapmRNA降解对果蝇神经发育的影响成员：乔钰璐

丁劲峰

夏南飞

苏珂此项目意义何在？

其研究对生命科学的研究有何作用？我们都知道原神经（proneural）基因表达催生并确定神经前体细胞，神经前体细胞经增殖分化才形成神经系统，因此原神经基因对神经发生有决定性作用。原神经基因最先从果蝇中发现，后被证实为bHLH基因。接着人们又在各类脊锥动物发现更多的bHLH基因，其neurogenin（ngn)基因就是其中的一种，而ngn果蝇直系同源蛋白Tap的功能至今未知。目前对ngn基因的研究组要集中在ngn基因表达模式的检测，以及制备ngn突变体以及观察其突变表型，但对ngn基因本身的调控和被调控机制涉及甚少，因此对tap基因的功能及调控的研究将对ngn基因的相关研究具有重要的意义。一.tap基因克隆，制备相应RNAi构建PCR扩增五要素（一）引物（二）模板（三）Mg2+（四）taq聚合酶（五）四种dNTPPart1引物的获得首先我们应该清楚，我们研究的是黑腹果蝇（drosophilamelanogaster）的tap基因，

所以我们应该在thewebsiteofpubmed上找出

tap的完整基因序列。然后在thewebsiteofORFfinder上找出thesequenceofORFoftap上方为DNA序列，下方为其所对应的氨基酸。由于tap基因为bHLH模式基因，对比文献可得到该模式的基因序列。将得到的部分DNA序列放入primer3软件中得到该序列的引物Leftprimer5’tcgatacgagcagcaatcac3’

Rightprimer5’atcttcaccacttgggttgg3’正向GactagtCtcgatacgagcagcaatcacCtgatcaGagctatgctcgtcgttagtgatcttcaccacttgggttggCTAgctagcTAGtagaagtggtgaacccaaccGATcgatcgATCatgtacttcaag::::::::::5‘3‘SpeIAvrII反向atcttcaccacttgggttggGAGccatggGAGtcgatacgagcagcaatcacGCagatctCGGCagatctCGcactaacgacgagcatGAGcctaggGAGggttgggttcaccacttctacttgaagtacat::::::::::3‘5‘NheIXbaItapknockdownbyRNAiExpressedinflyRNasemachineryRNAiconstructDoublestrandedmRNAhairpinSmallinterferingRNAs(siRNA)TranscriptionTargetgenemRNADegradationNotranslationThird:RNAi构建首先在flybase网站上找了了一个适合合我们用的的vector（pWIZvector）在上面上上有四个酶酶切位点（（TheyareuniqueinpWIZ），分别为为SpeI、AvrII、NheI、XbaI,由于我们所所克隆的基基因序列无无这些酶的的酶切位点点，所以我我们应该在在引物上加加上这些酶酶的酶切位位点(PWIZvector如图）四种限制性性内切酶的的序列SpeⅠⅠAvrⅡNheⅠⅠXbaⅠⅠ引物加上酶酶切位点以以及保护碱碱基以后：引物设计共共两种：第一种：LP:GactagtCtcgatacgagcagcaatcacRP:ggatccatcttcaccacttgggttgg(??????)第二种：LP:GCtctagaGCtcgatacgagcagcaatcacRP:CTAgctagcTAGatcttcaccacttgggttggPart2.模板的获得得果蝇DNA的提取和纯纯化果蝇DNA的提取和纯纯化实验原理：使用消化缓缓冲液使DNA从细胞内释释放出来，，65度温育可以以加速DNA溶解，酚——氯仿异戊醇醇抽提可以以将蛋白质质与DNA分离，冷的的异丙醇沉沉淀DNA，70％的乙醇洗洗去DNA表面的残留留有机溶剂剂。酚-氯仿抽提法法提取组织组织匀浆水相(DNA,RNA)絮状沉淀(DNA,少量蛋白质质,RNA)DNA消化缓冲液液苯酚-氯仿离心离心离心氯仿-异戊醇5mol/LNaCl冰无水乙醇醇75%乙醇TE1.