食品中食品卫生微生物的测定

第九章食品中食品卫生微生物的测定一、食品微生物检验的意义食品微生物检验方法为食品监测必不可少的重要组成部分。(1)它是衡量食品卫生质量的重要指标之一，也是判定被检食品能否食用的科学依据之一。(2)通过食品微生物检验，可以判断食品加工环境及食品卫生环境，能够对食品被细菌污染的程度做出正确的评价，为各项卫生管理工作提供科学依据，提供传染病和人类、动物和食物中毒的防治措施。(3)食品微生物检验是以贯彻“预防为主”的卫生方针，可以有效地防止或者减少食物中毒人畜共患病的发生，保障人民的身体健康；同时，它对提高产品质量，避免经济损失，保证出口等方面具有政治上和经济上的重要意义。第一节概述二、食品微生物检验的种类1、感官检验：通过人的感官检定，看食品的色泽、气味、口味是否正常，有无霉变和其他异物污染。2、直接镜检：包括菌体镜检和显微计数两种方法。菌体镜检是直接对送检样品进行镜检；显微计数是在显微镜下直接计算菌液中微生物数量的方法，可以直接测定受检样品的带菌量。3、培养检验：根据食品的特点和分析目的选择适宜的培养方法求的带菌量。第一节概述三.样品的采集第一节概述（一）采样的目的和意义便于食品卫生质量监督管理鉴别食品中是否存在有毒有害物质。为新产品、新资源利用、新食品化工产品、新工艺投产前进行卫生鉴定。第一节概述（二）样品的种类大样，就是一整批；中样，是从样品中各部分取得的混合样品，一般为200g；小样，也称检样，做分析用的，一般为25g。第一节概述（三）采样的步骤采样前调查→现场观察→确定采样方案→采样→样品封存→开具采样证明第一节概述（四）采样的要求1、严格遵守样品采集的操作规程。2、所采样品必须具有代表性。3、采样操作要防止污染，防止变质、损坏、丢失。4、不得加入防腐剂、固定剂等。5、样品采集和现场测定必须有二人以上参加。第一节概述（五）食品微生物检验采样方法采样原则：能采取完整包装的样品就不拆开取样，必须拆开包装取样的应按无菌操作进行取样.第一节概述1、液体样品采样方法

充分混匀后，无菌操作打开包装，用100mL无菌注射器抽取,注入无菌盛样容器.第一节概述2、半半固固体体样样品品采采样样方方法法无菌菌操操作作打打开开包包装装，，用用无无菌菌勺勺子子从从几几个个部部位位挖挖取取样样品品，，放放入入无无菌菌容容器器。。第一一节节概概述述3、固固体体样样品品采采样样方方法法大块块整整体体食食品品用用无无菌菌刀刀具具和和镊镊子子从从不不同同的的部部位位割割取取，，并并注注意意其其代代表表性性；；小块块大大包包装装食食品品应应从从不不同同部部位位的的小小块块上上切切取取样样品品，，放放入入无无菌菌容容器器。。若为为检检验验食食品品的的污污染染情情况况，，可可取取表表层层样样品品；；若若为为检检验验食食品品品品质质的的情情况况，，应应从从深深部部取取样样。。第一一节节概概述述4、冷冷冻冻食食品品采采样样方方法法大包包装装小小块块冷冷冻冻食食品品按按小小块块个个体体采采取取；；大块块冷冷冻冻食食品品可可用用无无菌菌刀刀从从不不同同部部位位削削取取或或用用无无菌菌手手锯锯从从冻冻块块上上锯锯取取样样品品，，放放入入无无菌菌容容器器。。若为为检检验验食食品品污污染染情情况况，，可可取取表表层层样样品品；；若若为为检检验验食食品品品品质质情情况况，，应应从从深深部部取取样样。。第一节节概概述5、生产产工序序监测测采样样车间用用水：：从车车间各各龙头头采样样；车间台台面、、用具具、及及加工工售货货员手手的卫卫生监监测：：用5cm2孔无菌菌采样样板和和5支无菌菌棉签签擦拭拭25cm2面积，，擦拭拭后立立即用用无菌菌剪刀刀将棉棉签头头剪入入无菌菌容器器中。。车间空空气采采样：：将5个直径径90mm的普通通琼脂脂平板板分别别置于于车间间的四四角和和中部部，打打开平平皿盖盖5min，然后后盖盖盖送检检第一节节概概述（六））采样样标签签的填填写标签主主要内内容：：编号、、样品品名称称、生生产单单位、、生产产日期期、产产品批批号、、产品品数量量、存存放条条件、、采样样时间间、采采样人人姓名名，现现场情情况。。第一节节概概述×××××××采样单单样品编编号：：━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━产品品名称称（商商品名名）______规格型型号__________注册商商标_____________生产厂厂家_______________通讯地地址__________邮政编编码□□□□□□□□□□□受检地地点_______________通讯地地址__________邮政编编码□□□□□□□□□□□采样地地点_______________采样日日期__________采样基基数______________生产日日期_______________批号号__________产品依依据标标准__________有效成成分及及含量量____________________________________________________________检验目目地________________检测项项目_____________________________采样人人仔细细阅读读以下下句子子，然然后签签字我我认真真负责责地填填写了了该样样品采采样单单，承承认以以上填填写的的合法法性，，被该采样样单位位所证证实的的样品品系按按照采采样方方法取取得的的，该该样品品具有有代表表性、、真实实性和和公正正性。。代表单单位（（章））代代表单单位（（章））签字签签字字日期年年月月日日日日期期年年月月日日备注注第一节节概概述四.样品的的送检检要求求1、要快快速运运送：：不要要超过过3小时；；2、若路路途遥遥远，，可在在1~5℃低温下下运送送；3、要注意防污污染、防散漏漏、防变质；；4、要填填写检检验申申请单单。第一节节概概述五.样品的的处理理方法法（一））液体体样品品（二））固体体样品品（三））冷冻冻样品品第一节节概概述(一)液体样样品的的处理理瓶装液液体样样品的的处理理盒装或或软塑塑料包包装样样品的的处理理第一节节概概述1.瓶装装液液体体样样品品的的处处理理用点点燃燃的的酒酒精精棉棉球球灼灼烧烧瓶瓶口口灭灭菌菌，，接接着着用用石石炭炭酸酸或或来来苏苏尔尔消消毒毒后后的的纱纱布布盖盖好好，，再再用用灭灭菌菌开开瓶瓶器器将将盖盖启启开开；；含含有有二二氧氧化化碳碳的的样样品品可可倒倒入入500mL磨口口瓶瓶内内，，口口勿勿盖盖紧紧，，覆覆盖盖一一灭灭菌菌纱纱布布，，轻轻轻轻摇摇荡荡，，待待气气体体全全部部逸逸出出后后，，取取样样25mL检验验。。第一一节节概概述述2.盒装装或或软软塑塑料料包包装装样样品品的的处处理理将其其开开口口处处用用75%酒精精棉棉擦擦拭拭消消毒毒，，用用灭灭菌菌剪剪子子剪剪开开包包装装，，覆覆盖盖上上灭灭菌菌纱纱布布或或浸浸有有消消毒毒液液的的纱纱布布在在剪剪开开部部分分，，直直接接吸吸取取样样品品25mL，或或倾倾入入另另一一灭灭菌菌容容器器中中再再取取样样25mL检验验。。第一一节节概概述述（二二））固固体体样样品品的的处处理理捣碎碎均均质质法法剪碎碎振振摇摇法法研磨磨法法整粒粒振振摇摇法法胃蠕蠕动动均均质质法法第一一节节概概述述1.捣碎碎均均质质法法将中中样样(≥≥100g)剪碎碎或或搅搅拌拌混混匀匀，，从从中中取取25g放入入带带225mL稀释释液液的的无无菌菌均均质质杯杯中中，，8000~10000r/min均质质1~2min即可可。。第一一节节概概述述2.剪碎碎振振摇摇法法将中中样样(≥≥100g)剪碎碎或或搅搅拌拌混混匀匀，，从从中中取取25g检样样进进一一步步剪剪碎碎，，放放入入带带225mL稀释释液液和和直直径径5mm左右右玻玻璃璃珠珠的的稀稀释释瓶瓶中中，，盖盖紧紧瓶瓶盖盖，，用用力力快快速速振振摇摇50次，，振振幅幅要要大大于于40cm。第一一节节概概述述3.研磨磨法法将中中样样(≥≥100g)剪碎碎或或搅搅拌拌混混匀匀，，从从中中取取25g检样样放放入入无无菌菌乳乳钵钵中中充充分分研研磨磨后后，，再再放放入入带带有有225mL无菌菌稀稀释释液液的的稀稀释释瓶瓶中中，，盖盖紧紧盖盖后后充充分分摇摇匀匀。。第一一节节概概述述4.整粒粒振振摇摇法法直接接称称取取25g整粒粒样样品品置置于于带带有有225mL稀释释液液和和直直径径5mm左右右玻玻璃璃珠珠的的稀稀释释瓶瓶中中，，盖盖紧紧瓶瓶盖盖，，用用力力快快速速振振摇摇50次，，振振幅幅要要大大于于40cm。第一一节节概概述述（三三））冷冷冻冻样样品品冷冻冻样样品品，，先先将将中中样样在在0~4℃℃下解解冻冻，，时时间间不不能能超超过过18h，或或在在45℃℃下解解冻冻，，时时间间不不能能超超过过15min。再再取取检检样样25g做稀稀释释处处理理。。第一一节节概概述述六、、食食品品卫卫生生微微生生物物检检验验指指标标一））菌菌落落总总数数二））大大肠肠菌菌群群三））致致病病性性微微生生物物第一一节节概概述述1、细细菌菌总总数数指一一定定数数量量或或面积积的的食食品品样样品品．．经经过过适适当当的的处处理理后后，，在在显显微微镜镜下下对对细细菌菌进进行行直直接接计计数数。。其其中中包包括括各各种种活活菌菌数数和和尚尚未未消消失失的的死死菌菌数数。。细细菌菌总总数数也也称称细细菌菌直直接接显显微微镜镜数数。。通通常常以以1g或1mL或1cm2样品品中中的的细细菌菌总总数数来来表表示示。。第一一节节概概述述第一一节节概概述述1）食食品品中中细细菌菌数数量量可可反反映映该该食食品品被被污污染染的的程程度度新鲜鲜的的食食品品内内部部一一般般是是没没有有或或很很少少有有细细菌菌的的，，但但由由于于外外界界污污染染情情况况不不同同，，食食品品被被细细菌菌污污染染的的多多少少就就有有所所不不同同。。食食品品中中细细菌菌数数量量越越多多，，说说明明被被污污染染的的程程度度就就越越严严重重，，越越不不新新鲜鲜，，对对人人体体健健康康威威胁胁越越大大。。相相反反，，食食品品中中菌菌数数越越少少，，说说明明该该食食品品被被污污染染的的程程度度越越轻轻，，食食品品卫卫生生质质量量越越好好，，对对人人体体健健康康影影响响也也越越小小。。第一一节节概概述述2）食食品品中中细细菌菌数数量量可可预预测测食食品品耐耐放放程程度度和和时时间间一般般讲讲，，细细菌菌数数越越少少，，食食品品耐耐放放时时间间越越长长；；相相反反，，食食品品耐耐放放时时间间就就越越短短，，例例如如用用O℃保存牛肉，菌菌落总数为103cfu／cm2时，可保存18天，而当菌落落总数增至lO5cfu／cm2时则只能保存存7天。