消化缓冲液液0.1mol/LNaCl1%SDS（十二烷基基磺酸钠））10mmol/LTris-HClpH8.01mmol/LEDTApH8.0阴离子去污污剂，作为为变性剂和和助溶试剂剂，它能断断裂分子内内和分子间间的氢键，，使分子去去折叠，破破坏蛋白分分子的二、、三级结构构。抑制DNA酶活性pH值适宜DNA游离至水相相，避免降降解。苯酚-氯仿（3:1，V:V）Tris-HCl饱和操作时，应将将移液管伸伸至试剂瓶瓶底部，吸吸取下层试试剂。苯酚与氯仿仿均为表面面变性剂，，能够有效效地去除水水溶液中的的蛋白质，，使其变性性后沉淀。。氯仿-异戊醇（24:1，V:V）经酚氯仿试试剂第一次次抽提后的的水相中有有残留的酚酚，由于酚酚与氯仿是是互溶的，，可用氯仿仿第二次变变性残余的的蛋白质，，同时一起起将酚带走走。加入异戊醇醇能降低分分子表面张张力，所以以能减少抽抽提过程中中的泡沫产产生。同时时异戊醇有有助于分相相，使离心心后的上层层水相，中中层变性蛋蛋白相以及及下层有机机溶剂相维维持稳定75%乙醇洗涤作用，，去除残余余的金属离离子。同时时，保护DNA完整性，避避免降解；；抑制核酸酶酶活性。TE缓冲液TE缓冲液是Tris+EDTA缓冲液，一一般用作溶溶解剂或保保持剂，主主要是调控控pH。TE缓冲液是弱弱碱性,对DNA的碱基有保保护性。DNA在TE提供的环境境中稳定性性较好,不易破坏其其完整性或或产生开环环及断裂。。包括提取取好的DNA也要放在TE缓冲液中保保存。实验材料新鲜存活的果果蝇或－20℃冻存1h的果蝇个体体5～10个。实验仪器及用用具器具：玻璃璃棒、烧杯杯、离心管管、量筒、、分析天平平、水浴锅锅、台式高高速离心机机、4℃冰箱、长玻玻璃吸管、、微量加样样器、枪头头、紫外分分析仪、琼琼脂糖电泳泳装置。药品和试剂酚（Tris饱和酚）、、氯仿、异异戊醇、十十二烷基硫硫酸钠(SDS)、Tris碱、乙二胺胺四乙酸（（EDTA）、异丙醇醇。溶液配制：消化缓冲液液：含100mM的Nacl，10mMTris.cl（PH8.0）,25mM的EDTA（PH8.0）,0.5％的SDS。TE缓冲液（PH8.0）：含10mMTris.cl（PH8.0）,1mM的EDTA（PH8.0）。电泳缓冲液液TAE：电泳缓冲液液（50×TAE）：取Tris24.2g，冰醋酸5.7ml，0.25mol/LEDTA(pH8.0)20ml，加蒸馏水水至100ml。1×TAE为配制琼脂脂糖凝胶及及其电泳的的应用缓冲冲液。0.7％琼脂糖凝胶胶的配制：称称取0.28g琼脂糖，加加入40ml1×TAE，于电炉上上加热至沸沸腾，待凝凝胶冷却至至50℃左右（手试试微烫），，加入3μlGoldViewTW荧光染料，混匀后将将胶倒入插插好梳子的的制胶板上上，冷却后后备用。实验步骤1）取6只麻醉的果果蝇（让乙乙醚挥发干干净）放入入1.5ml离心管中，，加入消化化缓冲液30μl，用200μlTip枪头迅速捣捣碎。2）补加消化缓缓冲液400μl，混匀，置置65℃温浴30分钟每10分钟摇荡一一次，以使使样品被充充分消化。。3）取出离心管管加入400μl酚，400μl氯仿：异戊戊醇（24：1）的混合物物，盖紧管管盖，上下下颠倒充分分混匀，抽抽提样品5ml,12000rpm离心5分钟。4）小心吸取上上清转移至至新的离心心管中。加加入400μl异丙醇，轻轻轻混匀3min，此时可见见白色线团团状物质出出现。5）14000rpm离心10分钟，让线线团状物质质沉到管底底或管壁，，小心倒出出液体。6）用400μl75％的乙醇洗洗涤沉淀，，12000rpm离心5min,倒掉乙醇，，倒置晾干干至乙醇味味道消失，，沉淀用50μlTE缓冲液溶解解。（此时时得到的白白色线状物物即为DNA.7)取完全溶解解后的DNA原液进行1:100稀释，即1μl原液+99μl水，混匀。。取完全溶解解后的DNA原液进行1:100稀释，即1μl原液+99μl水，混匀。。紫外分光光光度计检测测：A260=?A280=?DNA纯度鉴定A260/A280＜1.6≈1.8＞2.0酚、蛋白质质污染视为纯度较较高的DNARNA污染注意事项组织抽提前前应保存于于液氮中，，以免DNA受到破坏；；纯化时应应时刻注意意抑制核酸酸酶的污染染，使用EDTA等防止DNA降解。