另外，用用0℃保存鱼时，菌菌落总数为105cfu／cm2时可保存6天．而菌落总总数在103cfu／cm2时则可保存12天。第一节概述述3）食品中细菌菌数量可估测测出食品腐败败状况一般认为日常常食品的活菌菌数为104～107cfu／g。而当活菌数数达到108cfu／g则可认为处于于初期腐败阶阶段。例如，，活的家禽，，皮肤表面的的细菌数可低低到1.5×103cfu／cm2。而加工后马马上检测可达达3.5×104cfu／cm2。当菌落数为为107cfu/cm2时表示确已经经腐败，鸡肉肉的细菌数达达108cfu／cm2时可有气味并并变粘。一般讲，食品品中细菌数量量越多，则会会加速腐败变变质过程的进进程，甚至可可能引起食用用者的不良反反应。第一节概述述2、大肠菌群大肠菌群系指一群在36℃条件下能发酵酵乳糖、产酸酸、产气、需需氧和兼性厌厌氧的革兰氏氏阴性的无芽芽胞杆菌。从种类上讲，，大肠菌举包包括许多生化化及血清学特特性均很不相相同的细菌，，其中有埃希希氏菌属，枸枸椽酸菌属、、肠杆菌属和和克雷伯氏菌菌属等等．以以埃希氏菌属属为主，大肠菌群MPN（mostprobablenumber,MPN）是指在1ml(或1g)食品检样中听听含的大肠菌菌群的最近似似或最可能数数。第一节概述述大肠菌群可作为粪便污污染食品的指指标菌；1）大肠菌群主主要来源于人人及温血动物物粪便、人类类经常活动的的场所以及有有粪便污染的的地方。微微量粪便污染染不可能以化化学方法检查查出来，在食食品中大肠菌菌群的存在即即使少量也很很容易而且准准确的被检出出。2）大肠菌群可可作为肠道致致病菌污染食食品的指标菌菌第一节概述述3.致病菌食品生产是一一个时间长、、环节多的复复杂过程。总总之，与食品品有直接和间间接关系的致致病性微生物物都可能污染染食品。（以以乳制品为例例）1）能引起人类类疾病和食物物中毒的致病病性微生物：：沙门氏菌、葡葡萄球菌、链链球菌、副溶溶血性弧菌，，口蹄疫病毒毒等。2）能产生毒素素并引起食物物中毒的微生生物：肉毒梭菌、葡葡萄球菌和产产气荚膜杆菌菌，也包括一一些真菌，都都会产生毒素素。第一节概述述菌落总数测定定——菌落总数的概概念菌落总数是指指在被检样品品的单位重量量（g）、容积（ml）或表面积（（cm2）内，所含能能于某种固体体培养基上，，在一定条件件下培养后所所生成的菌落落的总数第二节菌落落总数的测定定一、设备与材材料冰箱恒温培养箱恒温水浴锅均质器或灭菌菌乳钵药物天平菌落计数器放大镜灭菌吸管…….第二节菌落落总数的测定定二、培养基和和试剂营养琼脂培养养基磷酸缓冲液0.85%灭菌生理盐水水75%乙醇第二节菌落落总数的测定定三、培养程序序第二节菌落落总数的测定定四、操作步骤骤1.检样稀释及培培养（1）以无菌操作作，将检样25g（或25mL）剪碎以后，，放于含有225mL灭菌生理盐水水或其他稀释释液的灭菌玻玻璃瓶内（瓶瓶内预先置适适当数量的玻玻璃珠）或灭灭菌乳钵内，，经充分振摇摇或研磨做成成1：10的均匀稀释液液。固体检样在加加入稀释液后后，最好置灭灭菌均质器中中以8000r/min-100000r/min的速度处理1min，做成1：10的均匀稀释液液。第二节菌落落总数的测定定（2）用1mL灭菌吸管吸取取1：10稀释液1mL，沿管壁徐徐徐注入含有9mL灭菌生理盐水水或其他稀释释的试管内（（注意吸管尖尖端不要触及及管内稀释液液，下同），，振摇试管混混合均匀，做做成1：100的稀释液。（3）另取1mL的灭菌吸管，，按上项操作作顺序作10倍递增稀释液液，如此每递递增稀释一次次，即换用1支1mL灭菌吸管。（4）根据食品卫卫生标准要求求或对检样污污染情况的估估计，选择2-3个适宜稀释度度，分别在作作10倍递增稀释的的同时，即以以吸取该稀释释度的吸管移移1mL稀释液于灭菌菌平皿内，每每个稀释度作作两个平皿。。第二节菌落落总数的测定定（5）稀释液移入入平皿后，应应及时将凉至至46℃营养琼脂培养养基[可放置在（（（46±1）℃）水浴锅锅内保温]注入平皿15mL-20mL，并转动平皿皿使混合均匀匀，同时将营营养琼脂培养养基倾入加有有1mL稀释液（不含含样品）的灭灭菌平皿内作作空白对照。。（6）等琼脂凝固固后，翻转平平板，置（36±1）℃恒温箱内内培养（48±2）h取出，计算平平板内菌落数数目乘以倍数数，即得1g（1mL）样品所含菌菌落总数。第二节菌落落总数的测定定样品稀释程序序第二节菌落落总数的测定定2.菌落计数方法法做平板菌落计计数时，可用用肉眼观查，，必要时用放放大镜检查，，以防遗漏。。在记下各平平板的菌落数数后，求出同同稀释度的各各平板平均菌菌落总数第二节菌落落总数的测定定3.菌落计数的报报告①平板菌落数数的选择选取菌落数在在30～300之间的平板作作为菌落总数数测定标准。。一个稀释度度使用两个平平板，应采用用两个平板平平均数，其中中一个平板有有较大片状菌菌落生长时，，则不宜采用用，而应以无无片状菌落生生长的平板作作为该稀释度度的菌落数，，若片状菌落落不到平板的的一半，而其其余的一半中中菌落分布又又很均匀，即即可计算半个个平板后乘2以代表全皿菌菌落数。平皿皿内如有链状状菌落生长时时（菌落之间间无明显界线线），若仅有有一条链，可可视为一个菌菌落数；如果果有不同来源源的几条链，，则应将每条条链作为一个个菌落计。第二节菌落落总数的测定定②稀释度的选选择a.应选择平均菌菌落数在30～300之间的稀释度度，乘以稀释释倍数报告之之。b.若有两上稀释释度，其生长长的菌落数均均在30～300之间，则视两两者之比如何何来决定。若若其比值小于于或等于2，应报告其平平均数；若大大于2则报告其中较较小的数字。。c.若所有稀释度度平均菌落数数均大于300，则应按稀释释度最高的平平均菌落数乘乘以稀释倍数数报告之。d.若所有稀释度度的平均菌落落数均小于30，则应按稀释释度最低的平平均菌落数乘乘以稀释倍数数报告之。e.若所有稀释度度均无菌落生生长，则以小小于1乘以最低稀释释倍数报告之之。第二节菌落落总数的测定定f.若所有稀释度度的平均菌落落数均不在30～300之间，其中一一部分大于300或小于30时，则以最接接近30或300的平均菌落数数乘以稀释倍倍数报告之。。③菌落数的报报告菌落数在100以内时，按其其实有数报告告，大于100时，采用二位位有效数字，，在二位有效效数字后面的的数值，以四四舍五入方法法计算。为了了缩短数字后后面的零数，，也可用10的指数来表示示。第二节菌落落总数的测定定第二节菌落落总数的测定定第二节菌落落总数的测定定大肠菌群系指一群在36℃条件下能发酵酵乳糖、产酸酸、产气、需需氧和兼性厌厌氧的革兰氏氏阴性的无芽芽胞杆菌。大肠菌群数MPN（mostprobablenumber,MPN）是指在100ml(g)食品检样中听听含的大肠菌菌群的最近似似或最可能数数。第三节大肠肠菌群的测定定一、乳糖发酵酵法将待检样品接接种于乳糖胆胆盐发酵管内内，接种量在在1mL以上者，用双双料乳糖胆盐盐发酵管；1mL及1mL以下者，用单单料乳糖胆盐盐发酵管，每每一稀释度接接种3管，置36+1℃温箱内，培养养24+2小时，如所有有乳糖胆盐发发酵管均不产产气，则可报报告为大肠菌菌群阴性。如如有产气者，，按下列程序序进行。第三节大肠肠菌群的测定定设备和材料：：恒温培养箱（（36℃±1℃℃）、恒温水浴浴锅（46℃±1℃℃）、电子天天平、显微镜镜（10×~100×）、灭菌培养养皿、灭菌试试管。培养基及试剂剂：乳糖胆盐发酵酵管、乳糖发发酵管、伊红红美蓝琼脂平平板（EMB）、0.85%灭菌生理盐水水、革兰氏染染色液。第三节大肠肠菌群的测定定第三节大肠肠菌群的测定定1.检验程序2.操作步骤(1)检样稀释a．以无菌操作作将检样25克(或25毫升)放于含有225毫升灭菌生理理盐水或其他他稀释液的灭灭菌玻璃瓶内内(瓶内预置适当当数量的玻璃璃珠)或灭菌乳钵内内，经充分振振摇或研磨作作成1∶10的均匀稀释液液。固体检样样最好用均质质器，以8000～10000r／分钟的速度度处理1分钟作成1∶10的均匀稀释液液．b．用1毫升灭菌吸管管吸取1∶10稀释液1毫升，注入含含有9毫升灭菌生理理盐水或其他他稀释液的试试管内，振摇摇试管混匀，，作成l∶100的稀释液。c．另取1毫升灭菌吸管管，按上项操操作依次作10倍递增稀释液液，每递增稀稀释—次，换用—支1毫升灭菌吸管管。d．根据食品卫卫生标准要求求或对检样污污染情况的估估计，选择三三个稀释度，，每个稀释度度接种3管。第三节大肠肠菌群的测定定(2)乳糖发酵试验验将待检样品接接种于乳糖胆胆盐发酵管内内，接种量在在1毫升以上者，，用双料乳糖糖胆盐发酵管管；1毫升及1毫升以下者，，用单料乳糖糖胆盐发酵管管，每一稀释释度接种3管，置36士1℃温箱内，培养养48士2小时，如所有有乳糖胆盐发发酵管都不产产气，则可报报告大肠菌群群阴性，如有有产气者，则则按下列程序序进行。第三节大肠肠菌群的测定定（3）分离培养将产气的发酵酵管分别转种种到伊红美兰兰琼脂平板上上，置36±1℃温箱内培养18—24小时，然后取取出，观察菌菌落形态，并并作革兰氏染染色和证实试试验。（4）证实试验在上述平板上上，挑取可疑疑大肠菌群菌菌落1—2个进行革兰氏氏染色。同时时接种乳糖发发酵管，置置36±1℃温箱内培养24+2小时，观察产产气情况，凡凡乳糖发酵管管产气、革兰兰氏染色为阴阴性的无芽胞胞杆菌，即可可报告为大肠肠菌群阳性。。（5）报告根据证实为大大肠群阳性的的管数，查MPN的检索表，报报告每100mL（g）大肠菌群的的最近似数(MPN)。第三节大肠肠菌群的测定定第三节大肠肠菌群的测定定二、ＬＴＳＥＥ快速检验法法１．原理不同的细菌以以不同途径分分解糖类，在在其代谢过程程中均能产生生丙酮酸及及转变为各种种酸类，大肠肠菌群能分解解乳糖，由于于具有甲酸解解氢酶作用用于甲酸，产产生氢和二氧氧化碳气体，，因此气体的的产生是在产产酸的同时进进一步分解解酸而形成的的。根据这个个原理，将样样品接种到LTSEBOth内15h，看结果有有无产气现象象，然后加氧氧化酶试验和和涂片革兰氏氏染色镜检结结果综合判判断是否有大大肠菌群的存存在。第三节大肠肠菌群的测定定仪器与材料高压蒸气灭菌菌器干干热气菌箱恒恒温箱箱天平平均质器器显微微镜冰冰箱接种种环载载玻片试试管、童汉氏氏小管、刻度度吸管等，置置于干热灭菌菌箱中160℃℃灭菌菌2h。培养养基基和和试试剂剂LTSE培养养基基肉肉汤汤（（1号））氧氧化化酶酶试试剂剂革革兰兰氏氏染染液液本方方法法中中，，除除化化学学纯纯（（BR）生生化化试试剂剂外外，，所所用用的的化化学学试试剂剂为为分分析析纯纯（（AR）；；试试剂剂用用水水为为蒸蒸馏馏水水。。第三三节节大大肠肠菌菌群群的的测测定定2.操作作步步骤骤第三三节节大大肠肠菌菌群群的的测测定定一、、沙沙门门氏氏菌菌检检验验1.