剧烈振荡可可使DNA断裂，故操操作时应尽尽量轻柔、、缓慢地颠颠倒混匀。。要获得高纯纯度DNA，可加入蛋蛋白酶K降解蛋白质质。DNA在260nm处有一吸收收峰，而蛋蛋白质在280nm处有吸收峰峰。当纯度度比值小于于1.6时，应考虑虑进行再次次纯化。整个实验须须接触多种种有毒、有有腐蚀性试试剂，故应应注意操作作规范安全全。Part3.PCR扩增增及及PCR产物物的的检检测测、、纯纯化化模板板的的浓浓度度应应控控制制在在100ng/100μl引物物浓浓度度应应控控制制在在0.1-0.5μmol/LTaqDNA聚合合酶酶应应控控制制在在0.5-2.5U/50μmol四种种dNTP的浓浓度度应应相相等等Mg离子子的的浓浓度度应应控控制制在在0.5-2.5mmol/L配置置成成相相应应的的PCR反应应液液。。然后后放放入入PCR仪中中扩扩增增，，最最后后将将克克隆隆的的基基因因序序列列保保存存起起来来。。★PCR扩增增★PCR检测测制胶胶配制制2%凝胶胶100ml：称取取琼琼脂脂糖糖2g于三三角角瓶瓶中中，，加加入入100ml0.5××TBE（四四溴溴乙乙烷烷））液液，，微微波波炉炉加加热热2-5min，使琼琼脂脂糖糖完完全全溶溶解解（（注注意意不不要要暴暴沸沸）），，置置室室温温等等温温度度下下降降至至60℃℃时，，加加入入终终浓浓度度0.5μg/ml的EB（溴溴化化乙乙锭锭））液液，，充充分分混混匀匀后后倒倒板板（（注注意意排排除除气气体体））。。⒉加加样样和和电电泳泳取PCR反应应液液5~10μl，加入入3μl溴酚酚兰兰液液，，充充分分混混匀匀，，加加入入凝凝胶胶加加样样孔孔中中。。电电泳泳仪仪可可用用一一般般稳稳压压可可调调中中压压电电泳泳仪仪，，电电泳泳工工作作液液为为0.5××TBE液，，接接通通电电源源，，使使样样品品由由负负极极向向正正极极移移动动。。60-100V恒压压电电泳泳约约30-60分钟钟。。⒊结果果检检测测将凝凝胶胶板板放放在在紫紫外外透透射射仪仪的的石石英英玻玻璃璃台台上上进进行行检检测测，，DNA产物物与与荧荧光光染染料料EB形成成橙橙黄黄色色荧荧光光复复合合物物。。观观察察各各泳泳道道是是否否有有橙橙黄黄色色荧荧光光带带出出现现，，并并与与扩扩增增时时所所设设的的阳阳性性对对照照比比较较，，判判断断阳阳性性或或阴阴性性结结果果。。也也可可在在电电泳泳时时以以标标准准分分子子量量作作对对照照，，判判断断其其扩扩增增片片段段是是否否与与设设计计的的大大小小相相一一致致。。★PCR纯化化利用用提提纯纯试试剂剂盒盒对对PCR产物物进进行行提提纯纯Part4.质粒粒重重组组质粒粒的的选选择择由于于要要构构建建RNAi重组组质质粒粒，，故故要要选选择择含含有有多多个个特特殊殊酶酶切切位位点点的的质质粒粒。。有红红眼眼标标记记基基因因酶切切质质粒粒的的去去磷磷酸酸化化为了了防防止止发发生生自自连连，，提提高高连连接接效效率率，，单单酶酶切切后后，，需需要要进进行行去去磷磷酸酸化化。。去磷磷酸酸方方法法如如下下：：1）微微量量离离心心管管中中加加入入下下列列反反应应液液，，定定容容至至50μμl:质粒粒DNA片段段1-20pmol10××AlkalinePhosphatasebuffer5μμlCIAP(10-30U/μμl)2μμl无菌水至50μl2）50℃反应30min；3）酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）抽提2次，氯仿/异戊醇（24：1）抽提1次；4）加0.1倍体积的3MNaAc，2.5倍体积的冷无无水乙醇，-20℃下30min-60min；5）12000rpm离心10min，弃上清液，，沉淀用70%冷乙醇200μl洗涤一次，晾晾干；6）10μlTEbuffer溶解沉淀。