沙门门氏氏菌菌及及其其食食品品卫卫生生学学意意义义沙门门氏氏菌菌胃胃肠肠炎炎是是由由除除伤伤寒寒沙沙门门氏氏菌菌外外任任何何一一型型沙沙门门氏氏菌菌而而所所致致，，潜潜伏伏期期一一般般6-72小时时，，主主要要症症状状为为恶恶心心、、呕呕吐吐、、腹腹绞绞痛痛、、腹腹泻泻、、发发热热寒寒颤颤头头痛痛。。病病程程一一般般1～2天或或更更长长。。感感染染剂剂量量为为15～20个菌菌，，死死亡亡率率达达1～4%。最最易易感感群群体体是是年年幼幼儿儿童童、、虚虚弱弱者者、、年年长长老老人人、、免免疫疫缺缺陷陷者者等等。。污染染源源主主要要是是人人和和家家畜畜的的粪粪便便，，沙沙门门氏氏菌菌常常存存在在于于动动物物中中，，特特别别是是禽禽类类和和猪猪。。在在许许多多环环境境中中也也有有存存在在。。从从水水，，土土壤壤，，昆昆虫虫中中，，从从工工厂厂和和厨厨房房设设施施的的表表面面和和动动物物粪粪便便中中已已发发现现该该类类细细菌菌。。它它们们可可以以存存在在于于多多类类食食品品中中，，包包括括生生肉肉，，禽禽，，奶奶制制品品和和蛋蛋，，鱼鱼，，虾虾和和田田鸡鸡腿腿，，酵酵母母，，椰椰子子，，酱酱油油和和沙沙拉拉调调料料，，蛋蛋糕糕粉粉，，奶奶油油夹夹心心甜甜点点，，顶顶端端配配料料，，干干明明胶胶，，花花生生露露，，橙橙汁汁，，可可可可和和巧巧克克力力第四节常见见致病菌的测测定2.沙门氏菌检验验流程检样前增菌法直接增菌法冻肉、蛋品、、乳品及其它它加工食品鲜肉、鲜蛋、、鲜乳及其它它未经加工的的食品25g＋BP225mL25g＋灭菌生理盐盐水25mL制成检样均质质液（36±1）℃一一般4h，干蛋品18～24h10mL＋MM(或TTB)100mL10mL＋SC100mL检样均质液的的半量＋MM(或TTB)100mL检样均质液的的半量＋SC100mL42℃18～24h（36±1）℃18～24h42℃℃18～24h（36±1）℃18～24hBSDHL(或HE、WS、SS)（36±1）℃40～48h（36±1）℃18～24h挑取可疑菌落落TSI（斜面、底层层、产气、H2S）、蛋白胨水水（靛基质））、尿素（pH7.2）、KCN、赖氨酸H2S＋靛基质－H2S＋靛基质＋H2S－靛基质－非如左述的尿素－KCN－赖氨酸＋尿素－KCN－赖氨酸＋尿素－KCN－赖氨酸＋/－各种反应结果果甘露醇、山梨梨醇ONPG沙门氏菌血清清学实验沙门氏菌血清清学实验非沙门氏菌非沙门氏菌报告3.操作步骤1）前增菌和增增菌冻肉、蛋品、、乳品及其他他加工食品均均应经过前增增菌。以无菌菌操作取25g（mL），加在装有有225mL缓冲蛋白胨水水的500mL广口瓶内。固固体食品可先先应用均质器器以8000～10000r/min打碎1min，或用乳钵加加灭菌砂磨碎碎，粉状食品品用灭菌匙或或玻棒研磨使使乳化，于36℃±1℃℃培养4h(干蛋品培养18h～24h)，移取10mL，转种于100mL氯化镁孔雀绿绿增菌液或四四硫酸钠煌绿绿增菌液内，，于42℃培养18h～24h。同时，另取取10mL，转种于100mL亚硒酸盐胱氨氨酸增菌液内内，于36℃±1℃℃培养18h～24h。鲜肉、鲜蛋、、鲜乳或其他他未经加工的的食品不必经经过前增菌。。各取25g(25mL)加入灭菌生理理盐水25mL，按前法做成成检样匀液；；取25mL，接种于100mL氯化镁孔雀绿绿增菌液或四四硫磺酸钠煌煌绿增菌液内内，于42℃培养24h；另取25mL接种于100mL亚硒酸盐胱氨氨酸增菌液内内，于36℃±1℃℃培养18h～24h。第四节常见见致病菌的测测定2）分离取增菌液1环，划线接种种于一个亚硫硫酸铋琼脂平平板和一个DHL琼脂平板(或HE琼脂平板、WS或SS琼脂平板)。两种增菌液液可同时划线线接种在同一一个平板上。。于36℃±1℃℃分别培养18h～24h(DHL、HE、WS、SS)或40h～48h(BS)，观察各个平平板上生长的的菌落。第四节常见见致病菌的测测定沙门氏菌属各各群在各种选选择性琼脂平平板上的菌落落特征选择性琼脂平板沙门氏菌Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ沙门氏菌Ⅲ（即亚利桑那菌）

BS琼脂产硫化氢菌落为黑色带有金属光泽，棕褐色或灰色，菌落周围培养基可呈黑色或棕色；有些菌株不产生硫化氢，形成灰绿色的菌落，周围培养基不变黑色带有金属光泽

DHL琼脂无色半透明，产硫化氢菌落中心带黑色或几乎全黑色乳糖迟缓阳性或阴性的菌株与亚属Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ相同；乳糖阳性的菌株为粉红色，中心带黑色

HE琼脂

WS琼脂蓝绿色或蓝色；多数菌株产硫化氢，菌落中心黑色或几乎全黑色乳糖阳性的菌株为黄色，中心黑色或几乎全黑色；乳糖迟缓阳性或阴性的菌株为蓝绿色或蓝色，中心黑色或几乎全黑色

SS琼脂无色半透明，产硫化氢菌株，有的菌落中心带黑色，但不如以上培养基明显乳糖迟缓阳性或阴性的菌株与亚属Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ相同；乳糖阳性的菌株为粉红色，中心黑色，但中心无黑色形成时与大肠埃希氏菌不能区别第四节常见见致病菌的测测定3）生化试验自选择性琼脂脂平板上直接接挑取数个可可疑菌落，分分别接种三糖糖铁琼脂、蛋蛋白陈水(供做靛基质试试验)、尿素琼脂(pH7.2)、氰化钾(KCN)培养基和赖氨氨酸脱竣酶试试验培养基及及对照培养基基各1管，于36℃±1℃℃培养18h～24h，必要时可延延长至48h，按生化反应应初步鉴定表表判定结果。。按反应序号号分类，沙门门氏菌属的结结果应属于A1、A2和B1，其他5种反应结果均均可以排除。。第四节常见见致病菌的测测定肠杆菌科各属属在三糖铁琼琼脂内的反应应结果斜面底层产气硫化氢可能的菌属和种－＋＋/－＋沙门氏菌属、弗劳地氏柠檬酸杆菌、变形杆菌属、缓慢爱德华氏菌＋＋＋/－＋沙门氏菌Ⅲ、弗劳地氏柠檬酸杆菌、普通变形杆菌－＋＋－沙门氏菌属、大肠埃希氏菌、蜂窝哈夫尼亚菌、摩根氏菌，普罗菲登斯菌属－＋－－伤寒沙门氏菌，鸡沙门氏菌、志贺氏菌属、大肠埃希氏菌、蜂窝哈夫尼亚菌、摩根氏菌，普罗菲登斯菌属＋＋＋/－－大肠埃希氏菌、肠杆菌属、克雷伯氏菌属、沙雷氏菌属、弗劳地氏柠檬酸杆菌注：＋阳性；－阴性；＋/－多数阳性，少数阴性第四节常见见致病菌的测测定肠杆菌科各属属生化反应初初步鉴别表反应序号硫化氢（H2S）靛基质pH7.2尿素氰化钾（KCN）赖氨酸脱羧酶判定结果A1＋－－－＋沙门氏菌属A2＋＋－－＋沙门氏菌属（少见）缓慢爱德华氏菌A3＋－＋＋－弗劳地氏柠檬酸杆菌、奇异变形杆菌A4＋＋＋＋－普通变形杆菌B1－－－－－－－－＋－沙门氏菌属、大肠埃希氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌大肠埃希氏菌、志贺氏菌属B2－－＋＋－－－＋－大肠埃希氏菌大肠埃希氏菌、志贺氏菌属B3－－－－＋/－＋＋＋＋－克雷伯氏菌族各属阴沟肠杆菌、弗劳地氏柠檬酸杆菌B4－＋＋/－＋－摩根氏菌，普罗菲登斯菌属注1：三糖铁琼脂底层均产酸，不产气者可排除；斜面产酸与产气与否均不限。注2：KCN和赖氨酸可选作其中一项，但不能判定结果时，仍需补做另一项。注3：＋表示阳性；－表示阴性；＋/－表示多数阳性，少数阴性。第四节常见见致病菌的测测定沙门氏菌检验验——几点注意冷冻样品解冻冻需在45℃以下，有自动动调温器自控控的水浴锅内内不断搅拌进进行15min或在2-8℃，18小时内软化。。为保证检验的的准确性，必必须在选择性性培养基上挑挑取足够数量量的菌落进行行生化和血清清学鉴定。进行生化反应应时，应以纯纯培养物进行行试验，如出出现血清学阳阳性，而生化化反应特征不不符合时，应应对接种物进进行纯化，用用纯化后的培培养物重新进进行生化试验验。测试中应同时时接种阳性对对照菌株。第四节常见见致病菌的测测定二、志贺氏菌菌检验1.志贺氏菌及其其食品卫生学学意义志贺式菌属的的细菌通称为为痢疾杆菌，，是细菌性痢痢疾的病原菌菌。临床上能能引起痢疾症症状的病原微微生物很多，，如志贺氏菌菌属、沙门氏氏菌属、变形形杆菌属、艾艾希氏菌属等等，还有阿米米巴原虫、鞭鞭毛虫及病毒毒等均可引起起人类痢疾，，其中以志贺贺氏菌引起的的细菌性痢疾疾最为常见。。人类对志贺贺氏菌的易感感性较高，所所以在食物和和饮用水的卫卫生检验时，，常以是否含含有志贺氏菌菌作为指标。。志贺氏菌属是是由四个亚群群组成，即A、B、C、D四个亚群。第四节常见见致病菌的测测定2.检验程序采样↓样品处理↓选择性增菌↓选择性平板划划分↓生化实验↓镜检↓结果报告第四节常见见致病菌的测测定3.操作步骤1）增菌称取检样25g，加入装有225mLGN增菌液的500mL广口瓶内，固固体食品用均均质器以8000～10000r/min打碎1min，或用乳钵加加灭菌砂磨碎碎，粉状食品品用金属匙或或玻璃棒研磨磨使其乳化，，于36℃培养6～8h。培养时间视视细菌生长情情况而定，当当培养液出现现轻微混浊时时即应中止培培养。第四节常见见致病菌的测测定2）分离和初步步生化试验A.取增菌液1环，划线接种种于HE琼脂平极或SS琼脂平板1个；另取1环划线接种于于麦康凯琼脂脂平板或伊红红美蓝琼脂平平板1个，于36℃培养18～24h，志贺氏菌在在这些培养基基上呈现无色色透明不发酵酵乳糖的菌落落。B.挑取平板上的的可疑菌落，，接种三糖铁铁琼脂和葡萄萄糖半固体各各1管。一般应多多挑几个菌落落，以防遗漏漏，经36℃培养18～24h，分别观察结结果。第四节常见见致病菌的测测定C.述培养物可以以弃去：a.在三糖铁琼脂脂斜面上呈蔓蔓延生长的培培养物；b.在18～24h内发酵乳乳糖、蔗蔗糖的培培养物；；c.不分解葡葡萄糖和和只生长长在半固固体表面面的培养养物；d.产气的培培养物；；e.有动力的的培养物物；f.产生硫化化氢的培培养物。。D.凡是乳糖糖、蔗糖糖不发酵酵，葡萄萄糖产酸酸不产气气(福氏志贺贺氏菌6型可产生生少量气气体)，无动力力的菌株株，可做做血清学学分型和和进一步步的生化化试验。。第四节常常见致致病菌的的测定3)血清学分分型和进进一步的的生化试试验A.血清学分分型挑取三糖糖铁琼脂脂上的培培养物，，做玻片片凝集试试验。先先用4种志贺氏氏菌多价价血清检检查，如如果由于于K抗原的存存在而不不出现凝凝集，应应将菌液液煮沸后后再检查查；如果果呈现凝凝集，则则用A1、A2、B群多价和和D群血清分分别试验验。如系系B群福氏志志贺氏菌菌，则用用群和型型因子血血清分别别检查。。福氏志志贺氏菌菌各型和和亚型的的型和群群抗原见见表1。