质粒及目的基基因酶切位点点的暴露反应体系：第一次：A：SpeIB:AvrII第二次：A：XheIB:XbaI反应条件：温度37℃，酶切1.5h琼脂糖凝胶电电泳检测酶切切结果紫外线投射仪仪观察结果UVP凝胶成像系统统记录结果A1μLB1μL10×HBuffer2μLPwizDNA10μL～12μL≤1μg无菌水6μL～4μL总体积20μL（无菌水补至总体积）质粒及目的基基因的连接将SpeI内切酶、AvrII内切酶、质粒粒放入试管1将SpeI内切酶、AvrII内切酶目的基基因放入试管管2.在37摄氏度的条件件下，酶切1.5小时。将上述两管双双酶切产物经经过纯化，在在T4DNA连接酶作用下下16℃连接过夜。同理将NheI内切酶及XbaI内切酶以同样样方法处理质质粒及目的基基因并将酶切切产物连接。。实验步骤：1、在无菌Eppendorf管中加入以下下溶液：1)10μl体积反应体系系中：取载体体50-100ng，加入一定比比例的外源DNA分子（一般线线性载体DNA分子与外源DNA分子摩尔数为为1∶1-1∶∶5），补足ddH2O至8μl。2)轻轻混匀，稍稍加离心，于于45℃水浴５分钟使使重新退火的的粘端解链，，迅速将混混合物转入冰冰浴。3)加入含ATP的10×Buffer1μl，T4DNA连接酶合适单单位，用ddH2O补至10μl。2、盖上管盖盖，充分混匀匀，台式离心心扣上离心５５秒。3、１２℃下下过夜连接反反应。4、反应结束束后于－２００℃保存。tips：1、连接反应应的温度：ＤＤＮＡ连接酶酶的最适反应应温度为３７７℃，但在此此温度下，粘粘性末端的的氢键结合很很不稳定，折折衷方法是１１２℃过夜。。重组质粒导入入大肠杆菌细细胞实验原理理把外源DNA分子导入到某某一宿主细菌菌细胞的过程程称为转化（transformation）。当细菌处处于容易吸收收外源DNA的状态即感受态时，转化最易易发生。常用的转化方方法是用CaCl2处理受体菌，，使细菌细胞胞进入敏感的的感受态。当当细菌处于冰冰冻（0℃）的CaCl2溶液中，细菌菌细胞膨胀成成球形，转化化混合物中的的DNA形成抗DNase的羧基钙磷酸酸复合物粘附附于细胞表面面，经42℃短时间热冲击击处理，促进进细胞吸收外外源DNA。在丰富培养养基上生长数数小时后，球球状细胞复原原并分裂增殖殖，被转化的的细菌中，载载体中抗抗生生素基因得到到表达，在选选择性培养基基平板上，可可选出所需的的转化子。实验材料料一）仪器与器器皿恒温振荡器，，分光光度计计，电动沉淀淀离心机，旋旋涡混合器，，恒温培养箱箱，电热恒温温水浴锅，恒恒温摇床，普普通冰箱，Eppendorf管，转液管，，平皿，涂布布棒，微量取取样器，微波波炉，三角烧烧瓶，试管，，刻度离心管管，保温瓶，，酒精灯等。。（二）菌种大肠杆菌Top10或DH5α（三）培养基基与试剂1．LB培养基：胰化化蛋白胨10g，酵母提取物物5g，NaCL10g，调pH7.5，定容至1000ml2．100mmol/LCaCl2；3．氨苄青霉素素溶液（50mg/ml）；4．质粒DNA:pcDNA3.1-p385．含Amp的LB固体培养板：：将配好的LB固体培养基高高压灭菌后冷冷却至60℃左右，加入Amp储存液，使终终浓度为50µg/ml，摇匀后铺板板。实验步骤骤（一）感受态态菌制备1．将受体大肠肠杆菌在平板板上划线，置置于恒温培养养箱中37℃培养过夜，挑挑取一个单菌菌落（直径2~3mm）接种于3mlLB试管中，37℃摇床培养（200~300r/min）过夜（约16小时），必要要时在显微镜镜下镜检菌细细胞是否形态态一致，有无无杂菌污染。。2．无菌条件下下用加样器吸吸取过夜培养养液1ml，接种于新鲜鲜的LB中（100mlLB/250ml三角瓶，接种种量按菌液浓浓度而定，一一般在1%左右），于37℃恒温摇床培养养培养2-3小时。3.分光光度计测测OD550的光密度值，，待OD值约为0.2~0.5左右时,将3ml培养液转入离离心管中，冰冰上放置20分钟，3000rpm4℃℃离心5~10分钟。4．弃上清，将将管倒置于干干滤纸上1min，吸干残留的的培养液。用用预冷的0.1mol/L的CaCl2溶液30ml轻轻悬浮细胞胞，冰上放置置15~30分钟后，3000rpm4℃℃离心10分钟。5．4℃，4000rpm离心10分钟，弃上清清，将管倒置置于干滤纸上上1min，吸干残留的的培养液，加加入含10%甘油的4ml预冷0.1mol/LCaCl2溶液，轻轻悬悬浮细胞，冰冰上放置5分钟，即成感感受态细胞悬悬液。