可先用用群因子子血清检检查，再再根据群群因子血血清出现现凝集的的结果，，依次选选用型因因子血清清检查。。4种志贺氏氏菌多价价血清不不凝集的的菌株，，可用鲍鲍氏多价价1、2、3分别检查查，并进进一步用用1～15各型因子子血清检检查。如如果鲍氏氏多价血血清不凝凝集，可可用痢疾疾志贺氏氏菌3～12型多价血血清及各各型因子子血清检检查。第四节常常见致致病菌的的测定B.进一步的的生化试试验在做血清清学分型型的同时时，应做做进一步步的生化化试验，，即：葡葡萄糖铵铵，西蒙蒙氏柠檬檬酸盐，，赖氨酸酸和鸟氨氨酸脱羧羧酶，pH7.2尿素，KCN生长，以以及水杨杨昔和七七叶昔的的分解。。除宋内内氏菌和和鲍氏13型为乌氨氨酸阳性性外，志志贺氏菌菌属的培培养物均均为阴性性结果。。必要时时还应做做革兰氏氏染色检检查和氧氧化酶试试验，应应为氧化化酶阴性性的革兰兰氏阴性性杆菌。。生化反反应不符符合的菌菌株，即即使能与与某种志志贺氏菌菌分型血血清发生生凝集，，仍不得得判定为为志贺氏氏菌属的的培养物物。已判定为为志贺氏氏菌属的的培养物物，应进进一步做做5%乳糖发酵酵，甘露露醇、棉棉子糖和和甘油的的发酵和和靛基质质试验。。志贺氏氏菌属4个生化群群的培养养物，应应符合该该群的生生化特性性。但福福氏6型的生化化特性与与A群或C群相似，，见表2。4)结果报告告：综合合生化和和血清学学的试验验结果判判定菌型型并作出出报告。。第四节常常见致致病菌的的测定三、病原原性大肠肠埃希氏氏菌检验验大肠埃希希氏菌，，俗称大大肠杆菌菌，是Escherich氏在1885年年发现的的，在相相当长的的一段时时期内，，一直被被当作正正常肠道道菌群的的组成部部分，认认为是非非致病菌菌。直到20世纪中中叶，才才认识到到一些特特殊血清清型的大大肠杆菌菌对人和和动物有有致病性性，尤其其对婴儿儿和幼畜畜（禽）），常引引起严重重腹泻和和败血症症。随着着大型集集约化养养畜（禽禽）业的的发展，，病原性性大肠杆杆菌对畜畜牧业所所造成的的损失已已日益明明显。第四节常常见致致病菌的的测定检验程序序第四节常常见致致病菌的的测定操作步骤骤1）增菌2）分离3)生化试验验4）血清学学实验5）肠毒素素实验第四节常常见致致病菌的的测定四、肉毒毒梭菌的的检验肉毒梭菌菌广泛存存在于自自然界，，引起中中毒的食食品有腊腊肠、火火腿、鱼鱼及鱼制制品和罐罐头食品品等。在在美国以以罐头发发生中毒毒较多，，日本以以鱼制品品较多，，在我国国主要以以发酵食食品为主主，如臭臭豆腐、、豆瓣酱酱、面酱酱、豆豉豉等。检检验食品品，特别别是不经经加热处处理而直直接食用用的食品品中有无无肉毒毒毒素或肉肉毒梭菌菌（例如如罐头等等密封性性保存的的食品）），至为为重要。。肉肉毒梭菌菌为专性性厌氧的的革兰氏氏阳性杆杆菌，芽芽孢卵圆圆形、近近端位，，在庖肉肉培养基基中生长长时，混混浊、产产气、发发臭、能能消化肉肉渣。肉肉毒毒梭菌按按其所产产毒素的的抗原特特异性分分为A、B、C、D、E、F、G等七个型型。除G型菌之外外，其它它各型菌菌分布相相当广泛泛。我国国各地发发生的肉肉毒中毒毒主要是是A型和B型菌。E型和C型菌也发发现过肉肉毒中毒毒。至于于D型和F型菌，我我国尚未未见到由由此而发发生的肉肉品中毒毒事件。。肉肉毒梭菌菌检验目目标主要要是毒素素，不论论食品中中的肉毒毒毒素检检验还是是肉毒梭梭菌检验验，均以以毒素的的检测及及定型试试验为判判定的主主要依据据。第四节常常见致致病菌的的测定第四节常常见致致病菌的的测定肉毒梭菌菌的检验验程序五、葡萄萄球菌的的检验葡萄球菌菌（Staphylococcus)是微球菌菌科的一一个属，，在自然然界分布布极广，，空气、、土壤、、水、饲饲料、食食品(剩剩饭、糕糕点、牛牛奶、肉肉品等)以及人人和动物物的体表表粘膜等等处均有有存在，，大部分分是不致致病的腐腐物寄生生菌，也也有一些些致病的的球菌。。葡萄球菌菌分为金金黄色葡葡萄球菌菌、表皮皮葡萄球球菌、腐腐生葡萄萄球菌。。其中金金黄色葡葡萄球菌菌(staphyaureus)为致病菌菌、表皮皮葡萄球球菌偶尔尔致病（（staphyepidermidis)、腐生葡萄萄球菌（（staphysaprophyticus)一般为非非致病菌菌。金黄色葡葡萄球菌菌是葡萄球球菌属一一个种。。革兰氏氏阳性球球菌，呈呈葡萄串串状排列列，直径径为0.5~1μm，无芽孢孢、无鞭鞭毛、无无荚膜。。在普通通肉汤培培养基上上，形成成圆形、、凸起、、边缘整整齐、表表面光滑滑的菌落落，菌落落色素不不稳定，，但多数数为金黄黄色。需需氧或兼兼性厌氧氧；最适适生长温温度为30～37℃；最适生生长pH为6~7。耐盐性性强，能能在含7％～15％氯化钠钠的培养养基中生生长。对对氯化汞汞、新霉霉素、多多粘菌素素具有很很强的抗抗性，多多数产肠肠毒素的的菌株在在血琼脂脂平板上上能形成成溶血圈圈，并能能产生血血浆凝固固酶，这这些是鉴鉴定致病病性金黄黄色葡萄萄球菌的的重要指指标。金黄色葡葡萄球菌菌流行病学学及致病病性第四节常常见致致病菌的的测定葡萄球菌菌的检验验程序第四节常常见致致病菌的的测定六、溶血血性链球球菌的检检验一般而言言，溶血血性链球球菌常通通过以下下途径污污染食品品：1、食品加加工或销销售人员员口腔、、鼻腔、、手、面面部有化化脓性炎炎症时造造成食品品的污染染；2、食品在在加工前前就已带带菌、奶奶牛患化化脓性乳乳腺炎或或畜禽局局部化脓脓时，其其奶和肉肉尸某些些部位污污染。3、熟食制制品因包包装不善善而使食食品受到到污染。。溶血性链链球菌常常可引起起皮肤、、皮下组组织的化化脓性炎炎症、呼呼吸道感感染、流流行性咽咽炎的爆爆发性流流行以及及新生儿儿败血症症、细菌菌性心内内膜炎、、猩红热热和风湿湿热、肾肾小球肾肾炎等变变态反应应。第四节常常见致致病菌的的测定第四节常常见致致病菌的的测定溶血性链链球菌的的检验程程序（一）实实验内容容样品处理理→增菌菌培养→→分离培培养→纯化培养养→生化化鉴定→→报告（二）实实验过程程第四节常常见致致病菌的的测定第一天前前半天预预先准备备并灭菌菌的器材材规格名称称数数量1、500mL广口瓶2个2、13×100mm试管7支3、10mL移液管1支4、5mL移液管3支5、1mL移液管12支6、直径为为90mm平皿28套7、250mL量筒1支第一天样样品品处理和和增菌培培养第四节常常见致致病菌的的测定第一天后后半天1、样品处处理无菌操作作称取检检样25g（mL)，加入装装有225mL灭菌生理理盐水的的500mL广口瓶内内，固体体食品用用均质器器以8000-10000r/min打碎1min，制成混混悬液。。2、增菌培培养吸取5mL混悬液接接种至50mL葡萄糖肉肉浸液肉肉汤（如如检样污污染严重重，可同同时接种种5mL至匹克氏氏肉汤）），36±1℃培养24h。3、分离培培养混悬液直直接划线线于血平平板36±1℃培养24h。第四节常常见致致病菌的的测定第二天接接种种平板进进行分离离培养从肉汤中中接种血血平板，，36±1℃培养24h。第三天分分纯培养养从分离培培养的血血平板上上，挑起起乙型溶溶血圆形形突起的的细小菌菌落，在在血平板板上分纯纯，36±1℃培养24h。血平板上上菌落灰灰白色，，半透明明或不透透明，表表面光滑滑，有乳乳光，直直径约0.5mm~0.75mm，为圆形形突起的的细小菌菌落，乙乙型溶血血链球菌菌。周围围有2mm~4mm界限分明明，无色色透明的的溶血圈圈。第四节常常见致致病菌的的测定第四节常常见致致病菌的的测定第四天鉴鉴定1、革兰氏氏染色，，阳性，，G+链状排列列，符合合者可做做生化鉴鉴定。2、生化鉴鉴定（1）链激酶酶试验（（溶纤维维蛋白酶酶试验））吸取草酸酸钾血浆浆0.2mL，加0.8mL灭菌生理理盐水，，混匀，，再加入入链球菌菌18-24h36±1℃肉浸液肉肉汤培养养物0.5mL及0.25%氯化钙0.25mL，混匀，，置于36±1℃水浴10min,血浆混合合物自行行凝固，，观察凝凝块重新新完全溶溶解的时时间，完完全溶解解为阳性性，如24h后不溶解解即为阴阴性。同同时用肉肉浸液肉肉汤做阴阴性对照照，用已已知的链链激酶阳阳性的菌菌株做阳阳性对照照。第四节常常见致致病菌的的测定（2）杆菌肽肽敏感试试验将分纯的的乙型溶溶血性链链球菌接接种血平平板，在在划线处处贴附杆杆菌肽纸纸片，36℃，18h，出现抑抑菌带为为阳性，，（可推推测为乙乙型溶血血性链球球菌）。。四、、报报告告根据据培培养养后后的的形形态态，，菌菌落落特特征征及及生生化化试试验验结结果果进进行行报报告告。。第四四节节常常见见致致病病菌菌的的测测定定第五五节节真真菌菌学学检检验验一、、霉霉菌菌和和酵酵母母计计数数1设备备和和材材料料1．1温箱箱：：25～28℃℃。1．2振荡荡器器。。1．3平天天。。1．4显微微镜镜。。1．5玻塞塞三三角角瓶瓶：：300mL。1．6试管管：：15mm××150mm。1．7平皿皿：：直直径径9cm。第五五节节真真菌菌学学检检验验1．8吸管管：：1mL及10mL。1．9酒精精灯灯。。1．10载物物玻玻片片。。1．11盖玻玻片片。。1．12广口口瓶瓶。。1．13牛皮皮纸纸袋袋：：121℃℃灭菌菌20min。1．14金属属勺勺、、刀刀等等。。1．15试管管架架。。1．16接种种针针。。1．17橡皮皮乳乳头头。。第五五节节真真菌菌学学检检验验2培养养基基和和试试剂剂2．1马铃铃薯薯-葡萄萄糖糖琼琼脂脂培培养养基基，，附附加加抗抗菌菌素素，，按按GB4789.28中4.79规定定。。2．2孟加加拉拉红红培培养养基基：：按按GB4789.28中4.81规定定。。2．3高盐盐察察氏氏培培养养基基：：按按GB4789.28中4.78规定定。。2．4灭菌菌蒸蒸馏馏水水。。2．5乙醇醇。。第五五节节真真菌菌学学检检验验3、检检验验程程序序第五五节节真真菌菌学学检检验验4操作作步步骤骤4．1采样样：：取取样样时时须须特特别别注注意意样样品品的的代代表表性性和和避避免免采采样样时时的的污污染染。。首首先先准准备备好好灭灭菌菌容容器器和和采采样样工工具具，，如如灭灭菌菌牛牛皮皮纸纸袋袋或或广广口口瓶瓶，，金金属属刀刀或或勺勺等等。。在在卫卫生生学学调调查查基基础础上上，，采采取取有有代代表表性性的的样样品品。。样样品品采采集集后后应应尽尽快快检检验验，，否否则则应应将将样样品品放放在在低低温温干干燥燥处处。。粮食食（（包包括括粮粮库库贮贮粮粮，，粮粮店店或或家家庭庭小小量量存存粮粮））样样品品的的采采集集，，可可根根据据粮粮囤囤或或粮粮垛垛的的大大小小和和类类型型，，分分层层定定点点取取样样，，一一般般可可分分三三层层五五点点，，或或分分层层随随机机采采取取不不同同点点的的样样品品，，充充分分混混合合后后，，取取500g左右右送送检检。。小小量量存存粮粮可可使使用用金金属属小小勺勺采采