6．感受态细胞胞分装成100μl的小份，至4℃保存备用，24-48小时内使用效效果较好。如如果暂时不用用，可再保存存于-70℃的低温温冰箱箱中。。注意事事项：：整个个过程程在冰冰上，，轻柔柔操作作。（二））大肠肠杆菌菌转化化实验步步骤：：1．从-70℃冰箱中中取出出一管管感受受态细细胞，，放置置冰上缓慢溶溶化，，放置置10min。2．分别别取2管100µl感受态态细胞胞悬液液，第第一组组为转转化实实验组组：10µµl重组质质粒DNA+100µl感受态态细胞胞；第第二组组为阴阴性对对照组组；加加入同同体积积无菌菌水+100µµl感受态态细胞胞悬液液；轻轻轻摇摇匀，，冰上上放置置30分钟。。3．将管管放入入42℃℃恒温水水浴中中90秒，迅迅速将将eppendorf管移到到冰浴浴上，，冷却却2min。4．向上上述eppendorf管中加加入0.8mlLB液体培培养基基（不不含Amp），混混匀后后37℃℃振荡培培养45~60min，使细细菌恢恢复正正常生生长状状态，，并表表达质质粒编编码的的抗生生素抗抗性基基因(Ampr)。5．将上上述菌菌液摇摇匀后后取100~200μl涂布于于含Amp的筛选选平板板上，，正面面向上上放置置半小小时，，待菌菌液完完全被被培养养基吸吸收后后倒置置培养养皿，，37℃℃培养12~16小时。即形成成菌落落。重组质质粒DNA的提取取和纯纯化基因重重组后后,需重组组质粒粒DNA的提取取要从转转化的的细菌菌中提提取重重组质质粒DNA重组质质粒DNA的提取取重组质质粒DNA的纯化化（氯氯化锂锂沉淀淀法））重组基基因的的转化化第二天天取出出培养养皿，，观察察菌落落生长长情况况，我我们会会看到到一个个个小小的白白色菌菌落，，说明明这些些菌落落，已已经被被注入入重组组的质质粒，，但我我们还还要进进一步步筛选选。将上述述菌落落分别别培养养，然然后取取出质质粒，，然后后分别别用SpeI酶，XbaI酶对其其进行行酶切切，对对其进进行电电泳观观察其其片段段长度度，与与理论论长度度相符符的既既是我我们所所要的的重组组质粒粒。将其微微注射射到果果蝇的的生殖殖细胞胞中，，然后后与野野生型型果蝇蝇杂交交，后后代表表现红红眼的的即为为所得得的tapRNAi构建品品系果果蝇。。(所选的的vector含有white基因））购买不不同的的driver品系的的果蝇蝇与制制备品品系进进行杂杂交。。用显微微镜在在杂交交产生生的后后代中中筛选选发育育异常常的果果蝇。。对发育育异常常的果果蝇分分析，，推论论tap基因可可能的的功能能。总结实实验结结果，，撰写写论文文。2.显微注注射、、筛选选出UAS品系的的果蝇蝇:1）提取取重组组的DNA，并显显微注注射到到W1118品系的的果蝇蝇卵尾尾部的的极细细胞处处，注注射后后的卵卵放在在盛有有琼脂脂培养养基的的大培培养皿皿中，，用油油覆盖盖整个个玻片片，18摄氏度度放置置72h等待孵孵化；；4.对后代代果蝇蝇发育育情况况进行行观察察、分分析，，得出出结论论，撰撰写论论文。。9、静夜四无邻邻，荒居旧业业贫。。10、雨中黄叶树，灯下白头人。。00:08:4200:08:4200:0812/28/202212:08:42AM11、以我独沈久，愧君相见频。。12月-2200:08:4200:08Dec-2228-Dec-2212、故人江海别，几度隔山川。。00:08:4200:08:4200:08Wednesday,December28,202213、乍见翻疑梦，相悲各问年。。12月-2212月-2200:08:4200:08:42December28,202214、他乡生白发，旧国见青山。。28十二月202212:08:42上午00:08:4212月-2215、比不了得就不比，得不到的就不要。。。十二月2212:08上午12月-2200:08December28,202216、行动出成果，工作出财富。。2022/12/280:08:4200:08:4228December202217、做前，能够环视四周；做时，你只能或者最好沿着以脚为起点的射线向前。。12:08:42上午12:08上午00:08:4212月-229、没有失败，只有暂时停